JoVE 실험 백과사전
미생물학
0 조회수 • 2:53 분 • September 30th, 2026
백시니아 바이러스(vaccinia virus)에 감염되고 재조합 플라스미드 벡터가 트랜스펙션된 상피세포로 시작합니다.
해당 벡터는 바이러스 프로모터 하에 녹색 형광 표지된 표적 유전자와 적색 형광 표지된 대사 선택 유전자를 운반합니다.
바이러스 DNA 복제 과정 중에 플라스미드 카세트가 바이러스 게놈에 삽입됩니다.
무혈청 배지에서 세포를 수집합니다.
동결-융해 사이클을 사용하여 세포를 용해하고 바이러스를 방출합니다.
용해물의 단계 희석액을 준비합니다.
희석된 용해물을 신선한 상피 세포에 감염시켜 각각 분리된 개별 플라크를 형성합니다.
세포 생존을 위한 혈청 포함 배지와 대사 선택 시약을 첨가한 후 배양합니다.
선택 시약은 뉴클레오타이드 합성에 관여하는 효소를 억제합니다. 대사 선택 유전자를 보유한 감염 세포만이 뉴클레오타이드 합성을 가능하게 하는 대체 효소를 발현하여 생존할 수 있습니다.
배지를 제거하고 형광 현미경으로 관찰합니다.
플라크에서 적색 및 녹색 형광이 모두 나타나는 것은 카세트 통합과 표적 유전자의 발현이 성공적으로 이루어졌음을 보여줍니다.
무혈청 배지에서 BS-C-1 세포 단층에 백시니아 바이러스를 감염시킵니다.
감염 1시간 후, Dulbecco's modified eagle medium으로 세포를 회복시킨다. 무혈청 배지에서 재조합 벡터 플라스미드와 트랜스펙션 시약을 3:1 비율로 혼합하여 트랜스펙션한다. 24시간 후, 소태아혈청(FBS)이 포함되지 않은 DMEM에서 세포를 긁어 회수한다. 세포를 3회 동결-해동 반복하여 세포를 파쇄하고 바이러스 입자를 방출시킨다. 다음으로 개별 플라크의 충분한 분리를 위해, 100% 합쳐진 BS-C-1 세포 단층에 바이러스 입자 조제물을 단계별로 희석하여 감염시킨다. 10% FBS와 DMEM 및 GPT 선택 시약이 포함된 액체 층을 덮고 24시간 동안 배양한다.
액체 오버레이를 흡입 제거하고, 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터의 mCherry가 바이러스에 삽입됨에 따라 나타나는 확산성 적색 형광을 띠는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자와 선택한 형광 태그에 따라, 동일한 적색 플라크 내에서 태그 유전자의 국소적 형광이 관찰될 수도 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요