유세포 분석법을 이용한 바이러스 유도 숙주 전사 억제 분석

포유류 세포 배양물을 준비합니다. 대조군은 감염시키지 않은 상태로 두고, 시험 배양군에 바이러스를 감염시킵니다.

바이러스 흡착을 진행한 후, 배지를 교체하십시오.

바이러스가 세포 내로 침투하여 게놈을 방출합니다. 바이러스는 숙주 전사 인자 복합체를 불안정하게 만들고 숙주 전사를 억제하는 독성 단백질을 발현합니다.

반면, 대조군 세포는 활발한 전사 상태를 유지합니다.

신생 RNA에 통합되는 뉴클레오시드 유사체를 첨가합니다.

세척된 세포를 수확합니다.

세포의 구조를 보존하기 위해 세포를 고정합니다. 세포를 원심 분리하고 완충액으로 세척합니다.

세포를 투과성 있게 만들기 위해 계면활성제를 첨가한 후 세척합니다.

신생 RNA를 표지하기 위해 뉴클레오사이드 유사체와 반응하는 화학적으로 변형된 형광 염료를 첨가한 후 세척하십시오.

면역염색을 수행하여 바이러스 항원을 형광 표지함으로써 감염된 세포를 표시합니다.

유세포 분석법을 사용하여 숙주 RNA 및 바이러스 항원 형광을 검출하십시오.

대조군과 실험군 집단 간의 RNA 형광 강도를 비교하십시오. 실험군 집단의 형광 강도가 낮게 이동하는 것은 RNA 형광의 감소를 나타내며, 이는 바이러스로 인한 전사 억제가 일어났음을 시사합니다.

실험 설계에 따라, 293 세포에 MOI 3으로 MP-12를 감염시킵니다. 배양액을 제거하고 희석된 바이러스 스톡을 첨가한 후, 37 °C, 5% CO₂ 조건의 습윤 배양기에서 1시간 동안 배양합니다. 접종액을 웰당 2 mL의 신선한 배양액으로 교체하고, 바이러스 표지와 수확에 최적화된 시간 동안 37 °C에서 배양합니다. 그런 다음 모의 감염(mock infected) 웰 중 하나에 배양액을 0.5 mM 5-ethynyl-uridine이 포함된 배양액으로 교체합니다. 또한 5 µg/mL actinomycin D를 첨가합니다. 세포를 배양기에 넣고 1시간 동안 배양합니다. PBS로 1회 세척한 후, 트립신화를 통해 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 1 mM EDTA가 포함된 PBS로 3회 세척합니다. 세포를 고정하기 위해 펠렛을 1 mL의 4% PFA에 재부유시키고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 튜브당 1 mL의 PBS-EDTA로 1회 세척합니다. 이어서 PBS에 0.2% Triton X-100이 포함된 용액 0.5 mL에서 실온으로 10분 동안 세포를 투과화합니다. nuclease-free PBS 1 mL로 1회 세척합니다. 클릭 반응을 위해 형광 염료가 포함된