C. 엘레간스 긍정적인 Butanone 학습, 단기 및 장기 연관 메모리 Assays

다음 실험의 전반적인 목적은 모델 생물인 C. elegans를 사용하여 음식과 화학적 유인제인 부탄 사이의 학습된 긍정적 연관성에 대한 단기 및 장기 기억을 테스트하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동기화된 영양 상태가 좋은 성체 초기 웜을 1시간 동안 굶깁니다.

다음으로, 단기 연합 기억을 위한 집중 조건화(mass conditioning)와 장기 연합 기억을 위한 간격 조건화(spaced conditioning)를 통해 먹이와 부탄올(butan-1-ol)이 공존하는 환경에서 벌레를 훈련시킵니다. 조건화 이후, 부탄올에 대한 화학주성을 측정하여 훈련 전의 화학주성과 비교합니다. 기억 유지 능력을 연구하기 위해 학습 지수의 변화를 기반으로 학습된 먹이-부탄올 연관성의 단기 및 장기 연합 기억 지속 시간을 나타내는 결과를 얻습니다.

이 방법은 정상적인 노화 및 신경퇴행성 질환 상태에서 뉴런 기능에 어떤 유전적 경로가 필요한지, 그리고 학습과 기억력을 어떻게 향상시킬 수 있는지와 같이 인지 노화 및 질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인지 장애 조건 하에서, Worms는 1 mL의 OP 50 e coli가 도말된 100 mm 고성장 배지 플레이트를 사용하여 표준 방법으로 준비합니다. 플레이트당 약 5,000마리 이하의 밀도로 젊은 성체 벌레를 사용하십시오.

플레이트에 M nine buffer를 조심스럽게 붓고 벌레들이 떨어지도록 살살 돌려 벌레를 수집합니다. 원치 않는 박테리아가 떨어져 나올 수 있으므로 자극을 최소화하십시오. 그런 다음, 플레이트를 기울여 모서리에서 buffer와 벌레 혼합물을 끌어올립니다.

P 1000 파이펫을 사용하여 벌레들을 15 mL 원심 분리관으로 옮깁니다. 플레이트에 벌레들이 남아 있는 경우, 벌레들이 관 벽에 부딪히지 않도록 주의하며 파이펫팅합니다.

이 단계를 1~2회 반복하십시오. 중력에 의해 벌레가 튜브 바닥으로 가라앉도록 둡니다. 최상의 결과를 위해 원심분리는 권장되지 않습니다.

침전이 완료되면 진공 흡입으로 상층액을 제거하고, M nine buffer 3~4 mL 이상으로 세척합니다. 이때 세포의 기아 상태를 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

이 단계에서, 나중에 시연될 화학주성 분석에서 대조군(naive group)으로 사용할 벌레 집단을 따로 떼어 놓습니다. 튜브에 M9 버퍼 3~4 mL를 추가하고 벌레를 실온에서 1시간 동안 굶깁니다. 500 µL의 OP50 E. coli가 접종된 60 mm NGM 플레이트 뚜껑 안쪽에 95% 에탄올에 희석된 10% 부탄 2 µL를 도말하여 컨디셔닝 플레이트를 준비합니다. 굶긴 벌레가 들어있는 튜브에서 상층액을 제거하고, P1000 피펫을 사용하여 각 컨디셔닝 플레이트에 벌레 100~200 µL를 옮깁니다. 컨디셔닝 후, 컨디셔닝 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

약 1 mL의 M9 완충액으로 플레이트에서 벌레를 씻어낸 후 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 완충액이 투명해질 때까지 이전에 시연한 부드러운 세척 방법을 반복합니다. 세척이 완료되면, 벌레의 일부를 분리하여 화학주성 분석(chemotaxis assay)으로 테스트함으로써, 추가 시간대를 나타내는 플레이트를 설정하기 위한 1배수 mast 연합 학습의 0시간 시점 그룹으로 사용할 수 있습니다.

100 내지 200 µL의 벌레를 파종된 60 mm NGM 플레이트로 옮깁니다. 이 조건 처리 후의 플레이트를 실온에서 0.5, 1 또는 2시간 동안 배양합니다. 각 시간대마다 플레이트에서 벌레를 15 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 세척하여 옮기며, 이 과정을 1~2회 더 반복합니다.

M9 버퍼를 사용하여 동일한 부드러운 세척 절차를 거친 후, 이후에 설명할 화학주성 분석(chemotaxis assay)을 통해 단기 연합 기억을 테스트합니다. 단기 훈련 단계에서 보여준 것과 동일하게 조건화 플레이트와 벌레를 준비하되, 벌레를 상온에서 30분 동안만 배양하십시오. 배양이 끝나면 이전에 설명한 방식대로 벌레를 수집하십시오.

이들을 파종되지 않은(UNSEEDED) 60 millimeter NGM 플레이트로 옮깁니다. 파종되지 않은 플레이트에서 실온으로 30분 동안 벌레를 굶깁니다. 벌레를 굶긴 후, M nine 버퍼로 세척하여 15 milliliter 원추형 튜브에 다시 넣습니다. 총 7회의 컨디셔닝 블록과 6회의 기아 블록이 완료될 때까지 이 단계를 반복합니다.

