Name: 기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 학습하세요 특정 peptidyl-tRNA를 포함한 리보솜을 생물소표기 mRNA와 자기적 추출을 이용해 분리하는 방법을 통해 번역 과정에서 리보솜의 구조와 기능을 정밀하게 분석하는 기술을.

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LRC - V. 박사 Adriel D. 존슨, 그의 최우선 항상 학생들의 교육을했습니다 훌륭한 교수의 기억이 논문을 바치고하고자합니다. 우리는 Adriel 당신이 그리워요. 우리는이 연구에서 설명하는 실험을 수행하는 그녀의 도움을 재클린 모레노에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation), MCB - 0615390에서 CY에 제공하는 보조금에 의해 지원하고, LRC - V로 제공 시작 기금에 의해.했습니다 헌츠빌에 위치한 앨라배마 대학에서.

1. 휴대폰 무료 추출 준비합니다. <ol><li> 펠렛 박테리아 건조 대장균의 두 그램 중순 로그 위상 문화가 버퍼의 절반 리터와 두번 씻어 아르에서 얻은 포함 10 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 14 MM 마그네슘 아세테이트, 60 MM 칼륨 아세테이트, 50 μg 4 5 분 5,000 X g에서 원심 분리하여 / ML phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C. 세척 후, 세균성 펠렛은 버퍼 A. 40 ML에 resuspended입니다 </li><li> 박테리아 세포는 6,000 PSI 압력을 적용, 프랑스 프레스를 사용하여 방해하고 있습니다. 이 압력은 1 인치 피스톤을 사용하여 600 단위에 해당합니다. 중단 정지 깨끗한 유리관 (50 ML)에서 수집됩니다. </li><li> 중단 정지는 1 ㎜ dithiotreitol (DTT)의 치료 30 분 30,000 XG에 centrifuged입니다. 원심 분리 절차는 결과 뜨는을 사용하여 반복됩니다. 최종 뜨는은 microtubes로 (1 ML) 적절합니다. 마지막으로, aliquots는 드라이 아이스 - 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. </li></ol> 2. RF2의 열화 휴대폰 무료 추출물 준비. <ol><li> 단백질 렉틴 세파 로스 4B 슬러리 비즈 4.5 ML 한 시간, 상온에서 회전 바퀴를 사용하여 안티 RF2 방지 혈청 5 ML과 혼합됩니다. 혼합물은 항혈청에서 비즈를 분리 XG 2500에서 centrifuged입니다. 폐기시 뜨는은, 안티 - RF2 항체 (안티 RF2 구슬)이있는이 구슬은 나중에 35 밀리미터를 포함하는 버퍼 B 1 ML에 resuspension로 씻어 아르 트리스 - 아세테이트 산도 7.8, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 30 MM의 암모늄 아세테이트 60 MM 칼륨 글루 탐 산염 및 5 μg / 류펩틴의 proteinase 억제제의 ML. 안티 RF2 구슬을 같은 조건 위 표시를 사용하여 원심 분리하여 버퍼 B에서 분리됩니다. 세척 절차는 두 번 반복됩니다. </li><li> 셀 - 무료 추출물 중 하나 ML은 4, 회전 바퀴를 사용하여 방지 RF2 구슬 150 μL와 혼합됩니다 ° C, 두 시간. 혼합물은 비즈의 세포없이 추출 분리 10,000 XG에 centrifuged입니다. 뜨는은 안티 RF2 구슬의 또 다른 150 μL로 다시 제거 처리됩니다. 이 절차는 결과 셀 무료 추출 솔루션을 한 번 더 반복됩니다. 마지막 셀 - 무료 추출 솔루션은 microtubes로 (100 μL) 적절합니다. aliquots는 드라이 아이스 - 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. </li></ol> 3. DNA 템플릿의 준비. <ol><li> 그림 1 각 dNTP의 0.2 micromoles 및 50 U에 표시된 oligodeoxynucleotides 각 0.4 nanomoles와 시퀀스가​​ 번역을 포함하는 플라스미드 템플릿 (그림 1)의 혼합 600 femtomoles에 의해 1 ML PCR 반응을 준비 DNA 형성 촉매 - Stratagene 회사가 제공하는 버퍼에의 DNA 중합 효소는 다음과 조건에서 증폭 반응을 수행 : 94 ° 2 분에 대한 C, (94 ° 30 S에 대한 C, 55 ° 30 S에 대한 C, 72 ° 1 분에 대한 C, 30 주기) 72 ° C 12 분. </li><li> 10분의 1 3 M의 아세트산 나트륨의 볼륨, 산도 5.2 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨을 추가하여 DNA를 precipitating하여 PCR - 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. 