암세포 내 아데노바이러스 도입 및 siRNA 매개 넉다운의 병용 수행

내인성 표적 단백질을 발현하는 인간 암 세포 배양물을 준비하고 배지를 제거합니다.

형광 표지된 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 현탁액을 준비합니다.

바이러스와 세포 표면이 밀접하게 접촉할 수 있도록 소량의 바이러스 현탁액을 세포에 첨가합니다.

바이러스가 부착될 수 있도록 가끔 흔들어주며 배양합니다.

배양액에 추가 배지를 첨가합니다.

다음으로, 내인성 표적 단백질의 mRNA를 표적하기 위해 siRNA-인산칼슘 복합체를 도입하고 배양합니다.

인산칼슘은 siRNA의 흡수를 촉진하며, siRNA는 RISC로 로딩됩니다.

이후 siRNA–RISC 복합체가 표적 mRNA에 결합하여 이를 절단함으로써 단백질 발현을 억제합니다.

동시에, 아데노바이러스가 세포 내로 진입하여 DNA를 방출하며, 이 DNA는 형광 표지된 표적 단백질의 발현을 유도합니다.

이를 통해 내인성 표적 단백질을 고갈시키는 동시에 형광 표지 단백질로 대체할 수 있습니다.

완충액으로 세포를 세척한 후, 형광 이미징을 수행하여 표적 단백질을 분석합니다.

각 조건에 맞게 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 붙이고, 따뜻하게 데운 alpha MEM minus 400 microliters를 넣습니다. 얼음 위에서 바이러스 분주액을 천천히 해동한 후, 각 바이러스의 필요한 부피를 튜브에 넣고 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 그다음, 세포에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 바이러스 혼합액을 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다. 세포를 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다. 1시간 동안 15분마다 멸균 후드 내에서 플레이트를 조심스럽게 흔들어 바이러스가 세포 전체에 닿게 합니다. 적은 양의 배지를 사용하는 것은 바이러스와 세포의 접촉을 용이하게 합니다.

배양 후, 각 플레이트에 alpha MEM minus 1.6 milliliters를 조심스럽게 피펫팅하여 총 부피를 2 milliliters로 맞춥니다. 그동안 마이크로튜브에 멸균수 139 microliters, 1 molar 염화칼슘 50 microliters, 20 micromolar siRNA 11 microliters를 넣어 siRNA transfection 혼합액을 준비합니다. siRNA가 필요하지 않은 경우에는 siRNA 양만큼 멸균수로 대체하여 empty transfection을 수행합니다. 염화칼슘 siRNA 혼합액에 HBSS-