Name: 수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 수정된 ES/OP9 공동 배양 프로토콜을 통해 조혈계로 분화하는 방법을. 이 기술은 모든 ES 유래 후세포를 완전히 평가하여 조혈 발생 및 결함 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 설치 및 mStrawberry OP9 세포 라인의 테스트 U. Ganapati 감사합니다. 또한, 우리는 공동 문화와 H. Shafifor 한테 도움을 주셔서 감사합니다. HP는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (F31HL087714) (HP)의 화목에 의해 지원됩니다. 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐, 그리고 혈액 연구소 또는 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. UCLA의 유동세포계측법 핵심 시설은 NIH (CA - 16042 및 AI - 28697), 존슨 암 센터, UCLA 에이즈 연구소와 의학의 UCLA 학교에서 지원됩니다.

1. ES 세포의 준비 <ol><li> 특정 세포 라인에 대한 표준 프로토콜에 따라 문화 ES 세포. 일 0 mStrawberry OP9 세포의 접시에 충분한 ES 세포를 준비하십시오 (ES 세포는 일 0 cm 2 당 1x10 ^ 3 세포에서 도금됩니다) </li></ol> 2. OP9 세포의 준비 <ol><li> 성장 mStrawberry OP9 세포 전에 OP9 성장 미디어를 준비 OP - 9 세포 배양 매체 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 재고 </td><td> 최종 CONC. </td><td> 볼륨 (ML) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS (OP - 9 테스트) </td><td> 백퍼센트 </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 100X (200mM) </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table> 4 스토어 ° C와 준비 후 일주일 이내에 사용 </li><li> mStrawberry OP9 세포를 유지하기 위해, 미디어, 2 일마다 변경해야하며 세포는 사전 (confluency 70~90%에서 subculture) confluency 도달 세포 subcultured해야합니다. 이 adipocytes에 자신의 차별을 초래할 수 있으므로 mStrawberry OP9 세포 문화는 confluency 90% 벗어났소되지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오. <ol class="lalpha"><li> PBS (또는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS + 0.1 % 1X와 1X)와 배 세척 세포 Subculture 세포 </li><li> 37 미리 예열 0.1 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° 5 분 C (또는 셀 분리까지) </li><li> 세포가 분리되면 OP - 9 성장 매체를 추가합니다. 50mL 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 상온에서 5 분 300 XG에 펠렛 전지는. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 신선한 mStrawberry OP9 성장 매체 Resuspend 세포 </li><li> 10 4 세포 / cm 2의 최소 밀도에서 플레이트 세포 </li><li> 공동 culturing의 ES 세포 (주 0, 5 일, 또는 실험의 Day8 / 9)에 필요한 일 이전에 삼일 시작 confluency에 mStrawberry OP9 세포 성장 </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 공동 문화 <ol><li> 공동 문화 차별 미디어 준비 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 재고 </td><td> 최종 </td><td> 볼륨 (ML) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 백퍼센트 </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 200mM </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 세포 (데이 -3) <ol class="lalpha"><li> 항상 주 -3에 OP9 세포가 공동 문화의 주 0 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고 있도록 Subculture. 그림 4B를 참조하십시오. 일 0 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry는 OP9 세포. 5 일 및 공동 문화의 지속을위한 일 9분의 8에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 설정 (데이 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> PBS로 2X ES 세포 와시 </li><li> 5 분 @ 37에 대한 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 부화와 ES 세포를 Trypsinize ° C </li><li> 세포에 공동 문화 차별 미디어 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 ES 세포, 5 - 7min, RT. 뜨는 취소 </li><li> 공동 문화 차별화 미디어에 Resuspend 세포 </li><li> mStrawberry OP9 세포에서 미디어를 제거 </li><li> mStrawberry OP9의 flasks에 공동 문화 차별 미디어 추가 </li><li> mStrawberry OP9 세포의 플라스크에 플레이트 1x10 3 ES 세포 / cm 2. 37 세포를 품어 ° C 5 % 습도 CO 2. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 전지 (주 2) <ol class="lalpha"><li> Subculture의 mStrawberry OP9가 그래서 당신은 공동 문화의 날 5 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고. 주 5 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry은 OP9 세포 (단계 3.2 등). 일 9분의 8 필요한 경우 (같은 단계 2.2)에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다. </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (3 일) <ol class="lalpha"><li> 조심스럽게 공동 문화 매체를 제거하고 신선한 공동 문화 차별화 매체로 교체 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (5 일) <ol class="lalpha"><li> 조심스럽게 PBS로 2 배 공동 문화를 씻어 </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 세포 Trypsinize </li><li> 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻어 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소 </li><li>세포에 공동 문화 차별 미디어를 추가. 