디에틸 - pyrocarbonate (DEPC) 처리 - 물 100 μL의 DNA를 Resuspend. 일반적으로이 절차는 600 BP의 DNA 제품의 100 μg을 산출. </li><li> 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 PCR 제품의 무결성을 확인합니다. </li></ol> 4. 비오틴 라벨 mRNA의 준비. <ol><li> ATP, CTP, GTP, UTP의 0.3 micromoles, 비오틴 - 16 - UTP 50 nanomoles, 10 μL의 0.5 micromoles와 PCR - 생성된 DNA 조각의 5 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 시험 관내 전사 반응에 100 μL 준비 Promega (주)가 제공하는 버퍼에 T7 효소 믹스 37에서 반응 혼합물을 품어 ° C를 3 시간 동안. 얻은 mRNA의 양을 계량하려면 DNA 템플릿은 RNase 무료 DNase를 추가하여 제거하여야한다. 37 반응 ° C 10 분 품어. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 차가운 에탄올 2 볼륨 10분의 1 볼륨을 추가하여 RNA를 precipitating하여 mRNA 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. DEPC 처리 - 물 100 μL의 mRNA를 Resuspend. 보통 600 NT 비오틴 1-2 MG 사이에이 절차의 수확량은 mRNA 제품을 분류. </li><li> 아가로 오스 젤에 전기 영동하여 비오틴 표시 mRNA 제품의 무결성을 확인합니다. </li></ol> 5. Peptidyl - tRNA를 포함 번역 리보솜의 분리. <ol><li> 열아홉 아미노산 각각의 지방산 - 모든 아미노산을 제외한 방사성 아미노산으로 대체됩니다 75 nanomoles와 비오틴 - 레이블 mRNA의 10-15 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 체외 번역 반응 혼합물에 500 μL 준비 50 방사성 아미노산 (37MBq)의 μCi, 그리고 20-5 40 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트, 2 MM DTT, 2 MM ATP, 0.5를 포함하는 버퍼 반응 혼합물에 RF2 - 고갈 셀 - 무료 추출물, 0 μL MM GTP, 30 MM의 phosphoenolpyruvate (응원), 0.3 U / ML pyruvate의 키나제 (PK), 폴리에틸렌 글리콜 3.5 % 8000 1 ㎜의 spermidine, 20 μg / ML folinic 산성, 250 μg / E.에서 ML tRNA 대장균. 37 반응 혼합물을 품어 ° C를 10 분. 반응 구성 요소 이외의 순서는 매우 중요합니다. 셀 - 무료 추출물은 아미노산과 변이의 활성화를 허용하도록 실온에서 5 분 incubated 최종 혼합물을 포함하는 버퍼 솔루션 첫번째 혼합해야합니다. 나중에 비오틴 - 표시 mRNAs이 추가됩니다. 화학 수정 절차를 사용하여 구조 분석을 위해, 방사성 아미노산의 추가가 필요하지 않습니다. </li><li> 35 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트와 1 ㎜의 DTT를 포함하는 버퍼 C에서 정지 streptavidin의 상자 성체의 비즈 (SMB) 3 ML - 번역 반응 혼합물에 추가합니다. 10 분 상온에서 새로운 현탁액을 품어. </li><li> 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기장 (MF)를 적용하여 혼합물에서 SMB를 구분한다. </li><li> 버퍼 C에서 SMB를 Resuspend와 MF를 사용하여 다시 비즈를 구분한다. 두번 세척 절차를 반복합니다. 버퍼 C 500 μL에 비즈를 Resuspend, 얼음에 정지를 저장하고, 즉시 다음 절차를 수행합니다. </li></ol> 6. Peptidyl - tRNA를 포함하는 절연 변이 분석. peptidyl - tRNA에 대한 <ol><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8, 2.5 % (V / V) 글리세롤, 4 %의 나트륨 dodecyl 황산염, 2 MM DTT와 0.2 MG를 포함하는 로딩 버퍼 10 μL와 SMB 10 μL를 (버퍼 C에서 정지) 믹스 / ML bromophenol 파란색. 10% 트리스 - tricine의 polyacrylamide의 젤의 샘플을 실행하여 구슬에 연결된 구성 요소를 해결합니다. </li><li> 진공 젤 - 건조기를 사용하여 젤을 건조. </li><li> X - 선 필름에 건조 겔을 노출하여 peptidyl - tRNA의 무결성과 정화를 확인합니다. </li></ol> ribosomal RNA에 대한 <ol start="4"><li> DEPC - 처리된 물을 준비이 당연 ethylenediaminetetraacetate (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션을 190 μL, 그리고 비드 정지 10 μL로 물을 equilibrated 페놀 200 μL를 추가합니다. 