바이러스 플라크 분석을 위한 액상 오버레이 시스템의 평가

상피 세포 단일층이 포함된 멀티웰 플레이트를 준비하고 각 웰에 바이러스 현탁액을 첨가합니다.

바이러스를 균일하게 분산시키기 위해 가끔씩 흔들어주며 배양합니다. 바이러스가 세포에 부착되어 내부로 침투합니다.

한 개의 웰에 용융된 agarose를 첨가하면, 이것이 응고되어 반고체 오버레이가 됩니다.

다른 웰에 미세결정성 셀룰로오스 기반의 점성 액체 오버레이를 추가하고 배양합니다. 이 오버레이의 점성은 반고체 오버레이와 유사하게 바이러스의 확산을 제한합니다.

세포 내부에서 바이러스는 자신의 게놈을 방출하고 새로운 바이러스 RNA와 단백질을 생성합니다.

새로운 바이러스가 조립되어 세포 밖으로 배출되며 세포 용해를 일으킵니다.

방출된 바이러스가 인접한 세포를 감염시켜 플라크를 형성합니다.

액체 오버레이를 흡입하여 제거하고 고정액을 첨가하여 용해되지 않은 세포를 보존합니다.

고정액을 버리고 아가로스 오버레이를 제거합니다.

생존 세포를 염색하고 플라크는 염색되지 않게 하는 염료를 첨가합니다. 그다음, 과량의 염료를 세척하여 제거합니다.

액체 오버레이는 반고체 오버레이와 유사한 플라크 수를 형성하며, 이는 플라크 분석에서 대안으로 사용할 수 있음을 뒷받침합니다.

플레이팅 다음 날, 분석을 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 세포의 합일도와 생존력을 확인하십시오. 세포가 표준적인 세포 형태를 보이고 합일도가 약 90%인지 확인하십시오.

세포 성장 배지를 사용하여 감염성 시료를 10배 단계 희석하며, 해당 바이러스의 예상 역가에 따라 필요한 희석 횟수를 조절합니다. 또한, 세포 생존력을 독립적으로 확인하고 플라크 식별을 돕기 위해 비감염 대조군 시료를 준비합니다. 단일층이 손상되지 않도록 주의하며, 비감염 대조군과 단계 희석액을 플레이트의 웰에 피펫으로 분주합니다.

세포를 충분히 덮을 수 있는 양의 접종액을 사용하되, 바이러스와 단층 세포의 접촉을 최대화하기 위해 부피를 가능한 한 낮게 유지하십시오. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣고 45분에서 1시간 동안 세포를 감염시킵니다. 20분마다 플레이트를 부드럽게 흔들어 접종액이 균일하게 덮이도록 하고 세포 단층이 마르는 것을 방지하십시오.

감염 과정 중에 액체 오버레이용 오버레이 작동 용액을 준비합니다. 가온된 플라크 배지와 상온의 1.2~2.4% Stock Avicel을 1:1 비율로 혼합하여 0.6~1.2% Avicel 오버레이 배지 작동 용액을 만듭니다. 아가로스 또는 CMC 오버레이의 경우,