투과전자현미경 분석을 위한 안전한 바이러스 시료 준비

생물안전작업대 내부에서, TEM 그리드가 들어있는 캡슐 속으로 전염성이 높은 바이러스 현탁액을 흡입합니다.

바이러스가 그리드 전체에 고르게 부착될 수 있도록 수평으로 배양합니다.

비결합 바이러스가 포함된 현탁액을 제거한 다음, 단백질을 가교결합하여 바이러스 구조를 보존하고 감염력을 감소시키는 고정액을 첨가합니다.

배양 후, 잔류 고정액을 제거하기 위해 세척합니다.

바이러스를 둘러싼 그리드에 결합하여 이미징 시 대비를 높여주는 전자 밀도가 높은 음성 염색액을 추가합니다.

피펫을 제거하고 그리드를 블로팅하여 과잉 염색액을 제거합니다.

캡슐을 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)에 적신 거름종이가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣고, 튜브를 밀봉한 후 증기 고정을 위해 배양합니다.

사산화오스뮴은 지질 막 구조를 안정화하고 이미징 대비를 향상시키며 바이러스를 완전히 불활성화하여, 생물안전격리 구역 외부로의 안전한 이동을 가능하게 합니다.

TEM 시설 내에서 그리드를 세척하고, 공기 중에서 건조시킨 후 이미징을 위해 보관하십시오.

이 방법은 바이러스 시료를 더 안전하게 취급할 수 있게 하며 시료 준비 과정을 간소화합니다.

먼저, 캡슐을 피펫에 부착합니다. 바이러스 현탁액 40 µL를 캡슐 안으로 흡입합니다. 그리드가 수평이 되도록 피펫을 옆으로 눕혀 10분 동안 둡니다. 다음으로, 피펫을 들어 바이러스 용액을 폐기물 용기에 배출합니다. 2% glutaraldehyde 고정액 40 µL를 캡슐 안으로 흡입합니다. 피펫을 옆으로 눕혀 20분 동안 둡니다. 그 후, 고정액을 배출하고 탈이온수 40 µL를 캡슐 안으로 흡입하여 고정액을 씻어냅니다. 이 세척 단계를 3회 반복합니다.

다음으로, 1% uranyl acetate 또는 1% potassium phosphotungstic acid 40 µL를 캡슐 안으로 흡입합니다. 캡슐을 30초 동안 그대로 둡니다. 그런 다음, 피펫에서 캡슐을 제거합니다.

그리드의 가장자리에 여과지를 대어 물기를 제거합니다. 여과지를 15 milliliters 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 여과지를 1% osmium tetroxide 용액에 담급니다.

뚜껑을 연 상태의 캡슐을 튜브에 넣습니다. 오스뮴 테트록사이드 증기가 완전히 침투할 수 있도록 튜브를 1시간 동안 밀봉합니다. 그 후, 튜브를 오염 제거하고 생물안전격리 구역 밖의 BSL-2 EM 시설로 옮깁니다.

원심 분리 튜브에서 캡슐을 제거한 후, 피