활발한 vortexing하여 현탁액을 혼합하여 실온에서 3 분 10,000 XG에서 원심 분리하여 유기적인 단계에서 무기 단계를 구분한다. 새로운 microtube 최고의 물 레이어를 수집합니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨의 10분의 1 볼륨, 산도 5.2, 20 MG / 글리코겐 솔루션, 그리고 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨 ML 1 μL를 추가하여 물 계층에서 RNA를 침전. DEPC - 처리된 물 10 μL의 RNA를 Resuspend. </li><li> 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 ribosomal RNAS의 무결성을 확인합니다. 보통 비즈 정지 50 μL는 ribosomal RNA 1μg의 산출. </li></ol> 7. 대표 결과 : 그림 2에 설명된 절차를 사용하여 격리 번역 리보솜의 품질과 기능을 평가 분석의 일련의 결과를 보여줍니다. polyacrylamide의 젤에서 해결된 독특한 밴드의 관찰은 SMB (그림 2A)에 연결된 비오틴 - 표시 mRNAs에 바운드 polypeptides의 존재를 나타냅니다. 이 프로 시저를 사용하여 ribosomal RNAS의 정화는 물론, 이러한 비오틴 - 표시 mRNAs에 바운드 (그림 2B) 변이의 존재를 설정합니다. puromycin의 추가, ribosome의 peptidyl - transferase 활동을 유도 항생제, 초기 peptidyl - tRNAs 1 절단을 초래합니다. 이것은 (그림 2C) polyacrylamide의 젤에 분리된 polypeptide의 마이 그 레이션 패턴의 변화로 관찰됩니다. 함께, 이러한 데이터는 SMB에 연결된 비오틴 - 표시 mRNAs은 peptidyl - tRNAs와 기능 변이를 포함하는 것으로 나타났습니다. 특정 peptidyl - tRNAs를 포함하는 번역 리보솜의 고립은 ribosome 기능 (그림 3A)에 peptidyl - tRNAs, 항생제 및 기타 분자의 효과 연구를 허용하고, ribosome 구조 (그림 3B). 예제에서 여기 항생제 sparsomycin을 제시하고 아미노산 트립토판 (TRP)는 격리 리보솜 (그림 3A)에 RF2하여 초기 tnaC - tRNA peptidyl - tRNA 유도의 가수 분해 절단을 억제. ribosome과 sparsomycin 또는 TRP의 상호 작용은 또한 번역 ribosome (그림 3B)의 23S rRNA를 구성 일부 세포핵의 구조적 변화를 유도. 요약에서 프로 시저를 사용하여 얻은 생물 학적 물질은 다양한 분자 요소와의 상호 작용에 따라 ribosome 기능의 억제에 관련된 구조적 연락처 추가 지식을 얻기에 유용하다 여기에서 설명한. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. peptidyl - tRNAs를 포함하는 번역 리보솜을 생산하고 정화하는 데 사용되는 절차. DNA는 CA를 파편. 그림에 표시된 tnaC 유전자와 그 인접 지역을 포함한 길이 650 BP는, 비오틴을 [(바이오) 지금 뭐] mRNA가 포함된 mRNAs 준비에 템플릿으로 사용됩니다. 이러한 DNA 조각은 그림의 맨 위에 표시된 oligodeoxynucleotides를 사용하여 PCR 절차에 의해 생산됩니다. 밑줄 문자는 뉴클레오 티드 뇌관으로 인코딩된 T7 프로 모터의 위치를​​ 표시합니다. 볼드 문자 tnaC mRNA 시퀀스의 번역에 사용되는 샤인 - 달가노 순서를 나타냅니다. 의 DNA 조각의 T7 프로 모터는 (화살표) tnaC 시퀀스와 비 코딩 시퀀스의 하류를 녹음하는 데 사용됩니다 T7 RNA 효소에 의해 인정되고 있습니다. RNA 효소는 rpoBC 터미네이터 시퀀스 (rpoBC "T") 후, DNA 조각의 3' - 끝에 도달하면 전사가 종료됩니다. rpoBC 터미네이터의 줄기 루프 구조가 체외 번역 반응에 사용되는 셀없는 추출물의 3' - 5 'exoribonuclease 활동 현재의 mRNA를 보호합니다. 격리 [(바이오) 지금 뭐] mRNAs는 체외 번역 assays 사용하여, 지연, 번역 변이를 생성하는 데 사용됩니다. 