컨디셔닝이 완료되면, 컨디셔닝 플레이트에서 웜을 세척하여 원추형 튜브로 다시 옮깁니다. 앞서 보여준 것처럼, 컨디셔닝 직후에 7회 간격의 연합 학습을 테스트하기 위해 웜 코호트를 사용할 수 있습니다. 나머지 웜 집단은 1 mL의 OP 50이 도포된 100 mm HGM 플레이트로 옮깁니다.

다시, 개체군을 유지하기에 충분한 박테리아가 있도록 플레이트당 100 to 200 µL의 벌레를 분주합니다. 식품-부탄 인식 연관성에 대한 장기 연상 기억을 테스트하기 위해, 장기 연상 기억 시점인 16, 24 또는 40시간 동안 20 °C에서 컨디셔닝 후 플레이트를 배양합니다. 플레이트에서 벌레를 조심스럽게 씻어내어 15 mL 원뿔형 튜브에 담고, 각 시점 이후에 M9 버퍼로 1 to 2회 다시 세척한 다음, 화학 촉각 분석(chemo Texas assay)으로 벌레를 테스트합니다.

화학주성 분석 플레이트를 준비하려면, 여기 보이는 것처럼 고정되지 않은 100밀리미터 NGM 플레이트 바닥의 측면 부근 세 곳에 표시를 합니다. 유인제 및 대조군 지점에 1M sodium azide 1µL를 점적합니다. 마비제의 확산을 최소화하기 위해 분석 시작 전 15분 이내에 수행하십시오.

다음으로, 표시된 분석 플레이트의 해당 위치에 95% ethanol과 10% butone을 각각 1 µL씩 점적합니다. 이때 이전에 점적한 sodium azide 위에 적층하여 넣습니다. 침전된 벌레가 들어있는 튜브에서 M nine buffer를 가능한 한 많이 제거합니다.

프리컷 팁이 장착된 P 20 피펫을 사용하여, 분석 플레이트의 기점에 5 µL씩 세 번에 걸쳐 총 15 µL의 벌레 현탁액을 분주합니다. 그다음, 킴와이프(Kimwipe)의 모서리를 뾰족하게 말아 여분의 M9 버퍼를 흡수시킵니다. 이때 한천(agar)이 뚫리지 않도록 주의하십시오.

과량의 버퍼를 제거하여 벌레들을 분석 플레이트 위에 놓습니다. 이미징을 통해 벌레의 수를 세는 경우, 방출 직후 기점의 이미지를 촬영하여 분석 플레이트의 전체 개체 수를 확인합니다. 화학 택성 분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 에탄올 및 부톤 지점의 기점에 있는 벌레의 수와 분석 플레이트 상의 전체 벌레 수를 세어 줍니다.

일반적으로 sodium azide에 의해 마비된 벌레들은 점 주변 1cm 반경 내에 위치하며 일직선으로 뻗은 모습으로 나타납니다. 많은 개체들이 서로 겹쳐져 있는 경우, 벌레들을 직접 수작업으로 세거나 이미징 및 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 본 연구에서는 결과의 편의성과 신뢰성을 위해 후자의 방법을 선호합니다.

시작점의 에탄올 및 부톤 지점에 있는 벌레들의 수를 정량화한 후, 여기에서 보는 것처럼 KeyAx 지수를 계산합니다. 10% Butone에 반응하는 야생형 벌레의 전형적인 나이브 화학주성 지수는 약 0.2입니다. Mass 또는 spaced 훈련은 일반적으로 0시점의 화학주성 지수를 0.7에서 0.8까지 증가시켜, 약 0.6의 학습 지수를 나타냅니다.

초기 화학주성(Naive chemotaxis)은 벌레의 적절한 사육 상태에 매우 민감합니다. 이 그림은 충분히 먹이를 공급한 초기 벌레와 굶주린 초기 벌레 간의 CI(화학주성 지수)에서 나타나는 뚜렷한 차이를 보여주며, 적절한 기술의 중요성을 강조합니다. 기억 유지 능력은 야생형 동물에서 학습 지수가 0이 되었을 때 화학주성 지수가 초기 수준으로 돌아오는 데 걸리는 시간에 반영됩니다.

단기 연합 기억은 약 2시간 동안의 대량 훈련 후 1시간부터 감소하기 시작하며, 상대적으로 전사 인자인 Creb과는 무관합니다. 장기 연합 기억은 일반적으로 최대 40시간 동안의 공간 훈련 후 16시간이 지날 때까지는 유의미하게 감소하지 않으며, Creb 의존적입니다. 이 절차를 수행할 때 화학주성 분석은 굶주림이나 환경 내의 과도한 냄새에 의해 영향을 받을 수 있으며, 과도한 물리적 자극으로 인해 기억과 벌레가 손상될 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다.