여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

본 절차의 전반적인 목표는 다중 마우스 뇌 MRI를 사용하여 살아있거나 고정된 마우스로 고처리량 표현형 분석을 달성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 각 마우스를 마취시킵니다. 다음으로 생체 내(in vivo) 스캔을 위해, 각 마우스를 크기에 적합한 슬레드에 놓은 후 로딩 어레이에 장착하여 자석의 보어(bore) 내부로 위치시킵니다.

또는 ex vivo 이미징을 위해, 경심장 관류를 수행하고 두개골 구조를 분리하여 이미징 튜브에 넣은 뒤, 이를 마그넷 보어 내에 위치한 16채널 솔레노이드 코일 어레이에 배치합니다. 최종적으로 표현형 분석에 적합한 고품질의 뇌 이미지와 마우스 뇌의 주요 및 미세 구조를 보여주는 3차원 자기공명영상 볼륨을 얻을 수 있습니다. 조직학적 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 두개골 내에 표본의 전체 해부학적 구조를 보존하면서 뇌 전체 영역의 커버리지와 3차원 분석이 가능하다는 점입니다.

이 방법은 질병 마우스 모델에서 표현형을 나타내는 유전자와 해부학적 차이 사이의 관계와 같이 생의학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사용자는 고처리량 뇌 영상 촬영에 필요한 맞춤형 마우스 로딩 및 무선 주파수 코일 어레이 개발 과정이 가장 까다롭다고 느낄 것입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전에, 식별 및 체중 측정과 같은 모든 동물 취급 절차에 대해 소속 기관의 지역 동물 관리 위원회, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 또는 이에 상응하는 기구로부터 승인을 받으십시오.

동물 기록은 생물안전작업대 하에서 수행해야 합니다. 다음으로, MRI 유도 챔버로 운반하기 위해 동물들을 오토클레이브 가능한 플라스틱 용기에 옮깁니다. 예열된 유도 챔버에서 4% ISO fluorine과 분당 4리터의 산소를 사용하여 스캔할 동물들을 마취시킵니다.

동물이 발가락 집기 자극에 반응하지 않을 때 완전히 마취된 것으로 간주합니다. 필요한 경우, 맞춤형 슬레드에 내장된 ECG 및 온도 모니터링 장치와 더 원활하게 접촉할 수 있도록 nare와 같은 제모기를 사용하여 가슴 부위의 털을 제거할 수 있습니다. 또한, 안구 건조를 방지하기 위해 tears natural PMM과 같은 ISV를 안구에 도포하고, 피하 주사를 통해 약 0.3 milliliters의 생리식염수를 투여합니다.

동물의 수분을 보충합니다. 이제 ECG 호흡 및 온도 프로브가 내장된 개별 슬레드에 마우스를 올립니다. 앞뒤 부속기관이 슬레드에 있는 홈에 잘 위치하도록 주의하십시오.

ECG 모니터링이 필요한 경우, 마우스 배면의 털이 없는 부위가 ECG 프로브와 일치하도록 확인하고, 머리 스트랩과 코 스트랩으로 각 동물을 고정한 다음, 각 슬레드를 개방형 50 milliliter 원추형 튜브에 밀어 넣습니다. 한 번의 이미징 세션에서 최대 7마리의 살아있는 마우스를 스캔할 수 있도록 준비할 수 있습니다. 다음으로, 원추형 튜브를 로딩 어레이에 장착합니다.

모든 동물의 로딩이 완료되면 모든 생리학적 모니터링 라인을 연결하십시오. 마그넷 보어 내의 isof fluorine 농도를 2%로, 산소 유량을 분당 8리터로 설정하십시오. 이제 로딩 어레이를 마그넷으로 운반하여 레일 시스템 위에 배치하십시오.

레일 시스템을 사용하여 로딩 어레이를 마우스 하이브(mouse hive)와 결합합니다. 마우스 하이브는 마우스들이 마그넷 보어 중심에 위치한 각 무선 주파수(RF) 코일에 균일하게 배치되도록 설계되었습니다. 마그넷 내부에 완전히 삽입되면, 여기에서 보는 바와 같이 원심분리 튜브가 RF 코일 내의 마취제 공급 시스템에 결합됩니다. 산소와 혼합된 ISOF 불소 가스가 마우스 하이브에서 각 개별 코일의 축을 따라 연결된 튜브를 통해 검체로 공급됩니다. 이 마취 가스 혼합물은 마우스를 지나 튜브로 흐르며, 로딩 어레이 뒷면에 부착된 능동형 회수 장치에 의해 수집됩니다.