의 tnaC 순서 [(바이오) 지금 뭐] mRNA는 반응 혼합물에서 릴리스 팩터의 부재 (RF2)에 의한 마지막 아미노산이 통합되었을 때 노점 ribosome에 의해 번역합니다. ribosome - [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 mRNA에 통합 비오틴 - 라벨 세포핵을 바인딩 streptavidin - 자석 - 구슬 (SMB)를 사용하여 총 반응 혼합물로부터 격리됩니다. SMBs는 바운드 ribosome - [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 자기장 (MF)를 사용하여 총 반응 혼합물에서 추출됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 절연 단지의 구조 및 기능 분석합니다. A) 시험 관내의 변환 반응이 함께 수행했다 [(바이오) 지금 뭐] tnaC 유전자의 시작 코돈이 정지 코돈으로 대체어진 mRNAs. 최종 제품으로 그림 1에 표시됩니다, streptavidin 비즈를 사용하여 격리되었습니다. 반응 제품 및 절연 분자는 다음의 polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 분석되었다. tnaC - tRNA와 tnaC 펩타이드 밴드가 표시됩니다. B) 총 RNA는 페놀 추출 절차를 사용하여 지연 단지에서 고립되었다. 각각의 분리된 RNA는 아가로 오스 젤에 전기 영동에 의해 해결되었습니다. Ribosomal RNAS (rRNAs)가 표시됩니다. C) tnaC - tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+)없이 incubated했다 (-) 10 분 상온에서 0.02 MM puromycin (Puro). tnaC의 펩타이드는 [35S] - 메티오닌 (A) 또는 [3H] - 프롤린 (B)를 사용하여 번역하는 동안 표시되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 항생제 sparsomycin 또는 아미노산 트립토판에 바인딩된 tnaC - tRNA를 포함하는 리보솜의 구조 및 기능 분석합니다. A) tnaC - tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+) 또는 (없이 incubated 있었다 -) sparsomycin (스파) 또는 5 분 실온에서 트립토판 (TRP). 나중에 혼합은 RF2와 혼합하여 37 ° C 20 분 incubated되었습니다. B) 23S rRNA의 methylation의 변화 분석 ribosome 내에서 바인딩 분자에 의해 유도. 절연 단지가와 (+)없이 사전 incubated했다 (-) 37시 5 분 2 MM TRP 또는 스파 ° C. 그런 다음, 알킬화 대리인, 디메틸 황산은 추가되고 혼합물은 추가 20 분 실온에서 incubated했다. 총 RNA가 추출되었고 뇌관 확장 assays은 [32P] 수정된 뉴클레오 티드에서 하류 100 세포핵을 간격 아르 23S rRNA의 세포핵을 보완 - 표시 oligodeoxynucleotide 함께 수행했다. 확장 assays의 최종 제품은 polyacrylamide의 젤에 전기 영동에 의해 해결되었다. TRP이나 스파의 존재에 의해 영향을 23S rRNA의 세포핵이 표시됩니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 보고서에 설명되어있는이 격리 절차는 매우 재현할 수 있습니다. 불행하게도, 같은 번역된 시퀀스에서 생산되는 짧은 peptidyl - tRNAs의 존재는 편리하게 피할 수없는, 그러한 peptidyl - tRNAs는 총 절연 재료 (그림 2C)의 15~20%에 해당 있습니다. 비오틴 - 분류 mRNA의 높은 농도를 사용되었거나 사용되는 셀 무료 추출이 된 경우 또는 여러 번 다시 사용되었을 때 이러한 오염 물질은 농도가 증가 수 있습니다. 따라서 체외 번역 반응의 구성 요소의 품질과 농도를 제어하는 것은 매우 중요하다. 또는, 상업 높은 효율 셀 무료 추출이 동일한 목적 (퓨어 시스템) 18 사용할 수 있습니다 재구성. 이 방법을 사용, 비오틴 - 16 - 지금 뭐은 무작위로 대상 mRNA의 길이를 따라 통합됩니다. 유리딘의 책자를 포함한 일부 ORFs이 자신의 번역에 영향을 미치는 그들의 시퀀스에서 염기 수정 포함 할 수도있는 가능성이있다. biotin-16-UTP/UTP의 가변 상대적 농도가 가장 효율적인 번역을 얻기 위해서는 mRNA의 합성하는 동안 테스트해야합니다. 