세포를 resuspend하고 단일 세포 현탁액에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘을 사용 bluntended </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 주 0에서 ES 세포 번호 100-150 배 증가 있어야합니다. </li><li> 다시 씨앗 6.48x10 4 / cm 2 - 합류, mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 7.76x10 4 / cm 2 공동 문화 전지 </li><li> 일 5 ASSAYS - 남은 공동 문화 전지는 유동세포계측법 분석, cytopreps (30K 세포), 칩 assays 등을 사용할 수 있습니다 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (주 9분의 8 앤드 데이 12) <ol class="lalpha"><li> 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. 서스펜션의 조혈 세포를 제거하는 PBS로 세척 monolayer 1X가. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오. </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize </li><li> ES의 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지 = 발견 조혈 세포에 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소 </li><li> 세포에 공동의 문화 분화 미디어 또는 PBS를 추가합니다. 셀을 resuspend하고 hemocytometer를 사용하여 단일 세포 현탁액의 개수 세포에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘 bluntended을 사용합니다. </li><li> 공동 문화 일 12 일에 다시 다음 주 8 9 합류, mStrawberry OP9 세포의 새 레이어에 다시 시딩 공동 문화 세포에 의해 더 성숙 조혈 progenitors을 평가하고 14 일 동안 계속하실 수 있습니다. 분석의 하루 필요한 세포 회복에 따라 다시 씨앗 최적의 핸드폰 번호. </li></ol></li><li> ES - 파생 자손 (주 1-14)의 평가. ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포 (ES - 파생 자손) 밖으로 정렬 흐름 공동 문화의 모든 일에 평가할 수있다. <ol class="lalpha"><li> 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. PBS로 세척 monolayer 1X는 정지 조혈 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오. </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize </li><li> 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지에있는 조혈 세포에 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포, 7min, RT. 뜨는 취소 </li><li> 21 게이지 바늘 bluntended 및 계산과 셀 Resuspend </li><li> ES - 파생 자손 (mStrawberry 부정적인 세포)는 mStrawberry 긍정적인 OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. ES - 파생 자손은 다음 유동세포계측법 분석, cytopreps, 칩 assays 등 특색 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. ES / mStrawberry OP9 공동 문화 시스템. 우리 연구실 모델 조혈 개발에 체외 ES 세포 공동 배양 시스템을 사용합니다. mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어에 배치 때이 공동 문화 시스템에서 ES 세포는 Day5에서 hemangioblasts로, 차별. 말기 차별화된 조혈 lineages은 주 14 나타나는 동안 공동 문화가 진행되는 동안, 조혈 성의 전구 물질은 8 일 현재입니다. 필요에 mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 합류 ES - 파생 자손의 passaging 때 화살표가 차별화의 일 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 적절한 ES 세포 차별화. ES 세포는 일 0 mStrawberry OP9의 합류 계층에 씨앗을 품고있다. ES - 파생 자손은 ES - 파생 자손이 정의된 테두리와 셀 클러스터처럼 보이는 또는 소용 돌 이꼴 패턴을 형성하기 시작과 분화의 날 3 표시되기 시작합니다. 5 일째에 세포의 whorls을 쌓아으로 내피와 조혈 lineages에 대한 일반적인 mesodermal 전구체 아르 Hemangioblasts는 나타납니다. 오일 이상 공동 문화 기간 동안, ES - 유래 자손은 조혈 세포의 클러스터로 나타납니다. 두 시간 내지 네 단세포 클러스터, 6 일 7 /, 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 휴대 클러스터로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 레이어 바운드 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 이 공동의 문화에서 실패한 ES 세포 차별화. 결과 부적 절한 ES 세포의 차별을 반영합니다. ES - 파생 자손은 5 일에 소용 돌 이꼴 무늬에 나타나지 어떻게 있습니다. 소용 돌 이꼴 무늬에 세포의 부재는 부적 절한 hemangioblast 형성을 나타냅니다. hemangioblast이 제대로 개발하지 않으면, 다음 공동 문화 저하 조혈성 혈통 차별집니다 계속했다. 부적 절한 hemangioblast 형성 공동 문화가 폐기해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. mStrawberry OP9 세포 문화. (A) mStrawberry OP9 세포가에 subcultured 아르confluency 70~90%. (B) 적절한 차별 화를위한, ES 세포와 ES - 파생 자손은 mStrawberry OP9 세포 지나치게 합류 계층에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 대표 ES / mStrawberry OP9 공동 문화 흐름 프로필. 모든 ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포이고 mStrawberry OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. mStrawberry 부정적인 세포 게이트는 전통적인 ES/OP9 공동 문화를 사용하여 결정되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

