기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

다음 실험의 전반적인 목표는 고유한 펩티드 tRNA를 포함하는 순수 리보솜의 구조와 기능을 분석하는 것입니다. 이는 방출 인자가 제거된 무세포 추출물과 비오틴 표지 mRNA를 사용하여 인비트로(in vitro) 번역 분석을 수행함으로써, 비오틴 표지 mRNA에 결합된 정체된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 생성하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 스트렙타비딘 결합 상자성 비드를 인비트로 번역 분석물과 혼합하여 mRNA에 위치한 비오틴 분자와 상호작용하도록 합니다.

이후, 자기장을 이용하여 비즈를 추출함으로써 전체 반응물로부터 mRNA에 결합된 정지된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 분리합니다. 다음으로, 정제된 펩티드 tRNA 리보솜 복합체를 방출 인자(release factor)와 같은 번역 인자, 번역 억제 항생제 또는 화학적 변형제와 혼합하여 그 기능을 분석할 수 있습니다. 리보솜의 억제 및 구조 분석 결과, SDS 또는 Tris-Acetate page gel을 이용한 펩티드 전이효소 활성 또는 번역 종결 분석, 그리고 urea page gel을 이용한 변형 보호 분석을 통해 펩티드 tRNA의 가수분해 억제와 리보솜의 구조적 변화 사이의 상관관계가 나타납니다.

차등 원심분리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 분리된 시료가 대부분 단일 집단의 pep tRNA를 가진 리보솜을 포함한다는 점입니다. 이 방법은 신생 폴리펩타이드의 성질이나, 번역 과정을 조절하는 것과 같이 항생제가 리보솜 기능에 미치는 영향 등 유전자 발현 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 로그 성장기 배양물로부터 2 g의 건조된 e coli 세균 펠렛을 준비하십시오.

1L의 완충액으로 펠렛을 재현탁하여 세척한 후, 4°C에서 5,000 G로 5분간 원심분리합니다. 두 번의 세척 과정을 거친 후, 생성된 박테리아 펠렛을 40mL의 완충액에 재현탁하고 6,000 PSI의 압력을 가하는 French press를 사용하여 박테리아 세포를 파쇄합니다. 이 압력은 1인치 피스톤을 사용할 때 600 유닛에 해당합니다.

파쇄된 현탁액을 50 milliliter의 깨끗한 유리 튜브에 수집합니다. 파쇄된 현탁액을 1 millimolar DIO triol 또는 DTT로 처리한 후, 시료를 30,000 Gs에서 30분 동안 원심분리합니다. 생성된 상층액을 제거하고 원심분리 과정을 반복합니다.

두 번째 원심분리에서 얻은 상층액을 회수하여, 최종 상층액을 마이크로 튜브에 분주합니다. 마지막으로, 드라이아이스-에탄올 혼합물 또는 액체 질소를 사용하여 분주된 시료들을 급속 냉동시킨 후 -60°C 또는 -80°C에서 보관합니다.

Protein A spheros 4B 슬러리 비드 4.5 milliliters와 항 RF two 항혈청 5 milliliters를 혼합하여 RF two가 제거된 cell-free extract 준비를 시작합니다. 혼합물을 회전 휠을 이용하여 상온에서 1시간 동안 회전시킵니다. 혼합물을 2,500 Gs에서 원심 분리하여 항혈청으로부터 비드를 분리합니다.

상층액을 제거합니다. 이제 비드는 anti RF two 항체를 포함하고 있으며, 이를 anti RF two 비드라고 합니다. 1 mL의 buffer bee에 재현탁하여 비드를 세척합니다.

그 다음, 이전과 같이 비드를 원심분리하여 anti RF two 비드를 버퍼 B와 분리합니다. 이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 비드 세척 후, 1 mL의 세포 유리 추출물(cell-free extract)을 150 µL의 anti RF two 비드와 혼합하고, 회전 휠에서 4 °C로 2시간 동안 배양합니다. 혼합물을 10,000 G로 원심분리하여 세포 유리 추출물을 비드로부터 분리합니다.

상층액을 제거하고, 다시 150 µL의 anti RF two 비드를 처리한 후 배양 및 풀다운(pull down) 과정을 한 번 더 반복합니다. 최종적으로 RF two가 제거된 무세포 추출액 용액을 마이크로 튜브에 튜브당 100 µL씩 분주합니다. 드라이아이스-에탄올 혼합물 또는 액체 질소를 사용하여 분주된 시료를 급속 냉동하고 -60 또는 -80 °C에서 보관합니다.

번역될 서열을 포함하는 플라스미드 템플릿, 올리고 뉴클레오타이드, dNTPs, intact DNA polymerase를 strategy PCR 버퍼에 혼합하여 PCR 반응액을 준비합니다. PCR 샘플이 준비되면 증폭 반응을 수행하고, 3 M sodium acetate (pH 5.2) 0.1배 용량과 얼음처럼 차가운 에탄올 2배 용량을 첨가하여 PCR 산물을 정제하기 위해 DNA를 침전시킵니다. 침전 과정을 한 번 더 반복한 후, 얻어진 DNA를 100 µL의 diethyl pyrocarbonate 또는 DEPC 처리된 물에 현탁합니다.

아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 산물의 무결성을 확인합니다. 일반적으로 이 과정에서는 600 base pair DNA 산물이 100 micrograms 생성됩니다. DEPY 처리된 물에서 PCR로 생성된 DNA 단편 5 micrograms를 biotin 표지 UTP 리보뉴클레오타이드 및 T7 효소 믹스와 혼합하여 100 microliter의 인비트로(in vitro) 전사 반응액을 준비합니다.

