T7 발현 시스템을 이용한 GFP 표지 재조합 호흡기 세포융합 바이러스의 생성

RSV 복제 및 전사 단백질을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드와 GFP를 발현하는 전체 길이 RSV 안티게놈 cDNA를 포함하는 별도의 플라스미드가 혼합된 플라스미드 혼합물로 시작합니다.

각 플라스미드는 T7 프로모터의 제어 하에 배치됩니다.

리포좀 기반의 transfection 시약을 첨가하고 복합체가 형성되도록 배양합니다.

이 복합체들을 T7 RNA polymerase를 발현하도록 유전적으로 조작된 햄스터 신장 세포에 도입하고 배양합니다.

플라스미드 복합체가 세포 내로 진입하면, T7 RNA polymerase가 RSV 플라스미드를 전사합니다.

이를 통해 복제 및 전사 단백질을 인코딩하는 바이러스 mRNA가 생성되며, 양성 가닥 RSV 항게놈 RNA가 생성됩니다.

이러한 mRNA들은 숙주 세포의 기전을 이용하여, 기능적인 RSV 중합효소 복합체를 형성하는 바이러스 복제 및 전사 단백질을 생성합니다.

그 후 RSV polymerase complex가 양성 가닥 RNA를 바이러스 게놈 RNA로 전환합니다.

이 게놈 RNA는 구조 단백질과 GFP를 인코딩하는 바이러스 mRNA의 합성을 유도합니다.

형광 현미경 하에서 녹색 형광이 관찰되면 바이러스 유전자 발현과 재조합 RSV 생성의 시작이 확인된 것입니다.

트랜스펙션 전날, BSR-T7/5 세포를 완전 배지에서 0.5 million cells/mL 농도로 현탁합니다. 6-well 플레이트의 웰당 2 mL의 세포 현탁액을 분주합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하여 다음 날 세포 밀도가 80-90% confluence에 도달하도록 합니다. 각 바이러스를 구출(rescue)하기 위해, 먼저 해동된 역유전학 벡터들을 튜브에 혼합한 후, 트랜스펙션 시약 제조사의 프로토콜에 따라 트랜스펙션을 진행합니다. 그다음, 혼합된 벡터에 250 µL의 저혈청 배지를 첨가합니다.

다른 튜브에 이 transfection 시약 10 µL를 reduced-serum medium 250 µL에 희석합니다. 두 튜브를 모두 가볍게 vortexing하고 5분 동안 기다립니다. 두 튜브의 내용물을 혼합하고 상온에서 20분 동안 기다립니다.

그동안 BSR-T7/5 세포를 1 mL의 reduced serum medium으로 헹구고, 항생제가 포함되지 않은 10% fetal calf serum이 첨가된 minimum essential media 1.5 mL를 웰당 분주합니다. 필요한 경우 37 °C, 5%