렌티바이러스 감염 마우스 배아줄기세포 생성

항생제 내성 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 시작하십시오.

원심분리하여 부유물을 분리합니다. 바이러스가 포함된 상층액을 수집하고 계면활성제가 없는 멤브레인으로 여과합니다.

이를 통해 오염물질은 제거하면서 렌티바이러스는 통과시킬 수 있습니다.

바이러스를 농축하기 위해 초원심분리합니다. 상층액을 제거하고 버퍼를 추가하여 바이러스를 재현탁합니다.

그 후 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 볼텍싱합니다.

원심분리하여 기포를 제거합니다. 그런 다음, 마우스 배아줄기세포가 포함된 감염 배지에 바이러스를 첨가하고 혼합합니다.

바이러스와 세포의 접촉을 강화하기 위해 원심분리한 후 배양합니다.

바이러스가 세포 내로 자신의 게놈을 전달합니다.

배지를 제거하고, 새 배지를 추가한 후 배양합니다.

바이러스 게놈이 DNA로 전환되어 숙주 게놈에 통합되면, 항생제 내성 단백질의 합성을 지시하는 mRNA의 생산이 가능해집니다.

배지를 선택 항생제가 보충된 신선한 배지로 교체하고 배양합니다.

항생제 내성 단백질을 발현하는 세포들은 생존하며, 그 결과 안정적으로 바이러스가 감염된 세포들이 얻어집니다.

혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

감염 하루 전, 이전에 준비한 mESC를 웰당 100,000 cells가 되도록 12-well 플레이트에 계대 배양합니다. 10-cm 포맷으로 배양한 세포의 경우, 기존 배지를 흡입하여 제거하고 5 mL의 1X PBS를 첨가한 후, 다시 PBS를 흡입하여 제거하고 1 mL의 0.25% trypsin을 첨가합니다. 37 °C에서 8분 동안 trypsin 처리하며, 배양 중간에 플레이트를 흔들고 두드려 줍니다.

배지를 교체하고 48시간 후에, 293T-HEK 세포의 상층액을 제거하여 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 부스러기를 침전시키기 위해 상층액을 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그다음, 상층액을 0.45 µm 멤브레인으로 여과합니다. SW32 로터가 장착된 초원심분리기를 사용하여 바이러스를 농축하며, 4 °C에서 72,000 ×g로 2.5시간 동안 회전시킵니다. 초원심분리기로 바이러스를 농축하는 동안, 12-well 플레이트에 있는 CiA mESC를 5 µg/mL의 polybrene이 함유된 신선한 배아줄기세포(ES) 배지로 처리합니다. 바이러스 농축이 완료되면, 상층액을 조심스럽게 흡입하고 바이러스 펠릿을 100 µL의 1X PBS에 조심스럽게 현탁하여 과도한 기포가 생기