호흡 및 체온과 같은 동물의 생리학적 측정값에 따라, 이소플루란 농도는 0.9에서 2% 사이로 설정해야 합니다. 이제 빠른 B-mode 에코 시퀀스를 사용하여 동물을 스캔하십시오. 각 3차원 스캔의 소요 시간은 약 3시간이며, 결과 영상의 해상도는 125 micrometers입니다. 스캔 과정 전반에 걸쳐 각 동물의 ECG 측정값, 호흡 및 체온을 반드시 모니터링하십시오.

스캐닝 세션 동안에는 가온된 공기를 흘려주어 동물을 따뜻하게 유지해야 합니다. 스캔이 완료되면 로딩 어레이를 마그넷에서 제거하고 100% oxygen이 채워진 가온 유도 챔버에 넣으십시오. 튜브에서 동물을 꺼내 생물안전작업대(biological safety cabinet)로 운반할 수 있도록 플라스틱 밀폐 용기에 옮기십시오.

마지막으로, 동물을 따뜻하고 외풍이 없는 케이지에 넣고 exvivo 동물 영상 촬영을 위해 마취에서 회복될 때까지 기다립니다. 먼저, 케타민과 자일라진 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 완전히 마취합니다. 관류를 시작하기 전, 발가락이나 발바닥 꼬집기 테스트를 통해 수술 마취 평면을 확인합니다.

흉강을 열고 심장의 좌심실에 바늘 또는 안전 윙드 인퓨전 세트를 삽입합니다. 그런 다음 경심장 관류를 시작하기 위해 우심방을 절개합니다. 먼저 실온의 1x phosphate buffered saline에 밀리리터당 1 µL의 heparin과 2 mM protease inhibitor를 혼합한 용액 30 mL를 약 100 mL/hr의 유속으로 세척합니다.

이 과정은 약 20분 정도 소요됩니다. 다음으로 2mM 프로니덱스(pronase)가 혼합된 실온의 4% 파라포름알데히드 30mL를 시간당 100mL의 속도로 투입하여 고정 과정을 진행합니다. 이제 동물의 머리를 절단하고 피부, 하악골, 귀, 그리고 연골성 코끝 부분을 제거하십시오.

그 다음 남은 두개골 구조물을 2mM probenecid가 혼합된 4% 파라포름알데히드에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 표본을 보존을 위해 0.02% sodium azide와 2mM probenecid가 혼합된 1x 인산 완충 식염수 용액으로 옮깁니다. 7 Tesla에서의 고해상도 3D MRI 스캐닝은 최소 4일에서 최대 2.5개월 이내에 수행되어야 합니다.

관류 후, 영상 촬영을 진행할 뇌 조직을 16채널 솔레노이드 코일 어레이(solenoid coil array)에 넣고 이를 스캐너에 배치합니다. 이제 fast spin echo 시퀀스를 사용하여 표본을 스캔합니다.

이 스캔 소요 시간은 약 12시간이며, 최종 이미지는 32 micrometers의 등방성 해상도를 갖게 됩니다. 스캔이 완료되면 이미징 코일에서 표본을 꺼내 각 두개골을 2 millimolar pro hands가 포함된 10% formalin 용액에 넣어 생체 내 상태를 대표하도록 보존합니다. 여기에는 한 번의 3시간 스캔으로 얻은 여러 마리 생쥐 뇌 이미지들이 제시되어 있습니다.

이 그림은 스캔된 7마리의 마우스 각각에 대한 세 가지 관찰 축을 보여줍니다. 여기 32 micron 등방성 해상도의 대표적인 ex vivo 뇌 이미지가 있습니다. 그리고 여기 마스터링이 완료된 ex vivo 이미지 볼륨의 3D 렌더링을 볼 수 있습니다.

이 in vivo 기술은 적절히 수행될 경우 3~4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생의학 분야의 연구자들이 마우스 모델을 통해 루푸스, 헌팅턴병, 알츠하이머병과 같은 질환을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 MRI를 사용하여 고품질의 뇌 영상을 얻기 위해 살아있는 피험체와 고정된 피험체 모두를 영상화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사합니다.