비오틴 라벨의 대체 방법은 mRNAs의 5&#39; 엔드, 가장 안정적인 종료를 대상으로, 사용할 수 있습니다. (I) 비오틴은 3&#39; - NH2ATP (3&#39; - 아미노, 3&#39; - deoxyadenosine 삼인산) 및 T4 RNA ligase 19을 사용하여 mRNA의 5&#39; 엔드에 첨부하실 수 있습니다. (2) 5&#39; 엔드 비오틴 - 표시 oligonucleotide는뿐만 아니라 20 T4 RNA ligase의를 사용하여 mRNA의 5&#39; 엔드에 첨부하실 수 있습니다. (3) mRNA의 5&#39; - 끝에있는 상호 보완적인 순서에 해당하는 3&#39; 엔드 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotides도 번역 단지를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 비오틴 표시 oligodeoxynucleotides는 격리하기 전에 SMB에 연결된 수 있습니다. 나중에 SMB들은 상호 보완적인 mRNA 시퀀스와 상호 작용을 허용하도록 번역 반응 혼합물과 혼합 수 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotides에 첨부. 분리 후, 하이브리드 RNA - DNA 영역 -과 지역 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotide와 mRNA 순서 사이 hybridizing - RNAse H를 사용하여 저하 될 수 streptavidin 비즈에서 지연 단지 분리. 이 대체 방법은 단지 더 높은 해상도의 방법을 사용 향후 구조적 분석에 사용된 수 있도록 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 마그네슘</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>글루탐산 칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein A sepharose 4B 슬러리 비드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Taq-DNA polymerase</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>T7 Maxiprep 키트</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglycol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>포린산</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 유래 tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>트리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>L-아미노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리 스탠드</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

기능 및 구조 분석을위한 peptidyl - trnas를 포함 번역 리보솜의 분리

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

최근 구조적 및 생화 학적 연구는 항생제에 의해 단백질 합성을 억제하는 동안과 초기 polypeptide 합성하는 동안 ribosome에서 발생하는 분자 이벤트의 많은 자세한 있습니다. 이러한 항생제, 그리고 대부분 peptidyl - tRNAs의 형태로 규제 초기 polypeptides의 일부는, 펩티드 결합 형성 또는 번역 종료 1-7 중 하나를 억제. 이러한 억제 이벤트는 ribosome의 움직임을 막을 수 현상 &quot;translational 체포&quot;를 칭했다. 항생제 또는 초기 polypeptide에 의해 유도 번역 체포 등 세포 성장, 항생제 저항, 단백질 translocation과 세포 신진 대사를 8-13와 같은 다양한 세포 기능에 관련된 유전자의 표현을 규제하기 위해 표시되었습니다. 우리가 모든 생물의 번역에 ribosome의 완전한 역할을 이해할 수있다면 항생제와 규제 초기 polypeptides가 ribosome 기능을 변경하는 방법에 대한 지식이 필수적입니다. 여기, 우리는 독점적으로, 정화 분석, 이러한 변이는 특정 mRNA를 번역하고 특정 peptidyl - tRNA 14 포함하는 데 사용할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 비오틴 - 표시 mRNA에 리보솜의 번역 바운드 선택적 분리에 따라 달라집니다. 이러한 translational 단지는 streptavidin 상자 성체의 비즈 (SMB)과 자기장 (MF)를 사용하여 같은 혼합물의 다른 변이에서 구분됩니다. 비오틴 - 표시 mRNAs는 T7 transcriptional 발기인을 포함 템플릿 PCR 생성된 DNA 조각으로 사용하는 실행에서 전사 assays에 의해 합성됩니다. T7 RNA 효소는 비오틴 - UTP에서 비오틴 - 16 - 지금 뭐를 통합, 우리의 조건 하에서 약 10 비오틴 - 16 - 지금 뭐 분자는 25 % 지금 뭐 내용과 600 NT의 mRNA에 통합됩니다. 