배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 신장에서 신원성 구역(nephrogenic zone) 세포의 일차 배양물을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 17.5일 차 배아에서 신장을 박리함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 신장 캡슐을 제거하는 것입니다.

그 다음, 신생대(nephrogenic zone)에서 캡 중간엽(cap mesenchyme)과 피질 기질 세포(cortical stroma cells)를 분리하기 위해 장기의 제한적 효소 소화를 수행합니다. 이 절차의 마지막 단계는 세포를 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅된 플레이트에 도말하고 무혈청 배지에서 배양하는 것입니다. 최종적으로, 특정 마커의 면역 염색을 통해 정제된 신생대 세포 집단이 확보되었음을 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 세포 신호 전달을 연구하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포 증식에 필요한 기질 요구 사항을 이해하는 데에도 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 생착 기술의 경우, 절차 시연은 저희 실험실의 테크니션인 Derek Adams와 박사후 연구원인 Aaron Brown이 맡을 것입니다. 필요한 용액을 준비하고 서면 프로토콜에 따라 조직 배양 접시를 처리한 후, E 17.5 단계의 모체 동물을 희생시켜 마우스 배아 신장 박리를 시작하십시오.

기관의 가이드라인에 따라 자궁을 적출하여 수 밀리리터의 docos sate, 완충 식염수 또는 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 시계 제작용 핀셋을 사용하여 각 배아를 꺼내고, 다른 핀셋을 사용하여 머리를 제거합니다. 모든 태아를 자궁에서 꺼내어 머리를 제거한 후, 배아를 충분히 덮을 정도의 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS가 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.

각 배아에서 가능한 한 많은 혈액과 조직 잔해를 남기도록 하며, 포셉을 사용하여 배꼽 높이의 복벽에 원형 절개를 가합니다. 그런 다음 배아를 등 쪽으로 눕히고 한 쌍의 포셉으로 어깨 부분을 고정합니다. 다른 포셉을 사용하여 폐부터 방광까지의 내부 장기를 제거합니다.

신장은 내부 장기 덩어리의 뒷면에 부착되어 있을 것입니다. 다음으로, 신장을 나머지 장기들로부터 조심스럽게 떼어냅니다. 이때 신장들이 서로 연결된 상태를 유지하도록 주의하십시오.

그런 다음 한쪽 핀셋으로 신장 사이의 조직을 잡고, 다른 핀셋으로 신장 캡슐에 부착된 부신을 잡습니다. 신장에서 캡슐을 조심스럽게 벗겨냅니다. 이때 신장이 손상되지 않도록 주의하십시오.

신장뿐만 아니라 아직 붙어 있는 경우 자궁에서도 남아 있는 캡슐을 반드시 제거하십시오. 나머지 신장으로도 동일하게 반복합니다. 마지막으로, 전이 피펫을 적절한 직경으로 자른 다음 신장을 5 mL 폴리스티렌 HBSS 튜브로 조심스럽게 옮기십시오.

각 배아에 대해 신장 분리를 반복하고, 멸균 환경에서 튜브당 최대 8개의 신장이 되도록 한 튜브에 모읍니다. 먼저 피펫을 사용하여 신장이 들어 있는 5 mL 튜브에서 HBSS 용액을 제거하여 효소 소화 과정을 시작합니다. 이때 신장에 닿지 않도록 주의하며, 즉시 1.5 mL의 collagenase(Pancreatin 소화 용액)를 첨가합니다.

각 신장 튜브에 대해 동일하게 반복하고 튜브 캡을 닫습니다. 그 후 37 °C 인큐베이터 내의 교반기에 넣고 15분 동안 배양합니다. 배양이 완료되기 직전에, 수행하는 각 소화 반응당 새로운 5 mL 폴리스티렌 튜브에 1 unit/µL 농도의 DNA 3 µL를 첨가합니다.

배양 후, 인큐베이터에서 소화물을 빠르게 꺼내어 75 µL의 FBS를 첨가하고 세 번 뒤집어 섞습니다. 그리고 실온에서 2분 동안 방치합니다. 그 다음, 세포 현탁액 1.4 mL를 DNAs Mix가 들어 있는 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 37 °C 인큐베이터 내의 로테이터(rotator)에 올려 10분 동안 반응시킵니다.

배양 후, 각 세포 현탁액을 1.5 milliliter 에펜도르프 튜브로 옮기고 325 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로 상층액을 제거하고, 튜브를 325 ×g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 피펫팅을 5~6회 반복하여 펠릿을 1 milliliter의 5% FBS-HBS에 재현탁합니다.

다음 샘플로 이동하기 전 각 튜브의 캡을 닫으십시오. 원심분리가 끝난 후 SNAT를 제거하고, 모든 튜브에 배지를 넣은 뒤 각 튜브에 첨가제가 포함된 KSFM 500 microliters를 추가합니다. 1 mil liter 마이크로 파이펫으로 5~6회 파이펫팅하여 각 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 모든 세포 현탁액을 새로운 5 milliliter 폴리스티렌 튜브에 합칩니다.

이제 세포 현탁액을 미리 적신 40 micron 세포 스트레이너 캡으로 여과하고, 통과액을 새로운 폴리스티렌 튜브에 수집합니다. 모든 통과액을 수집한 후에는 피펫 팁이 스트레이너에 닿지 않도록 주의하십시오. 수집된 통과액을 새로운 미리 적신 세포 스트레이너로 한 번 더 여과합니다.

스트레이너를 제거하고 새로운 튜브의 멸균 캡으로 튜브를 닫습니다. 세포 수를 측정하여 파이버 인코딩 배양 플레이트의 첨가제가 포함된 KSM 배지에 제곱센티미터당 100, 000에서 200, 000 cells의 밀도로 플레이팅합니다. 실험을 위한 자극을 주기 전, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건의 습윤 인큐베이터에서 2~4시간 동안 신장 형성 구역 세포가 회복되고 부착되도록 합니다.

여기에 표시된 것은 $\text{cm}^2$당 200,000개의 세포로 도말하여 24시간 동안 배양한 신발생구역 세포의 위상차 20배율 이미지입니다. 이 이미지에서 신발생구역 세포는 네프론 전구세포에 특이적인 anti PAX2 항체로 염색되어 적색으로 표시되었으며, 핵은 DAPI로 대조 염색되어 청색으로 표시되었습니다.

40배 배율에서 관찰한 네프론 전구세포 클러스터의 위상차 현미경 사진입니다. 특이성을 추가로 입증하기 위해, 기질 세포군에서 발현되는 Fox D1 프로모터의 제어를 받는 laxy가 도입된 배아에서 신장 형성 구역 세포를 분리하였습니다. 그 후 발달 중인 신장의 신장 형성 구역 내 세포들을 DAPI(핵, 청색), phalloidin(F-actin, 녹색) 및 anti-beta lactase(적색)로 염색하였습니다.

숙련되면 약 2시간 만에 신성 구역(nephrogenic zone) 세포의 단층 일차 배양물을 생성할 수 있습니다. 이러한 배양물은 바이러스 형질도입, 재조합 단백질 처리 및 소분자 화합물 처리에 매우 용이하여, 네프론 전구세포 발달 과정의 세포 신호 전달 경로에 대한 신속하고 효율적인 고속 대량 분석 연구를 가능하게 합니다. 또한, 추가적인 세포 분류 절차를 통해 이러한 배양물에서 특정 세포 유형을 분리해 낼 수 있습니다.