공동 문화의 날 5 Flk1 이상 hemangioblasts의 생산에 mStrawberry OP9 세포 결과 합류 레이어에 ES 세포의 적절한 분화. Hemangioblasts는 그림 1에서 관찰된 세포의 whorls을 쌓여 나타납니다. 공동 문화의 나머지 내용은 보이지 ES - 파생 자손은 조혈 세포의 클러스터 (그림 1)과 같이 나타납니다. Day6 / 7 2-4 셀 클러스터가 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 세포 클러스터 (자기편과 정지에 모두)로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 계층 내에서 바운드 볼 수 있습니다. 프로토콜에 표시되지 않지만, 그것은 FBS가 ES 성장 매체, mStrawberry OP9 성장 매체와 ES / mStrawberry OP9 차별화 미디어에서 사용되는 미리 테스트하는 것이 중요합니다. 제대로 혈청 분화의 5 일 전까지 공동 문화에 적절한 mStrawberry OP9 세포의 성장뿐만 아니라, ES 세포의 적절한 분화를 보장해야 테스트. 대안 또는 mStrawberry OP9 세포 이외에, OP9 전지 전에 (7.8x10 4 셀 / cm 2) confluency에서 시딩하기 위해 8000 래드에서 조사 수 있습니다. OP9 세포의 조사는 하류 assays에서 OP9 세포를 오염, 이전의 거의 완전한 제거를 허용뿐만 아니라, 반복 replating 단계의 제거를 허용합니다. OP9 세포가 CMV 프로 모터의 제어 (pRRLsin - CMV 벡터, UCLA 벡터 코어) 아래 lentiviral 벡터 표현 mStrawberry의 3ug/mL와 OP9 세포 transducing하여 mStrawberry 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜은 세포 통로에서 OP9 세포를 오염 오래된 줄이기 위해뿐만 아니라, 합류 레이어 OP9 세포에 5 일 replating 단계를 ES 세포의 위치를​​ 수반. 또한, 정지에서 발견 유일한 조혈 세포 ES - 파생 자손의 평가를 위해 제거됩니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 모두 하나가 잠재적인 개발의 상당수 ES - 파생 조혈 세포를 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해 우리 실험실 OP9 세포를 mStrawberry - 표현의 사용을 통해, 수정 공동 문화를 사용합니다. 이것은 모든 ES의 자손은 매일 5 시에 공동 문화의 지속으로 전송됩니다 것을 보장하고, 하류 assays 모든 ES - 파생 자손의 수확. 이 수정은 인간 및 마우스의 ES 라인 모두에서 파생된 조혈 자손의 평가와 특성화에 유용한 도구를 제공합니다. 다양한 단계와 최종 원시 조혈이 ES - mStrawberry OP9 공동 문화 모델 recapitulates. 조혈 개발의 초기 단계를 공부에 많은 사람들이 ES 세포에서 hemangioblast의 발전을 평가 BL - CFC (콜로니 형성 세포 블래스트와 같은) 분석을 사용합니다. 초기 조혈 개발을 조사 때 BL - CFC 분석이 유용한 도구이지만 그것이 hemangioblast의 평가뿐만 아니라, 더 많은 성인 조혈 lineages을 허용으로 mStrawberry - ES 공동 문화 시스템은 증가 유틸리티를 전시하고있다. 전통 OP9/ES 및 EB 차별 프로토콜을 사용하여 이전 작업 순서 등 HoxB4의 overexpression로, 아마도 필요한 추가 요소가 체외에서 조혈 줄기 세포를 repopulating 장기 파생 것으로 나타났습니다. 추가 작업은 mStrawberry 부정, 정렬 ES - 파생 인구 사실 조혈 줄기 세포를 포함 여부를 평가하는 것이 필요합니다.