이러한 비오틴 - 표시 mRNAs은 다음 고립, 그리고 릴리스 계수 2 (RF2)로 수행 체외 번역 assays에 사용됩니다 - 고갈 야생 입력하거나 돌연변이 변이를 포함하는 대장균의 변종에서 얻은 세포없이 추출합니다. 비오틴 - 표시 mRNA 시퀀스를 번역 변이로 인해 정상적으로 종료 번역을 수행 RF2 단백질의 부재로, 정지 코돈 지역에서 지연됩니다. 새로 합성 peptidyl - tRNA를 포함하는 지연 변이는 고립과 SMB 및 MF를 사용하여 번역 반응에서 제거됩니다. 이 구슬은 비오틴 함유 메시지를 바인딩합니다. 절연, translational 단지는 야생 입력하거나 돌연변이 ribosomal 구성 요소 또는 peptidyl - tRNA 시퀀스뿐만 아니라, 항생제 또는 다른 분자 요인 1,14-16와 ribosome 상호 작용을 결정의 구조와 기능 기능을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 격리 ribosome 단지의 기능을 확인하려면, peptidyl - transferase assays은 항생제 puromycin 1의 면전에서 수행할 수 있습니다. translational 단지의 구조적 변화를 연구하기 위해, 잘 설립 절차는 특정 아미노산 14 및 / 또는 II) 알킬화 보호 assays 1,14,17 일) 등 전 같은 crosslinking을 사용할 수 있습니다.

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

최근 구조 및 생화학적 연구를 통해 단백질 합성 억제 과정 중 리보솜에서 일어나는 많은 분자적 사건들이 상세히 밝혀졌습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 고유한 펩티드 tRNA를 포함하는 순수 리보솜의 구조와 기능을 분석하는 것입니다. 이는 방출 인자가 제거된 무세포 추출물과 비오틴 표지 mRNA를 사용하여 인비트로(in vitro) 번역 분석을 수행함으로써, 비오틴 표지 mRNA에 결합된 정체된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 생성하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 스트렙타비딘 결합 상자성 비드를 인비트로 번역 분석물과 혼합하여 mRNA에 위치한 비오틴 분자와 상호작용하도록 합니다.이후, 자기장을 이용하여 비즈를 추출함으로써 전체 반응물로부터 mRNA에 결합된 정지된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 분리합니다. 다음으로, 정제된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 방출 인자(release factor)와 같은 번역 인자, 번역 억제 항생제 또는 화학적 변형제와 혼합하여 그 기능을 분석할 수 있습니다. 리보솜의 억제 및 구조 분석 결과, SDS 또는 Tris-Acetate page gel을 이용한 펩티드 전이효소 활성 또는 번역 종결 분석, 그리고 urea page gel을 이용한 변형 보호 분석을 통해 펩티드 tRNA의 가수분해 억제와 리보솜의 구조적 변화 사이의 상관관계가 나타납니다.차등 원심분리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 분리된 시료가 대부분 단일 집단의 pep tRNA를 가진 리보솜을 포함한다는 점입니다. 이 방법은 신생 폴리펩타이드의 성질이나, 번역 과정을 조절하는 것과 같이 항생제가 리보솜 기능에 미치는 영향 등 유전자 발현 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 로그 성장기 배양물로부터 2 g의 건조된 e coli 세균 펠렛을 준비하십시오.1L의 완충액으로 펠렛을 재현탁하여 세척한 후, 4°C에서 5,000 G로 5분간 원심분리합니다. 두 번의 세척 과정을 거친 후, 생성된 박테리아 펠렛을 40mL의 완충액에 재현탁하고 6,000 PSI의 압력을 가하는 French press를 사용하여 박테리아 세포를 파쇄합니다. 이 압력은 1인치 피스톤을 사용할 때 600 유닛에 해당합니다.파쇄된 현탁액을 50 milliliter의 깨끗한 유리 튜브에 수집합니다. 파쇄된 현탁액을 1 millimolar DIO triol 또는 DTT로 처리한 후, 시료를 30,000 Gs에서 30분 동안 원심분리합니다. 생성된 상층액을 제거하고 원심분리 과정을 반복합니다.두 번째 원심분리에서 얻은 상층액을 회수하여, 최종 상층액을 마이크로 튜브에 분주합니다. 