엔지니어링된 E. coli에서의 바이러스 유사 입자 생산

발현 플라스미드와 함께 lac 오퍼레이터로 조절되는 T7 폴리머라제 유전자를 보유한 조작된 E. coli 세포의 스타터 배양이 들어 있는 튜브를 준비합니다.

해당 플라스미드는 박테리오파지 Qβ 유래의 외피 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하고 있습니다.

이 유전자는 T7 프로모터와 lac 오퍼레이터에 의해 조절됩니다.

배양액을 배지가 들어 있는 플라스크로 옮깁니다.

박테리아의 성장을 촉진하기 위해 흔들어 배양합니다.

lac 억제제를 불활성화시켜 T7 폴리머라제 발현을 유도하는 알로락토스(allolactose)의 합성 유사체를 첨가합니다.

그 후 T7 polymerase가 플라스미드의 T7 promoter에 결합하여 외피 단백질 유전자를 전사하며, 이는 번역되어 외피 단백질을 생성합니다.

이러한 외피 단백질들은 자가 조립되어 비감염성 지지체를 형성하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 생성합니다.

배양액을 원심분리용 병으로 옮깁니다.

원심분리하여 세포 펠릿을 형성한다.

상층액을 버리고 펠렛을 튜브로 옮깁니다.

세포 내 VLP가 포함된 세포 펠렛이 정제 준비되었습니다.

Q-Beta 박테리오파지 발현 절차를 시작하기 전에, 1:1 표백제:에탄올 용액으로 벤치 구역을 닦아냅니다. 무균 환경에서 E.coli BL21의 단일 콜로니를 SOB 배지에 추가하여 3 mL 스타터 배양액 두 개를 만듭니다. 배양액을 37 °C 및 0% 상대 습도실에서 250 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 두 개의 3 mL 스타터 배양액을 진탕기에서 꺼내어 무균 환경에서 각각 1 L의 신선한 SOB 배지가 담긴 2 L 배플 에를렌마이어 플라스크에 붓습니다. 접종된 배지가 담긴 두 플라스크를 37 °C 및 0% 상대 습도실의 진탕기에 250 rpm으로 배치합니다. 박테리아를 600 nm에서의 광학 밀도(OD 600)가 0.9에서 1.0에 도달할 때까지 배양합니다. 이 과정은 보통 약 5시간이 소요됩니다. 배양액이 원하는 OD 600에 도달하면, P1000 피펫을 사용하여 각 플라스크에 1 M IPTG 1 mL를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 플라스크를 온실 내 진탕기에 두고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 셰이커에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크의 내용물을 1L 병으로 옮기고, 4 °C에서 20,621 × g로 1시간 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 원심분리가 완료되면, 박테리아를 사멸시키기 위해 약 5 mL의 표백제가 들어 있는 플