OP - 9 셀 유지 보수 중 스톡 구성 요소 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 오메가 과학 </td><td> FB01 </td><td> 사전 테스트 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 세포 차별화 미디엄 스톡 구성 요소 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> 사전 테스트 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200mM </td></tr><tr><td> PBS (CA이없는 +와 MG 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr></tbody></table>

수정 es / op9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

생체내 및 배아 lethalities 처리하지 않고, 조혈에 관련된 최초의 유전자를 특성화에 대한 액세스하기 어렵습니다 세포 인구를 공부하면 조혈 세포의 운명으로 ES 세포의 체외에서 차별에 유용합니다. OP9 stromal 세포 라인 M - CSF 기능 부족 osteopetrosis 돌연변이 생쥐의 calvaria에서 파생되는 등 ES/OP9 공동 문화 시스템은 원래, macrophages의 이상 생산하지 않고, 조혈 자손을 생산하도록 설계되었습니다. 체외 ES/OP9 공동 문화 시스템은 초기 조혈 발전을 요점을 되풀이하기 위해 사용할 수 있습니다. OP9 stromal 세포에 교양하면, ES 세포는 Flk - 1 + hemangioblasts, 조혈 progenitors, 마침내 성숙, 말기 차별 lineages로 구분. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜 OP9 세포의 합류 계층에 ES 세포의 위치를​​ 알아볼 수, OP9 세포를 오염 오래된 제거하기 위해뿐만 아니라, 정기 replating 단계를 반복합니다. 또한, 현재의 프로토콜은 정지에서 발견은 조혈 세포를 평가 참여하고 분화의 각 하루 ES - 파생 자손의 평가에 최적화된되지 않습니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 하나의 가능성이 ES - 파생 자손과 조혈 세포를 개발의 큰 부분을 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 여기 하류 assays에서 OP9 세포 오염의 제거를 허용 수정 ES / mStrawberry OP9 공동 문화를 설명합니다. 이 방법은 더 직접적으로 배아 내에서 관찰 조혈성 차별화 패턴에 해당하는 조혈 차별화 패턴의 결과로, 공동 문화의 모든 일에 모든 ES - 파생 자손의 전체 평가 수 있습니다.

mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES - 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.

수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

ES 세포를 조혈 세포 운명으로 체외 분화시키는 것은 체내에서 접근하기 어려운 세포 집단을 연구할 때 유용합니다...

