루시퍼레이즈 기반 바이러스 정량을 위한 시료 준비

유전적으로 변형된 바이러스에 감염된 상피세포가 담긴 멀티웰 플레이트를 준비하여 시작합니다.

이 바이러스는 루시페라아제 효소를 인코딩하는 트랜스진을 운반합니다.

흰색 벽의 멀티웰 플레이트에 배양한 신선한 상피세포 배양물을 준비합니다.

바이러스 농도를 알지 못하는 상청액을 백색 벽 웰(white-walled wells)로 옮깁니다.

동시에, 표준물질로서 알려진 농도의 바이러스를 첨가합니다.

바이러스 입자와 숙주 세포 표면 수용체 사이의 밀접한 접촉을 촉진하기 위해 플레이트를 원심 분리한 후 배양합니다.

바이러스가 숙주 세포로 진입하여 음성 가닥 RNA 게놈을 전달합니다.

그 후 바이러스 RNA 중합효소가 게놈을 mRNA로 전사합니다.

숙주의 세포 기전을 이용하여, mRNA는 루시퍼레이즈를 포함한 바이러스 단백질로 번역됩니다.

숙주 세포 내에 축적되는 루시퍼레이스의 양은 바이러스 농도가 증가함에 따라 증가합니다.

이제 루시퍼레이스 분석법을 사용하여 바이러스 농도를 추가로 추정할 준비가 된 샘플입니다.

Vero 세포로 옮긴 후의 최종 ml당 플라크 형성 단위(plaque forming units) 농도가 다음과 같도록 무혈청 DMEM에서 VSV-Delta-51의 표준 곡선을 준비합니다. Vero 세포 플레이트당 각 농도별로 50 µL씩 준비하고, 여기에 10%의 여유분을 추가합니다. 표준 곡선은 96-deep well 플레이트에 옮겨 담을 수 있습니다. 다음으로, 투명 바닥 96-well 플레이트에 분주된 Vero 세포를 광학 현미경으로 관찰하여 단일층이 최소 95% 밀집(confluent)되었는지 확인합니다. 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 샘플 상층액 25 µL를 흰색 벽 플레이트에 분주된 Vero 세포에 옮기고, 지정된 두 열의 Vero 세포에는 준비된 표준 곡선의 각 희석액 25 µL를 추가합니다. 플레이트를 상온에서 430 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 습윤한 5% CO2 인큐베이터에서 37 °C로 5시간 동안 배양합니다.