형광 현미경을 이용한 감염성 C형 간염 바이러스의 정량 분석

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus)가 포함된 포유류 세포 배양 상층액으로 시작합니다.

성장 배지를 사용하여 바이러스 현탁액을 단계별로 희석합니다.

각 희석액을 간암 세포 단층에 접종하고 배양합니다.

바이러스가 세포 내로 진입하여 게놈을 방출하고, 비구조 복제 단백질을 포함한 바이러스 단백질을 발현합니다.

이를 통해 새로운 바이러스 입자가 생성되어 출아하며 주변 세포를 감염시켜, 감염된 세포들의 초점(foci)을 형성합니다.

배양 후 배지를 제거하고 고정액을 첨가합니다. 저온에서 배양하여 세포를 고정하고 막을 투과화합니다.

세척 후 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 블로킹 버퍼를 첨가합니다.

비구조 복제 단백질에 결합하는 1차 항체를 처리합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

그런 다음, 1차 항체에 결합하는 형광체 접합 2차 항체를 처리합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 다시 세척합니다. 핵을 염색하기 위해 DNA 결합 염료를 추가합니다.

형광 현미경으로 관찰하고 형광 초점(foci)의 수를 정량화하여 상층액의 바이러스 농도를 결정합니다.

96-well 플레이트를 사용하여 naive Huh-7.5.1 세포를 웰당 약 3 x 10³ cells/well의 밀도로 분주합니다. 다음 날, 성장 배지를 사용하여 HCV RNA가 transfection된 세포에서 수확한 cell-free 배양 상청액을 10배 단계 희석하고, 이를 Huh-7.5.1 세포에 3반복으로 접종합니다. 감염 72시간 후, -20 ºC에서 30분 동안 methanol을 사용하여 세포를 고정합니다. 냉동고에서 세포를 꺼낸 후, 앞서 설명한 조건에 따라 HCV NS5A 단백질에 대해 면역 염색을 수행합니다. 형광 현미경을 사용하여 바이러스 희석 배수가 가장 높은 웰에서 NS5A 양성 세포 포커스(foci) 수를 세고, 밀리리터당 평균 focus forming unit(FFU) 수를 계산합니다.