다음 실험의 전반적인 목적은 마우스 배아 줄기 세포를 다양한 원시 및 확정 조혈 계통으로 분화시키는 것입니다. 모든 ES 세포 유래 세포를 특성 분석하기 위해, 형광 표지된 M strawberry OP9 기질 세포 층이 confluence 상태로 형성된 곳에 ES 세포를 배치하여 마우스 조혈 세포 분화를 유도합니다. 분화 또는 공동 배양의 각 일수는 적절한 회수 시점에서의 다양한 조혈 발달 단계를 나타냅니다.분화된 ES 세포 자손은 세포 분류법을 통해 M strawberry OP nine 기질 세포주로부터 분리할 수 있습니다. 이 ES 분화 프로토콜은 생체 내(in vivo)에서 관찰되는 원시 및 최종 조혈 작용을 재현하며, 배아를 사용하지 않고도 녹아웃 ES 세포주와 관련된 조혈 결함을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center의 Judith Gassen 박사 연구실에 오신 것을 환영합니다.제 이름은 Alicia Poz입니다. 오늘 제가 보여드릴 기술이 기존의 OP9 공배양법에 비해 갖는 주요 장점은, 이 절차를 통해 5일 차 및 8일 차의 모든 세포를 계대 배양할 수 있으며, 모든 ES 유래 자손 세포를 완전히 분리할 수 있다는 점입니다. OP9 기질로부터, OP9 세포 배양 배지에서 OP9 세포를 배양하며, 배지는 2일마다 교체해야 합니다.OP9 세포는 공동 배양에 필요하기 3일 전에 계대 배양해야 합니다. 유지 관리 과정에서 OP9 세포의 밀도가 90% 합류도(confluency)를 초과하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 먼저 PBS로 세포를 2회 세척한 다음, 예열된 0.1% trypsin EDTA를 가하고 5분간 반응시켜 세포를 탈착시킵니다. OP9 세포 배양액을 첨가한 후 세포를 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.원심분리 후 상온에서 300 G로 5분간 튜브 내 세포를 펠렛화하고, 상층액을 제거한 뒤 신선한 M strawberry OP9 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 공동 배양 실험이 시작되는 날에 세포를 최소 10⁴ cells/cm²의 밀도로 플레이트에 분주합니다. 3일 전에 계대 배양한 OP9 세포는 합류(confluent) 상태여야 합니다. ES 세포는 해당 세포주에 맞는 표준 프로토콜에 따라 배양해야 합니다.ES 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.25% Trypsin EDTA로 처리한 후 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, ES 세포에 공배양 분화 배지를 첨가하고 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 상온에서 400 ×g로 5~7분 동안 원심분리하여 ES 세포를 펠릿화합니다.상층액을 제거한 후 ES 세포를 공동 배양 분화 배지에 재현탁합니다. 21게이지 뭉툭한 바늘(blunt end needle)을 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 트라이판 블루(trypan blue)와 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.이제 M strawberry 플라스크를 꺼냅니다. 인큐베이터에서 OP nine 세포를 꺼내십시오. OP nine 세포에서 배지를 제거하고 플라스크 플레이트에 공배양 분화 배지를 추가합니다.각 M strawberry OP nine 세포 플라스크에 cm²당 1×10³개의 ES 세포를 접종합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 및 습도가 유지되는 환경에서 배양합니다. 이때가 0일 차이며, 공배양 상태는 다음과 같아야 합니다. ES M strawberry OP nine 공배양 시작 후 3일이 지난 모습입니다.경계가 뚜렷하고 대부분 크고 평평한 ES 유래 자손 클러스터가 관찰되며, 일부 세포들은 소용돌이 모양을 형성하기 시작할 것입니다. 공동 배양 시작 5일 후에 공동 배양액을 조심스럽게 제거하고 신선한 분화 배지로 교체하십시오. 합류된 OP9 세포 층 위에서 ES 세포가 적절히 분화되면, 세포들이 겹겹이 쌓인 소용돌이 형태로 나타나는 조혈모세포(hemangioblasts)가 생성됩니다.이 절차에서 가장 중요한 점은 공동 배양 5일 차에 적절한 분화가 일어났는지 확인하는 것입니다. 이 시점에는 인간 배아세포(eblast) 콜로니를 현미경뿐만 아니라 육안으로도 확인할 수 있습니다. PBS로 공동 배양물을 조심스럽게 2회 세척하고, 0.25% trypsin EDTA로 세포를 트립신 처리합니다. ES 분화 배지로 플라스크에서 세포를 세척하여 튜브로 옮긴 후, 상온에서 400 G로 7분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가합니다. 그런 다음 21 gauge 둔탁한 바늘(blunt ended needle)을 사용하여 세포를 재부유시키며, 단일 세포 현탁액 상태인지 확인하기 위해 혈구계수기(hemocytometer)로 세포 수를 측정합니다. 