반응 혼합물을 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 얻어진 mRNA의 양을 정량하기 위해, RNA free DNase를 첨가하여 DNA 템플릿을 제거합니다. 반응물을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.

mRNA 생성물을 정제하기 위해, 3 M sodium acetate(pH 5.2)를 1/10 부피로 추가하고 차가운 ethanol을 2배 부피로 넣어 RNA를 두 번 침전시킵니다. 침전된 mRNA를 100 µL의 DEPC 처리수로 재현탁합니다. agarose 겔 전기영동을 통해 biotin 표지 mRNA 생성물의 무결성을 확인합니다. 일반적으로 이 절차를 통해 600 nucleotide의 biotin 표지 mRNA 생성물이 1~2 mg 정도 얻어집니다. peptid tRNA를 포함하는 번역 리보솜의 분리를 시작하기 위해, DEPC 처리수로 500 µL의 in vitro 번역 반응 혼합물을 준비합니다.

먼저, 함께 제공된 서면 프로토콜에 설명된 완충 반응 혼합물을 준비한 다음, 방사성 아미노산으로 대체될 아미노산을 제외한 나머지 각 아미노산을 75 M씩 첨가합니다. 그다음, 아미노산이 포함된 완충액에 RF two 결핍 세포 프리 엑스트랙트(cell-free extract) 20~50 µL를 첨가합니다. 리보솜이 활성화될 수 있도록 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

리보솜이 활성화되면, 비오틴 표지 mRNA 10~15 µg을 샘플에 첨가하십시오. 반응 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오.

그동안 버퍼 C에 streptavidin paramagnetic beads(또는 SMB) 3 mL를 준비합니다. 배양 후, SMP 현탁액을 번역 반응 혼합물에 첨가합니다. 새로운 현탁액을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기장을 가함으로써 혼합물로부터 SMB를 분리합니다. 재현탁합니다.

SMB를 버퍼 C에 현탁하고 자석 스탠드를 사용하여 비드를 다시 분리합니다. 이 세척 과정을 2회 반복한 후, 비드를 500 µL의 버퍼 C에 재현탁합니다. 현탁액을 얼음 위에 보관하고 즉시 다음 절차를 수행하십시오. 펩타이드 tRNA를 시각화하려면, 현탁된 SMB와 버퍼 C 혼합물 10 µL를 로딩 버퍼 10 µL와 섞은 후, 샘플을 10% Tris-tric polyacrylamide 젤에서 전기영동하여 비드에 결합된 성분들을 분리합니다.

진공 겔 건조기를 사용하여 겔을 건조합니다. 그런 다음 건조된 겔을 x-ray 필름에 노출시켜 펩타이드 TRNA의 무결성과 정제 여부를 확인합니다. 리보솜 RNA를 분석하려면 dpci 처리된 물로 조제한 2 mM EDTA 용액 190 µL, 물로 평형을 맞춘 페놀 200 µL, 그리고 비드 현탁액 10 µL를 혼합합니다.

결과물인 현탁액을 강하게 볼텍싱하여 섞습니다. 상온에서 10,000 Gs로 3분간 원심분리하여 무기상과 유기상을 분리합니다. 상층의 수층을 새 마이크로 튜브에 수집하고, 수층에 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(pH 5.2), 1 µL의 20 mg/mL 글라이코젠 용액, 그리고 2 부피의 얼음처럼 차가운 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다. 침전된 RNA를 10 µL의 DEPC 처리수로 재현탁합니다.

niros 겔 전기영동을 통해 리보솜 RNA의 무결성을 확인하십시오. 일반적으로 50 µL의 비드 현탁액에서 1 µg의 리보솜 RNA가 얻어집니다. 여기서는 분리된 번역 리보솜의 품질과 기능성을 평가한 일련의 분석 결과가 제시됩니다.

폴리아크릴아마이드 겔에서 분리된 고유한 밴드가 관찰되는 것은 SMB에 부착된 biotin 표지 mRNA에 폴리펩타이드가 결합되어 있음을 나타냅니다. 리보솜 RNA의 정제를 통해 이러한 biotin 표지 mRNA에 리보솜 또한 결합되어 있음이 확인됩니다.

리보솜의 펩티드 전이 효소(peptidyl transferase) 활성을 유도하는 항생제인 퓨로마이신(puromycin)을 첨가하면 생성 중인 펩티드 tRNA(peptidyl tRNAs)가 절단됩니다. 이는 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 폴리펩타이드의 이동 패턴 변화로 관찰됩니다. 종합적으로 이러한 데이터는 SMB에 부착된 비오틴 표지 mRNA가 펩티드 tRNA를 가진 기능적인 리보솜을 포함하고 있음을 나타냅니다.

특정 펩티드 tRNA를 포함하는 번역 리보솜의 분리는 펩티드 tRNA, 항생제 및 기타 분자들이 리보솜 기능과 구조에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 여기에 제시된 예시에서, 항생제 parsamyn과 아미노산 tryptophan은 분리된 리보솜 내에서 RF two에 의한 nascent TNAC tRNA 펩티드 tRNA의 가수분해 절단을 억제합니다.

트립토판 또는 스파르시마이신과 리보솜의 상호작용은 번역 중인 리보솜의 23S rRNA를 구성하는 일부 뉴클레오타이드의 구조적 변화 또한 유도합니다. 숙달되면, 이 기술의 주요 부분은 절차를 적절히 따를 경우 5시간 이내에 수행할 수 있습니다. cryo-EM과 같은 다른 방법들을 통해 추가적인 구조 분석을 수행하여 고유한 펩티드 RNA를 포함하는 리보솜 구조에 관한 추가 질문들에 답할 수 있습니다.