이황화 결합 재가교를 통한 바이러스 유사 입자의 형광 기능화

캡시드 표면에 이황화 결합이 노출된 바이러스 유사 입자(VLP)를 준비합니다.

디설파이드 결합을 절단하여 캡시드 구조를 유지하면서 유리 티올기를 생성하기 위해 환원제를 첨가합니다.

티올(thiol)의 재산화를 방지하기 위해, 환원된 VLP를 티올 반응성 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG 링커와 결합시키십시오.

PEG 링커는 두 개의 공유 결합을 형성하여 각 티올 쌍을 다시 연결합니다.

이러한 공유 결합 접합은 또한 UV 조사 하에서 밝은 노란색으로 나타나는 형광 구조를 형성합니다.

완전한 접합이 이루어질 수 있도록 혼합물을 장시간 동안 회전시킵니다.

원심 분리를 통해 반응하지 않은 소분자를 제거함으로써, 온전한 접합체를 유지한 채 PEG화된 VLP를 정제합니다.

형광성 외피 단백질 밴드로 나타나는 PEG 결합을 확인하기 위해 비환원 SDS-PAGE를 수행하십시오.

native agarose gel electrophoresis를 사용하여 구조적 무결성을 평가하며, PEG화된 VLP와 비PEG화된 VLP의 밴드가 유사하게 나타나면 온전한 VLP가 존재함을 확인하는 것입니다.

이 프로토콜을 통해 이미징 또는 표적 전달 응용 분야에 적합한 형광 PEG 기능화 VLP를 제작할 수 있습니다.

이 도식은 시연될 접합 과정을 보여줍니다. 1 mg의 Q-Beta에 포함된 이황화물 대비 10 당량의 Tris(2-carboxyethyl)phosphine 또는 TCEP를 사용하여, 상온에서 1시간 동안 모든 이황화물을 환원시켜 환원된 Q-Beta 캡시드를 생성합니다. Q-Beta의 이황화물을 환원하기 직전에 TCEP 용액을 신선하게 준비하십시오.

0.002 g의 TCEP를 1 mL의 초순수에 녹여 100X 스톡 용액을 제조합니다. 5 mg/mL Q-Beta 200 µL를 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 100X TCEP 스톡 용액 20 µL를 해당 마이크로원심분리 튜브에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그동안, 환원된 이황화 결합을 다시 연결하는 이후 반응을 위해 디브로모말레이미드 폴리에틸렌 글리콜(DB-PEG) 용액을 준비합니다. 0.0017 g의 DB-PEG를 100 µL의 dimethylformamide에 녹입니다. pH 5의 10 mM sodium phosphate 용액 680 µL를 추가합니다. 다음으로, 환원된 Qβ를 DB-PEG 용액에 넣고 휴대용 365 nm UV 램프 아래에서 혼합 과정을 관찰합니다. 혼합 시,