0일 차 대비 ES 세포 수는 100에서 150배 증가해야 합니다. 8일 또는 9일 차에, 합류(confluent)된 새로운 M strawberry OP nine 세포 층 위에 공동 배양 세포를 다시 파종하고, 12일 차에 세포 수를 다시 측정합니다. 조혈 세포가 포함된 배지를 제거하여 따로 보관합니다.부유 상태의 조혈 세포를 제거하기 위해 단층 세포를 PBS로 한 번 세척하고 보존합니다. 플라스크에 0.25% trypsin EDTA를 첨가하고, trypsin에 의해 부착 세포가 떨어져 나오면 ES 분화 배지로 세척하여 부유 상태의 조혈 세포와 합칩니다. 실온에서 400 G로 7분 동안 세포를 원심분리합니다. 마지막으로 21 gauge blunt end needle을 사용하여 세포를 재현탁하고 세포 수를 측정합니다. 이제 세포를 다시 배양하거나 후속 분석에 사용할 수 있습니다.ES M strawberry OP nine 공배양 시스템은 서술된 조혈 발달 모델링에 사용될 수 있습니다. 여기서는 분화된 ES 자손 세포를 새로운 M strawberry OP nine 세포로 옮겨야 하는 공배양 시간 경과 일수에 대한 개요가 제시되어 있습니다. M strawberry OP nine 세포의 합류층 위에서 ES 세포가 적절하게 분화되면 flick one 양성 세포가 생성됩니다.공배양 5일 차의 혈관모세포(angioblasts)입니다. 인간 골모세포는 내피 및 조혈 계통의 공통 중배엽 전구세포이며, 이 이미지에서 보는 바와 같이 세포들이 층층이 쌓인 소용돌이 형태로 나타나야 합니다. 공배양이 진행됨에 따라 6일 또는 7일 차에는 2~4개의 세포로 이루어진 클러스터가 나타나며, 이는 더 큰 세포 클러스터로 성장합니다. 조혈 전구세포는 6일 차까지 나타나며, 최종 분화된 조혈 계통은 14일 차까지 나타납니다.반면, ESL 분화가 부적절하게 이루어진 공동 배양의 경우, 5일째에 월드 패턴(world pattern)이 나타나지 않는 ES 유래 자손이 생성됩니다. 월드 패턴 내에 세포가 없다는 것은 GIO 블라스트(blast) 형성이 부적절했음을 나타냅니다. eblast 형성이 부적절한 공동 배양은 궁극적으로 조혈 계통 분화의 저해를 초래하므로, 본 수정된 ES OP nine 공동 배양 프로토콜에서는 이를 폐기해야 합니다.ES 유래 자손 세포는 m strawberry 음성이며, M strawberry 양성 세포로부터 유세포 분석(flow sorting)을 통해 분리할 수 있습니다. 평가를 위해 공동 배양 중 어느 날이라도 9개의 세포를 수집하십시오. 여기에는 대표적인 실험 결과가 제시되어 있습니다.이전에 발표된 ES OP 9 공배양 프로토콜들은 오직 비부착성 부유 세포의 계대 배양과 평가에만 집중해 왔습니다. 이 수정된 프로토콜에서는 부착성 및 비부착성 세포를 포함한 모든 ES 유래 세포를 계대 배양하고 평가할 수 있습니다. 이를 통해 조혈 세포의 수율을 높일 수 있고, 희귀 세포군을 식별할 수 있으며, 조혈성 및 비조혈성 세포를 모두 포함한 모든 ES 자손 세포에 대한 완전한 특성 분석이 가능해집니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 비디오는 백혈병 세포와 골수 기질 세포의 장기 2D 공동 배양 기술을 설명하여 골수 미세환경과의 상호 작용을 연구합니다. 2D 공동 배양 모델은 종양 세포 표현형에 영향을 미치는 급성 림프모구 백혈병 세포와 골수 기질 또는 조골세포를 활용합니다. 이 연구는 화학 요법에 노출되는 동안 백혈병 세포의 생존을 지원하는 골수의 기초가 되는 메커니즘에 대한 조사를 지원할 것입니다.

백혈병 세포와 BMSC의 2D 공동 배양: 백혈병 세포의 하위 집단을 얻는 방법

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

불멸의 다능 난이전구세포(iMOP) 세포와 이암 분화를 유지하기 위한 현재 프로토콜에 대해 설명합니다.  감각 상피(sensory epithelia)와 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로의 분화를 나타내는 배양 조건과 분자 마커가 강조되어 있습니다.

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

조 혈 줄기에 규제 요인 및 신호 통로의 효과 결정 하 식 분석, 문화와 비장, 장기 재구성에 콜로 니 형성 단위에 대 한 교양된 대동맥-생식-Mesonephros를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다. 셀 개발입니다. 이 조 혈 줄기 세포 생물학을 연구 하 고 기능에 대 한 효과적인 시스템으로 입증 되었습니다.

대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

학습하세요 수정된 ES/OP9 공동 배양 프로토콜을 통해 조혈계로 분화하는 방법을. 이 기술은 모든 ES 유래 후세포를 완전히 평가하여 조혈 발생 및 결함 연구에 활용할 수 있습니다.

수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

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