박테리아 인공 염색체 유래 합성 RNA가 형질전환된 세포로부터의 감염성 비리온 복구

부착성 바이러스 허용 세포 단층으로 시작하십시오.

세포를 세척한 다음, 세포를 분리하기 위해 해리제를 첨가합니다.

원심분리 후 상층액을 제거합니다. 잔류 배지를 제거하기 위해 세포를 세척합니다.

세포를 완충 식염수에 재현탁한 후, 세포를 큐벳으로 옮깁니다.

박테리아 인공 염색체(BAC)에 담긴 전장 일본뇌염 바이러스(JEV) cDNA 클론으로부터 전사된 RNA를 도입합니다.

전기 펄스를 가하여 세포막을 일시적으로 투과성으로 만들어 RNA가 진입할 수 있도록 합니다.

세포를 회복시킨 후, 배양 배지로 옮깁니다.

도입된 RNA는 천연 바이러스 RNA를 모방하여 새로운 비리온을 생성합니다.

세포를 단계별로 희석하여 신선한 세포 단층 위에 도말합니다.

비리온이 주변 세포를 감염시킬 수 있도록 배양합니다.

아가로스 배지로 오버레이한 후 배양합니다. 배지가 반고체 층을 형성하여 바이러스가 인접 세포로 확산되는 것을 제한합니다.

감염된 세포가 용해되어 뚜렷한 플라크를 형성함으로써, 감염성 JEV의 성공적인 복구가 확인됩니다.

150 mm 배양 접시에 접시당 3 × 10⁶ cells의 밀도로 24시간 동안 배양한 BHK-21 세포를 준비합니다. 세포 단층을 차가운 Solution A로 헹군 다음, 트립신 처리를 통해 세포를 분리합니다. 270 × g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다.

그 후 세포를 50 ml의 차가운 solution A에 재부유시키고 다시 원심 분리합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다. 마지막 세척 후, 세포를 solution A에서 2 × 10⁷ cells/ml 밀도로 재부유시킵니다. 이어서 2 mm 큐벳에 세포 현탁액 400 µl 분주량과 2 µg의 합성 RNA를 혼합합니다.

최적의 조건에서 혼합물을 즉시 전기 천공하고 세포를 10분 동안 휴지시킵니다. 그런 다음 세포를 600 µL의 완전 배지가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이제 전기 천공된 세포를 1 mL 부피로 10배 연속 희석하여 준비합니다. 각 희석액의 100 µL 분주액을 정상 BHK-21 세포 단층 위에 분주합니다. 4~6시간 동안 배양한 후, FBS가 첨가된 MEM 내의 0.5% agarose를 세포 위에 덮고 4일 더 배양합니다.