수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

다음 실험의 전반적인 목적은 마우스 배아 줄기 세포를 다양한 원시 및 확정 조혈 계통으로 분화시키는 것입니다. 모든 ES 세포 유래 세포를 특성 분석하기 위해, 형광 표지된 M strawberry OP9 기질 세포 층이 confluence 상태로 형성된 곳에 ES 세포를 배치하여 마우스 조혈 세포 분화를 유도합니다. 분화 또는 공동 배양의 각 일수는 적절한 회수 시점에서의 다양한 조혈 발달 단계를 나타냅니다.

분화된 ES 세포 자손은 세포 분류법을 통해 M strawberry OP nine 기질 세포주로부터 분리할 수 있습니다. 이 ES 분화 프로토콜은 생체 내(in vivo)에서 관찰되는 원시 및 최종 조혈 작용을 재현하며, 배아를 사용하지 않고도 녹아웃 ES 세포주와 관련된 조혈 결함을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center의 Judith Gassen 박사 연구실에 오신 것을 환영합니다.

제 이름은 Alicia Poz입니다. 오늘 제가 보여드릴 기술이 기존의 OP9 공배양법에 비해 갖는 주요 장점은, 이 절차를 통해 5일 차 및 8일 차의 모든 세포를 계대 배양할 수 있으며, 모든 ES 유래 자손 세포를 완전히 분리할 수 있다는 점입니다. OP9 기질로부터, OP9 세포 배양 배지에서 OP9 세포를 배양하며, 배지는 2일마다 교체해야 합니다.

OP9 세포는 공동 배양에 필요하기 3일 전에 계대 배양해야 합니다. 유지 관리 과정에서 OP9 세포의 밀도가 90% 합류도(confluency)를 초과하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 먼저 PBS로 세포를 2회 세척한 다음, 예열된 0.1% trypsin EDTA를 가하고 5분간 반응시켜 세포를 탈착시킵니다. OP9 세포 배양액을 첨가한 후 세포를 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후 상온에서 300 G로 5분간 튜브 내 세포를 펠렛화하고, 상층액을 제거한 뒤 신선한 M strawberry OP9 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 공동 배양 실험이 시작되는 날에 세포를 최소 10⁴ cells/cm²의 밀도로 플레이트에 분주합니다. 3일 전에 계대 배양한 OP9 세포는 합류(confluent) 상태여야 합니다. ES 세포는 해당 세포주에 맞는 표준 프로토콜에 따라 배양해야 합니다.

ES 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.25% Trypsin EDTA로 처리한 후 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, ES 세포에 공배양 분화 배지를 첨가하고 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 상온에서 400 ×g로 5~7분 동안 원심분리하여 ES 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 제거한 후 ES 세포를 공동 배양 분화 배지에 재현탁합니다. 21게이지 뭉툭한 바늘(blunt end needle)을 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

이제 M strawberry 플라스크를 꺼냅니다. 인큐베이터에서 OP nine 세포를 꺼내십시오. OP nine 세포에서 배지를 제거하고 플라스크 플레이트에 공배양 분화 배지를 추가합니다.

각 M strawberry OP nine 세포 플라스크에 cm²당 1×10³개의 ES 세포를 접종합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 및 습도가 유지되는 환경에서 배양합니다. 이때가 0일 차이며, 공배양 상태는 다음과 같아야 합니다. ES M strawberry OP nine 공배양 시작 후 3일이 지난 모습입니다.

경계가 뚜렷하고 대부분 크고 평평한 ES 유래 자손 클러스터가 관찰되며, 일부 세포들은 소용돌이 모양을 형성하기 시작할 것입니다. 공동 배양 시작 5일 후에 공동 배양액을 조심스럽게 제거하고 신선한 분화 배지로 교체하십시오. 합류된 OP9 세포 층 위에서 ES 세포가 적절히 분화되면, 세포들이 겹겹이 쌓인 소용돌이 형태로 나타나는 조혈모세포(hemangioblasts)가 생성됩니다.