마지막으로, 드라이아이스-에탄올 혼합물 또는 액체 질소를 사용하여 분주된 시료들을 급속 냉동시킨 후 -60°C 또는 -80°C에서 보관합니다.Protein A spheros 4B 슬러리 비드 4.5 milliliters와 항 RF two 항혈청 5 milliliters를 혼합하여 RF two가 제거된 cell-free extract 준비를 시작합니다. 혼합물을 회전 휠을 이용하여 상온에서 1시간 동안 회전시킵니다. 혼합물을 2,500 Gs에서 원심 분리하여 항혈청으로부터 비드를 분리합니다.상층액을 제거합니다. 이제 비드는 anti RF two 항체를 포함하고 있으며, 이를 anti RF two 비드라고 합니다. 1 mL의 buffer bee에 재현탁하여 비드를 세척합니다.그 다음, 이전과 같이 비드를 원심분리하여 anti RF two 비드를 버퍼 B와 분리합니다. 이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 비드 세척 후, 1 mL의 세포 유리 추출물(cell-free extract)을 150 µL의 anti RF two 비드와 혼합하고, 회전 휠에서 4 °C로 2시간 동안 배양합니다. 혼합물을 10,000 G로 원심분리하여 세포 유리 추출물을 비드로부터 분리합니다.상층액을 제거하고, 다시 150 µL의 anti RF two 비드를 처리한 후 배양 및 풀다운(pull down) 과정을 한 번 더 반복합니다. 최종적으로 RF two가 제거된 무세포 추출액 용액을 마이크로 튜브에 튜브당 100 µL씩 분주합니다. 드라이아이스-에탄올 혼합물 또는 액체 질소를 사용하여 분주된 시료를 급속 냉동하고 -60 또는 -80 °C에서 보관합니다.번역될 서열을 포함하는 플라스미드 템플릿, 올리고 뉴클레오타이드, dNTPs, intact DNA polymerase를 strategy PCR 버퍼에 혼합하여 PCR 반응액을 준비합니다. PCR 샘플이 준비되면 증폭 반응을 수행하고, 3 M sodium acetate (pH 5.2) 0.1배 용량과 얼음처럼 차가운 에탄올 2배 용량을 첨가하여 PCR 산물을 정제하기 위해 DNA를 침전시킵니다. 침전 과정을 한 번 더 반복한 후, 얻어진 DNA를 100 µL의 diethyl pyrocarbonate 또는 DEPC 처리된 물에 현탁합니다.아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 산물의 무결성을 확인합니다. 일반적으로 이 과정에서는 600 base pair DNA 산물이 100 micrograms 생성됩니다. DEPY 처리된 물에서 PCR로 생성된 DNA 단편 5 micrograms를 biotin 표지 UTP 리보뉴클레오타이드 및 T7 효소 믹스와 혼합하여 100 microliter의 인비트로(in vitro) 전사 반응액을 준비합니다.반응 혼합물을 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 얻어진 mRNA의 양을 정량하기 위해, RNA free DNase를 첨가하여 DNA 템플릿을 제거합니다. 반응물을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.mRNA 생성물을 정제하기 위해, 3 M sodium acetate(pH 5.2)를 1/10 부피로 추가하고 차가운 ethanol을 2배 부피로 넣어 RNA를 두 번 침전시킵니다. 침전된 mRNA를 100 µL의 DEPC 처리수로 재현탁합니다. agarose 겔 전기영동을 통해 biotin 표지 mRNA 생성물의 무결성을 확인합니다. 일반적으로 이 절차를 통해 600 nucleotide의 biotin 표지 mRNA 생성물이 1~2 mg 정도 얻어집니다. peptid tRNA를 포함하는 번역 리보솜의 분리를 시작하기 위해, DEPC 처리수로 500 µL의 in vitro 번역 반응 혼합물을 준비합니다.먼저, 함께 제공된 서면 프로토콜에 설명된 완충 반응 혼합물을 준비한 다음, 방사성 아미노산으로 대체될 아미노산을 제외한 나머지 각 아미노산을 75 M씩 첨가합니다. 그다음, 아미노산이 포함된 완충액에 RF two 결핍 세포 프리 엑스트랙트(cell-free extract) 20~50 µL를 첨가합니다. 리보솜이 활성화될 수 있도록 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.리보솜이 활성화되면, 비오틴 표지 mRNA 10~15 µg을 샘플에 첨가하십시오. 반응 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오.그동안 버퍼 C에 streptavidin paramagnetic beads(또는 SMB) 3 mL를 준비합니다. 배양 후, SMP 현탁액을 번역 반응 혼합물에 첨가합니다. 새로운 현탁액을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기장을 가함으로써 혼합물로부터 SMB를 분리합니다. 