바이러스 뉴클레오캡시드 유사 입자의 인비트로(In Vitro) 재구성 및 정제

바이러스 특이적인, 재조합 발현된 RNA-free 뉴클레오단백질-인단백질 복합체로 시작하십시오.

복합체를 바이러스 특이적 RNA 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하여 뉴클레오캡시드 유사 입자의 조립을 유도합니다.

조립 과정에서 바이러스 RNA가 인산단백질 단편을 대체하며, 이를 통해 뉴클레오단백질이 RNA를 둘러싸 누클레오캡시드 유사 입자를 형성하게 됩니다.

침전물을 제거하기 위해 샘플을 원심분리합니다.

다공성 수지가 충전된, 미리 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 준비하고 상층액을 로딩합니다.

시료가 컬럼을 통해 흐르면서, 크기가 큰 뉴클레오캡시드 복합체는 기공에서 배제되어 먼저 용출됩니다.

중간 크기의 단백질 복합체와 작은 RNA 분자들은 구멍으로 들어가 나중에 용출됩니다.

용출액의 흡광도를 모니터링하여 뚜렷한 피크가 나타나는 용출 프로파일을 생성합니다.

첫 번째 피크는 조립된 뉴클레오캡시드를 나타내며, 이어서 더 작은 단백질 복합체와 유리 RNA가 나타납니다.

검증 및 추가 분석을 위해 뉴클레오캡시드 피크(nucleocapsid peak)에 해당하는 분획을 수집합니다.

바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 조립을 위해, 정제된 N0P 복합체와 RNA 올리고를 1:1.5 몰비로 혼합하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 소규모 정제용 젤 여과 컬럼을 버퍼 E로 미리 평형화하고, 원심분리를 통해 침전물을 제거합니다.

상층액을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로딩합니다. 단백질-RNA 조립 샘플과 단백질 단독 대조군 샘플의 크기 배제 크로마토그래피 이미지를 비교하고, 핵산 순도 비율을 결합하여 어떤 피크가 조립된 N-RNA, N0P 및 유리 RNA인지 식별합니다. N-RNA 복합체를 조립하려면 모든 N-RNA 피크 분획을 수집하고, RNA 추출을 수행한 뒤, urea-PAGE 겔을 전기영동하여 특정 RNA의 길이를 재확인합니다.