유전자 전달을 위한 레트로바이러스 입자 생성

영양분이 풍부한 배지에서 배양된 인간 신장 상피 세포 배양물로 시작합니다.

혈청 간섭을 최소화하고 형질전환 효율을 높이기 위해 배지를 저혈청 배지로 교체합니다.

트랜스펙션 혼합물을 세포에 한 방울씩 첨가하십시오.

이 혼합물은 목적 유전자를 포함하는 레트로바이러스 DNA 컨스트럭트, 필수 바이러스 단백질을 공급하는 패키징 플라스미드, 그리고 트랜스펙션을 용이하게 하기 위해 플라스미드 DNA와 복합체를 형성하는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 포함합니다.

DNA 복합체가 흡수될 수 있도록 세포를 배양합니다.

잔류 형질전환 시약을 제거하기 위해 배지를 교체합니다.

세포 내부에서 플라스미드 DNA가 핵으로 들어가며, 이곳에서 바이러스 단백질과 목적 유전자를 운반하는 바이러스 RNA의 생성을 유도합니다.

이러한 구성 요소들은 조립되어 재조합 레트로바이러스 입자 형태로 배지로 방출됩니다.

바이러스가 포함된 배지를 수집하고, 바이러스 안정성을 유지하기 위해 저온에서 잠시 보관하십시오.

원심분리하여 세포 잔해물을 침전시킵니다.

바이러스 상청액을 분주하고, 액체 질소로 급속 냉동하여 저온 보관함으로써 추후 유전자 전달 실험에 사용하십시오.

16 cm 페트리 접시에 10% fetal bovine serum이 첨가된 18 mL DMEM 배지에서 Bosc23 세포의 단일 세포 현탁액을 분주합니다. 세포 밀도가 80%에 도달할 때까지 약 24시간 동안 배양합니다. 그 다음 MSCV 레트로바이러스 컨스트럭트, PCL-echo 패키징 벡터, polyethylenimine, 그리고 항생제가 없는 저혈청 배지를 혼합합니다. 이 혼합물을 Flowbox 내 실온에서 20분 동안 인큐베이션합니다. 이후 Bosc23 세포 배양액을 37 °C로 예열된 2% fetal bovine serum 첨가 DMEM 배지 16 mL로 조심스럽게 교체합니다. 다음으로, 레트로바이러스 혼합물을 Bosc23 세포에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다. 그 후 배양물을 37 °C에서 4시간 동안 인큐베이션합니다.

배양이 끝나면 Bosc23 배양 배지를 흡입하여 제거하고, 10% fetal bovine serum이 포함된 37 °C로 예열된 DMEM 배지 18 mL를 추가합니다. 세포를 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 25 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 Bosc23 배지를 50 mL 코니컬 튜브에 채취합니다. 튜브를 4 °C에서 보관합니다. 그런 다음