설계된 바이러스 유사 입자의 표면 노출 시스테인 잔기 표지

감염된 담배 잎에서 정제한 돌연변이 바이러스 유사 입자(VLP) 현탁액으로 시작합니다.

변이체 VLP는 바이러스 외피 단백질의 특정 위치에 유전적으로 삽입된 시스테인 잔기를 포함하고 있습니다.

말레이미드-접합 형광 염료를 첨가하고, 혼합물을 암소에서 배양합니다.

말레이미드는 VLP 표면에 노출된 시스테인 잔기에만 결합하며, 단백질 구조 내부에 매몰된 시스테인은 접근이 불가능하여 라벨링되지 않은 상태로 남습니다.

반응하지 않은 염료를 차단하고 비특이적 표지를 방지하기 위해 환원제를 첨가하십시오.

다공성 수지가 충전된 탈염 컬럼에 시료를 로딩한 후, 원심분리하여 라벨링된 VLP를 정제합니다.

반응하지 않은 염료와 환원제는 다공성 수지 비드 내부로 확산되어 유지되는 반면, 크기가 더 큰 VLP는 기공에서 배제되어 먼저 용출됩니다.

형광 표지된 VLP는 이제 젤 전기영동을 사용하여 분석할 수 있습니다.

겔 상의 형광 밴드는 표면에 시스테인 잔기가 노출된 표지된 돌연변이체를 나타냅니다.

MRFV 야생형 및 cys-변이 외피 단백질(CP) 유전자를 포함하는 Potato virus X(PVX) 기반 벡터 플라스미드로부터 Capped T7-RNA 전사체를 생성한 후, 각각 10 µL씩 두 개의 분주액을 사용하여 N. benthamiana 잎 두 장에 접종합니다. 식물을 온실 내 습도 60% 조건에서 25 °C의 광주기 16시간 및 20 °C의 암주기 8시간으로 10일 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 바이러스에 감염된 잎을 수확하여 식물 조직의 무게를 측정하고 얼음 위에 둡니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제한 후, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0), 1 mM EDTA 내에 1 mM Fluorescein-5-maleimide 용액을 준비합니다. 볼텍싱하여 완전히 용해시키고 알루미늄 호일을 사용하여 용액을 빛으로부터 차단합니다. 1 µg/µL 농도의 VLP 약 30 µL와 Fluorescein-5-maleimide 60 µL를 혼합하고 실온에서 2시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. DTT를 최종 농도 50 mM이 되도록 첨가하여 반응을 종결시킵니다. 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 반응하지 않은 fluorescein을 제거합니다. 가교 결합이 가능한 cysteine 잔기가 있는 VLP를 시각화하기 위해, 각 반응액 10 µL에 2x 샘플 버퍼 10 µL를 첨가하여 SDS-PA