환경 수질 시료로부터 거대 바이러스의 아메바 기반 농축

기아 배지(starvation medium)에서 배양된 아메바가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 준비합니다.

기아 배지는 항생제와 항진균제를 포함하고 있어, 아메바가 증식하거나 휴면 포자를 형성하지 않고 생존 가능한 상태를 유지하는 동안 미생물의 성장을 억제합니다.

환경수 샘플이 들어 있는 튜브를 가져와 볼텍싱하여 부유 물질과 잔해물로부터 바이러스를 방출시킵니다.

바이러스가 포함된 수질 시료를 아메바에 첨가합니다.

증발을 방지하기 위해 젖은 압축 솜과 함께 플레이트를 봉투에 넣고 배양합니다.

배양 과정 동안, 아메바는 식세포 작용을 통해 거대 바이러스를 섭취합니다.

바이러스가 내부로 진입하면, 바이러스는 자신의 게놈을 아메바의 세포질로 방출합니다.

바이러스 게놈 주변에 세포질 바이러스 공장이 형성되며, 이곳에서 숙주 기작을 이용하여 복제하고 새로운 비리온으로 조립될 바이러스 단백질을 생성합니다.

이로 인해 아메바 세포가 둥글게 변하며 용해되고, 새로운 비리온이 배지로 방출되어 하위 검출 단계에서 거대 바이러스가 농축됩니다.

텍스트 프로토콜에 따라 오염된 물 샘플을 수집한 후, 아메바를 30 ml의 protease peptone yeast extract glucose(PYG 배지)가 담긴 75 cm² 세포 배양 플라스크에 넣고 28 °C에서 48시간 동안 배양하여 숙주 세포인 V. vermiformis를 준비합니다. 카운팅 슬라이드를 사용하여 아메바 수를 측정하고, 농도가 5 x 10⁵ ~ 10⁶ cells/ml에 도달하면 720 x g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고, 30 ml의 멸균된 Page's amoebal saline(PAS)을 사용하여 아메바 펠릿을 재부유시킵니다. 펠릿을 두 번째로 세척한 후, 항생제와 항진균제가 포함된 굶주림 배지(starvation medium) 30 ml를 사용하여 세포를 약 10⁶ amoeba/ml 농도로 재부유시킵니다. 굶주림 배지는 아메바가 포자 형성이나 증식 없이 생존할 수 있도록 합니다.

다음으로, 96-well flat bottom plate의 웰에 200 µL의 아메바를 분주하고 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 실온에서 수질 샘플을 1분 동안 vortexing한 뒤, 각 샘플 25 µL를 아메바 세포에 접종하며, 이때 두 개의 웰은 샘플을 접종하지 않고 음성 대조군으로 남겨둡니다. 증발을 방지하기 위해 primo-culture가 담긴