바이러스 감염 세포의 전사 억제 시각화

우리딘 유사체(uridine analog)로 전처리된 포유류 세포가 부착된 커버슬립을 준비하며, 한 그룹은 바이러스에 감염시키고 다른 그룹은 감염시키지 않은 상태로 시작합니다.

바이러스에 감염된 세포에서는 바이러스 단백질이 숙주의 전사 기전에 결합하여 숙주의 RNA 생성을 억제하는 반면, 감염되지 않은 세포에서는 RNA 합성이 중단 없이 유지됩니다.

완충액으로 세척합니다. 세포를 고정하기 위해 파라포름알데히드를 첨가한 후 세척합니다. 세포막을 투과성으로 만들기 위해 계면활성제를 첨가한 후 세척합니다.

커버스립을 습윤 챔버로 옮깁니다.

형광 아지드, 촉매 및 환원제가 포함된 클릭 염색 용액을 첨가한 후 암실에서 배양합니다.

환원제는 촉매를 활성화하며, 이를 통해 형광 아지드가 uridine으로 표지된 신생 RNA에 결합할 수 있게 합니다.

커버슬립을 버퍼로 헹구고, 물에 담근 후, 과도한 수분을 제거합니다.

항퇴색 마운팅 용액(antifade mounting medium)을 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 마운팅하고 자연 건조시킵니다.

도립 형광 현미경 하에서, 비감염 세포와 비교하여 감염된 세포의 신호 강도가 감소한 것은 바이러스에 의해 유도된 전사 억제를 나타냅니다.

12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 12 mm 원형 커버슬립을 배치합니다. 그런 다음 1 mL의 완전 DMEM 배지에 293 세포를 분주합니다. 습도가 유지되는 배양기에서 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 설계에 따라, MP-12 감염 시 감염다중도(MOI)가 3이 되도록 바이러스 스톡을 희석하며, 이때 웰당 총 부피는 200 µL로 합니다. 한 웰은 비감염 대조군으로, 다른 한 웰은 전사 억제 대조군으로 지정합니다. 이제 성장 배지를 제거합니다. 바이러스 접종액을 첨가하고 습윤 배양기에서 1시간 동안 배양합니다. 접종액을 흡입하여 제거합니다. 웰당 1 mL의 신선한 성장 배지를 첨가하고 37 °C에서 배양합니다. 감염 후 15시간째에, 성장 배지를 1 mM의 유리딘 유사체인 5-ethynyl-uridine이 포함된 배지로 교체합니다. 모의 감염(mock infected)된 웰 중 하나에 DNA 의존성 RNA 합성 억제제인 actinomycin-D를 5 µg/mL 농도로 추가합니다. 세포를 다시 배양기에 넣습니다. 감염 후 16시간째에 배지를 제거하고 웰당 1 mL의 PBS로 커버슬립을 한 번 세척합니다. 웰당 1 mL의 4% 파라