감염성 호흡기 세포융합 바이러스 정량을 위한 플라크 역가 측정법

호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 현탁액을 단계별로 희석합니다.

RSV 감수성 포유류 세포가 분주된 멀티웰 플레이트의 각 웰에 희석액을 접종합니다.

바이러스가 세포 표면 수용체에 결합하고, 막 융합을 매개하여 세포질 내로 게놈을 방출할 수 있도록 배양합니다.

다음으로, 바이러스의 확산을 제한하기 위해 반고체 오버레이 배지를 도포하고 배양합니다.

감염된 세포는 세포 간 융합을 매개하는 바이러스 융합 단백질을 발현하며, 이는 싱크리티아(syncytia)라고 불리는 다핵 구조를 형성합니다.

바이러스 복제가 진행됨에 따라, 이러한 세포융합체(syncytia)는 퇴행하며 플라크(plaque)라고 알려진 투명한 구역을 형성합니다.

플레이트를 부드럽게 흔들어 오버레이를 제거하고, 세포를 헹구어 잔해물을 없앱니다.

생존 세포를 염색하고 플라크는 염색되지 않도록 염색약을 처리합니다.

염색약을 제거하고, 표백제로 플레이트를 오염 제거한 후 물로 헹굽니다.

플레이트를 공기 중에서 건조시킵니다.

명확한 플라크가 형성된 웰을 선택하고 이를 계수하여 바이러스 역가를 결정합니다.

플라크 적정법을 수행하려면, 먼저 시판되는 10X MEM을 멸균수로 희석하고 L-glutamine, 밀리리터당 1,000 units의 penicillin, 그리고 밀리리터당 1mg의 streptomycin을 첨가하여 2X 최소 필수 배지(minimum essential medium)를 제조합니다. 희석액을 강하게 흔들어 섞은 후 4°C에서 보관하고, 6개의 튜브에 FCS가 포함되지 않은 MEM 900µL를 각각 넣습니다. 바이러스 분주액(aliquots)을 해동하고 5초 동안 강하게 볼텍싱합니다.

단계 희석액을 제조하려면, 먼저 첫 번째 튜브에 들어있는 900 µL의 배지에 바이러스 100 µL를 첨가합니다. 튜브 캡을 닫고 몇 초간 볼텍싱하여 내용물을 혼합합니다. 그 다음, 첫 번째 희석액 100 µL를 두 번째 튜브의 배지 900 µL에 첨가합니다. 튜브 캡을 닫고 볼텍싱합니다. 이 과정을 여섯 번째 튜브까지 반복합니다. HEp-2 12-well 플레이트에 바이러스 이름과 전체 희석 배수를 기입합니다. 염색 과정 중에 플레이트와 커버가 분리될 수 있으므로, 서로 일치하도록 표시를 해 둡니다.

플레이트에서 배지를 제거하고 웰당 한 가지 희석액 400 microliters를 분주합니다. 바이러스 흡착을 위해 플레이트를 37 degrees Celsius에서 2시간 동안 배양합니다. 바이