재현탁합니다.SMB를 버퍼 C에 현탁하고 자석 스탠드를 사용하여 비드를 다시 분리합니다. 이 세척 과정을 2회 반복한 후, 비드를 500 µL의 버퍼 C에 재현탁합니다. 현탁액을 얼음 위에 보관하고 즉시 다음 절차를 수행하십시오. 펩타이드 tRNA를 시각화하려면, 현탁된 SMB와 버퍼 C 혼합물 10 µL를 로딩 버퍼 10 µL와 섞은 후, 샘플을 10% Tris-tric polyacrylamide 젤에서 전기영동하여 비드에 결합된 성분들을 분리합니다.진공 겔 건조기를 사용하여 겔을 건조합니다. 그런 다음 건조된 겔을 x-ray 필름에 노출시켜 펩타이드 TRNA의 무결성과 정제 여부를 확인합니다. 리보솜 RNA를 분석하려면 dpci 처리된 물로 조제한 2 mM EDTA 용액 190 µL, 물로 평형을 맞춘 페놀 200 µL, 그리고 비드 현탁액 10 µL를 혼합합니다.결과물인 현탁액을 강하게 볼텍싱하여 섞습니다. 상온에서 10,000 Gs로 3분간 원심분리하여 무기상과 유기상을 분리합니다. 상층의 수층을 새 마이크로 튜브에 수집하고, 수층에 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(pH 5.2), 1 µL의 20 mg/mL 글라이코젠 용액, 그리고 2 부피의 얼음처럼 차가운 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다. 침전된 RNA를 10 µL의 DEPC 처리수로 재현탁합니다.niros 겔 전기영동을 통해 리보솜 RNA의 무결성을 확인하십시오. 일반적으로 50 µL의 비드 현탁액에서 1 µg의 리보솜 RNA가 얻어집니다. 여기서는 분리된 번역 리보솜의 품질과 기능성을 평가한 일련의 분석 결과가 제시됩니다.폴리아크릴아마이드 겔에서 분리된 고유한 밴드가 관찰되는 것은 SMB에 부착된 biotin 표지 mRNA에 폴리펩타이드가 결합되어 있음을 나타냅니다. 리보솜 RNA의 정제를 통해 이러한 biotin 표지 mRNA에 리보솜 또한 결합되어 있음이 확인됩니다.리보솜의 펩티드 전이 효소(peptidyl transferase) 활성을 유도하는 항생제인 퓨로마이신(puromycin)을 첨가하면 생성 중인 펩티드 tRNA(peptidyl tRNAs)가 절단됩니다. 이는 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 폴리펩타이드의 이동 패턴 변화로 관찰됩니다. 종합적으로 이러한 데이터는 SMB에 부착된 비오틴 표지 mRNA가 펩티드 tRNA를 가진 기능적인 리보솜을 포함하고 있음을 나타냅니다.특정 펩티드 tRNA를 포함하는 번역 리보솜의 분리는 펩티드 tRNA, 항생제 및 기타 분자들이 리보솜 기능과 구조에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 여기에 제시된 예시에서, 항생제 parsamyn과 아미노산 tryptophan은 분리된 리보솜 내에서 RF two에 의한 nascent TNAC tRNA 펩티드 tRNA의 가수분해 절단을 억제합니다.트립토판 또는 스파르시마이신과 리보솜의 상호작용은 번역 중인 리보솜의 23S rRNA를 구성하는 일부 뉴클레오타이드의 구조적 변화 또한 유도합니다. 숙달되면, 이 기술의 주요 부분은 절차를 적절히 따를 경우 5시간 이내에 수행할 수 있습니다. cryo-EM과 같은 다른 방법들을 통해 추가적인 구조 분석을 수행하여 고유한 펩티드 RNA를 포함하는 리보솜 구조에 관한 추가 질문들에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

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우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM "체포 시퀀스는"prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용...

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Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

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희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

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진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

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기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

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