이 절차에서 가장 중요한 점은 공동 배양 5일 차에 적절한 분화가 일어났는지 확인하는 것입니다. 이 시점에는 인간 배아세포(eblast) 콜로니를 현미경뿐만 아니라 육안으로도 확인할 수 있습니다. PBS로 공동 배양물을 조심스럽게 2회 세척하고, 0.25% trypsin EDTA로 세포를 트립신 처리합니다. ES 분화 배지로 플라스크에서 세포를 세척하여 튜브로 옮긴 후, 상온에서 400 G로 7분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가합니다. 그런 다음 21 gauge 둔탁한 바늘(blunt ended needle)을 사용하여 세포를 재부유시키며, 단일 세포 현탁액 상태인지 확인하기 위해 혈구계수기(hemocytometer)로 세포 수를 측정합니다. 0일 차 대비 ES 세포 수는 100에서 150배 증가해야 합니다. 8일 또는 9일 차에, 합류(confluent)된 새로운 M strawberry OP nine 세포 층 위에 공동 배양 세포를 다시 파종하고, 12일 차에 세포 수를 다시 측정합니다. 조혈 세포가 포함된 배지를 제거하여 따로 보관합니다.

부유 상태의 조혈 세포를 제거하기 위해 단층 세포를 PBS로 한 번 세척하고 보존합니다. 플라스크에 0.25% trypsin EDTA를 첨가하고, trypsin에 의해 부착 세포가 떨어져 나오면 ES 분화 배지로 세척하여 부유 상태의 조혈 세포와 합칩니다. 실온에서 400 G로 7분 동안 세포를 원심분리합니다. 마지막으로 21 gauge blunt end needle을 사용하여 세포를 재현탁하고 세포 수를 측정합니다. 이제 세포를 다시 배양하거나 후속 분석에 사용할 수 있습니다.

ES M strawberry OP nine 공배양 시스템은 서술된 조혈 발달 모델링에 사용될 수 있습니다. 여기서는 분화된 ES 자손 세포를 새로운 M strawberry OP nine 세포로 옮겨야 하는 공배양 시간 경과 일수에 대한 개요가 제시되어 있습니다. M strawberry OP nine 세포의 합류층 위에서 ES 세포가 적절하게 분화되면 flick one 양성 세포가 생성됩니다.

공배양 5일 차의 혈관모세포(angioblasts)입니다. 인간 골모세포는 내피 및 조혈 계통의 공통 중배엽 전구세포이며, 이 이미지에서 보는 바와 같이 세포들이 층층이 쌓인 소용돌이 형태로 나타나야 합니다. 공배양이 진행됨에 따라 6일 또는 7일 차에는 2~4개의 세포로 이루어진 클러스터가 나타나며, 이는 더 큰 세포 클러스터로 성장합니다. 조혈 전구세포는 6일 차까지 나타나며, 최종 분화된 조혈 계통은 14일 차까지 나타납니다.

반면, ESL 분화가 부적절하게 이루어진 공동 배양의 경우, 5일째에 월드 패턴(world pattern)이 나타나지 않는 ES 유래 자손이 생성됩니다. 월드 패턴 내에 세포가 없다는 것은 GIO 블라스트(blast) 형성이 부적절했음을 나타냅니다. eblast 형성이 부적절한 공동 배양은 궁극적으로 조혈 계통 분화의 저해를 초래하므로, 본 수정된 ES OP nine 공동 배양 프로토콜에서는 이를 폐기해야 합니다.

ES 유래 자손 세포는 m strawberry 음성이며, M strawberry 양성 세포로부터 유세포 분석(flow sorting)을 통해 분리할 수 있습니다. 평가를 위해 공동 배양 중 어느 날이라도 9개의 세포를 수집하십시오. 여기에는 대표적인 실험 결과가 제시되어 있습니다.

이전에 발표된 ES OP 9 공배양 프로토콜들은 오직 비부착성 부유 세포의 계대 배양과 평가에만 집중해 왔습니다. 이 수정된 프로토콜에서는 부착성 및 비부착성 세포를 포함한 모든 ES 유래 세포를 계대 배양하고 평가할 수 있습니다. 이를 통해 조혈 세포의 수율을 높일 수 있고, 희귀 세포군을 식별할 수 있으며, 조혈성 및 비조혈성 세포를 모두 포함한 모든 ES 자손 세포에 대한 완전한 특성 분석이 가능해집니다.