투과전자현미경을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자의 시각화

유리 슬라이드 위에 놓인 탄소 코팅 투과 전자 현미경 또는 TEM 그리드를 준비합니다.

슬라이드를 챔버 안에 넣고 글로우 방전을 처리하여 탄소 표면을 친수성으로 만들어 샘플이 균일하게 퍼지도록 합니다.

슬라이드를 제거하고, 핀셋으로 그리드를 잡은 다음 E형 간염 바이러스(HEV) 나노입자 현탁액을 도포합니다.

이 나노입자들은 재조합 HEV 캡시드 단백질로 구성되어 있으며, 핵산과 보조 바이러스 단백질은 포함하고 있지 않습니다.

나노입자가 그리드 표면에 흡착되도록 배양합니다. 그런 다음 여과지로 닦아내어 과잉 현탁액을 흡수시킵니다.

탈이온수로 그리드를 세척하여 흡착되지 않은 나노입자를 제거한 후, 다시 블로팅합니다.

Uranyl acetate 염색액을 첨가하고 짧게 배양합니다.

Uranyl acetate는 나노입자 주변에 전자 밀도가 높은 배경을 형성하여 TEM 이미징 시 대비를 향상시킵니다.

과잉 염색액을 닦아내고 그리드를 제습 챔버에 넣어 건조합니다.

TEM 하에서 HEV 나노입자는 바이러스 핵산을 포함하지 않는 균일하고 빈 정이십면체 구조로 나타납니다.

TEM 이미징을 위해 HEV 나노입자 시료를 10 mM MES, pH 6.2를 사용하여 0.5 ~ 2 mg/mL 농도로 희석합니다. 탄소 코팅 그리드를 40 mA 글로우 방전으로 30초 동안 이온화하여 친수성 탄소 표면을 생성합니다. 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30분 동안만 유지됩니다. 이온화 후, 핀셋으로 그리드를 잡고 HEV 나노입자 시료 2 µL를 그리드에 첨가합니다.

15~30초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 블로팅합니다. 그런 다음 즉시 2중 증류수로 그리드를 세척하고 필터 페이퍼로 다시 블로팅합니다. 즉시 2% uranyl acetate 2 µL를 그리드에 첨가합니다. 15초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 블로팅합니다. 샘플 그리드를 전자 제습 건조기에 넣고 하룻밤 동안 건조합니다.

샘플에 따라 구조 시각화 및 특성 분석을 위해 저온 전자 현미경 또는 cryo-EM이 필요할 수 있습니다. 그리드를 TEM으로 옮겨 10~80K 배율로 이미징합니다. HEV 나노입자는 바이러스 RNA가 없기 때문에 TEM 상에서 직경이 약 27 nanometers인 빈 정이십면체 단백질로 나타납니다.