방사성 동위원소 표지 역전사 효소 분석법을 이용한 바이러스 복제 능력 평가

시험 HIV-1 변이체 또는 야생형 대조군에 감염된 숙주 세포에서 방출된 자손 비리온을 포함하는 배양 상층액을 준비합니다.

시험 바이러스는 복제 효율을 변화시키고 자손 비리온 생성에 영향을 미치는 유전자 변이체를 보유하고 있습니다.

방사성 표지 뉴클레오타이드, 비표지 뉴클레오타이드, RNA 템플릿, 프라이머, 보조인자, 계면활성제 및 안정제가 포함된 역전사 혼합물에 상층액을 추가합니다.

계면활성제가 비리온을 용해시켜 역전사 효소(RT)를 방출시키는 동안, 템플릿-프라이머 복합체가 형성될 수 있도록 배양합니다.

RT는 템플릿-프라이머 복합체로부터 DNA를 합성하며, 이 과정에서 방사성 표지된 뉴클레오타이드를 통합합니다.

샘플을 핵산 결합 막으로 옮기고 공기 중에서 건조하여 방사성 표지된 DNA를 고정합니다.

결합되지 않은 성분들을 제거하기 위해 버퍼와 에탄올을 사용하여 교반하며 반복적으로 세척합니다.

멤브레인을 공기 중에서 건조시킨 후 랩으로 감쌉니다. 이를 방사선 감응 스크린에 노출시키고 포스포이미저(phosphorimager)를 사용하여 신호를 검출합니다.

시험군에서 신호가 감소한 것은 RT 수준이 낮음을 나타내며, 이는 대조군과 비교하여 비리온 생성이 감소했음을 반영합니다.

이 절차에서는, RT 마스터 믹스의 각 1 ml 분주액에 10 mCi/ml dTTP 1-2 µl와 1 M dithiothreitol 4 µl를 첨가합니다. RT 마스터 믹스, DTT 및 dTTP가 들어 있는 각 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브를 1,000 µl 피펫으로 조심스럽게 혼합한 후 멸균 트러프로 옮깁니다.

다음으로, 라벨링된 RT 믹스 25 µL를 96-웰 박벽 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. RT 마스터 믹스가 포함된 PCR 플레이트에 각 상층액 5 µL를 추가합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 접착성 포일 커버로 밀봉하고 써모사이클러에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 200 µL 멀티채널 피펫을 사용하여 포일 커버에 작은 구멍을 냅니다. 샘플을 5회 혼합합니다. 각 샘플 5 µL를 DE-81 종이에 옮기고 모든 샘플을 10분 동안 공기 건조시킵니다. 블롯을 각각 별도의 세척 용기에 넣습니다. 이어서 블롯을 1x SSC로 5회 세척합니다. 그 다음 90% 에탄올로 회당 5분씩 2회 세척한 후 공기 건조시킵니다. 건조가 완료되면 블롯을 새란 랩으로 조심스럽게 감싸고, 밀봉된 카세트 내의 인광 스크린에 넣고 실온에서 하