Name: 망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 눈 해부 기법으로 망막 색소 상피 전체 마운트를 제작하는 방법을. 이 기술은 망막 발달 및 질병 연구에 필수적인 고품질 조직 샘플 확보에 활용됩니다.

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이 작품은 환경 건강 과학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [K22ES012264에 AJRB]와 미국 암 협회 InstitutionalResearch 그랜트 [ACS - IRG - 00 - 173-04] 조종사 projectaward [AJRB에]. 우리는하지 말아야 할 걸의 예를 들어, 원고 특히 비디오와 아담 브라운에 대한 의견의 중요한 독서에 대한 주교의 실험실의 구성원을 또한 감사드립니다. 우리는 우리에게 해부 비디오 촬영을위한 카메라 설정 그의 해부 범위 / 비디오의 사용을 허용을위한 Greehey 어린이 암 연구소의 박사 도널드 맥유언 감사합니다. 우리는 선명하게 우리의 microdissection 도구의 수리를 위해 코르테 악기에서 Daron 브라운 감사합니다.

1. 눈 밖에서 관계없는 조직을 제거 <ol><li> 35mm 접시의 뚜껑에 1X PBS 하거라. 수준은 뚜껑의 입술 아래에 있어야합니다. </li><li> 35mm 접시에 저장 튜브에서 바로 포셉, 전송 아이 (들)을 사용합니다. 1 : 눈이 두 가지 이유로 PBS에 빠져들 수 있습니다. 당신이보고 쉽게 제거 2 수 있도록 외부 조직의 눈을 멀리 "떠"것입니다. 정지 상태에서 해부하는 동안 눈을 자연스럽게 당신은 반대보다는 이런 형상 작업 수 있도록, 자사의 구형 형태를 유지합니다. </li><li> 직각 포셉 (45 ° 15 °)의 두 쌍을 이용하여 부드럽게 (각막쪽으로 IE) 성미 조직을 떼어, 가능한 한 많은 근육과 결합 조직으로 제거합니다. 일부 결합 조직은 남아있게됩니다. 노력 가능한 거의 같은 눈알을 쥐어 짜기로하여야한다. </li><li> 스프링 가위에 대한 15 ° 포셉을 무역. 45 °의 집게와 함께 지속적인 눈을 가지고 있지만, 나머지 근육 및 결합 조직뿐만 아니라 시신경을 떼어 버리기 봄 가위를 사용합니다. * 도움말 : 트림 다음 성미 조직을 밀어 가위의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 (corneo - scleral 나누어 방향)합니다. 모든 외부 조직이 눈에에서 제거되었습니다 때까지 계속합니다. </li></ol> 2. 각막과 렌즈를 제거 <ol><li> 최대 직면하고있는 각막으로 각막의 중심에 작은 배를 공략하기 위해 45 °의 집게를 사용합니다. </li><li> 봄 가위를 사용하여 플랩의 바닥에 작은 절개를합니다. 플랩을 가자. </li><li> 눈을 개최하는 것은 여전히​​ 집게와 가위로 낮은 날개를 삽입하고 수직 절개와 corneo - scleral 나누어 방향으로 절단합니다. 각막과 홍채가 모두 절단되도록 홍채 아래 낮은 블레이드를 유지하려고합니다. corneo - scleral 분열 모든 방법을 절단하지 마십시오. 눈에 삽입 가위 보관하십시오. </li><li> 당신의 45 °의 집게를 사용하여, 신중하게 가위가 corneo - scleral 나눌 평행되도록 시선을 회전하고 작은 절개를합니다. 천천히 주위를 작은 incisions 모든 방법을 만들고, 눈 360 ° 회전. 다시 말하지만, 홍채와 각막 모두 절단되도록 홍채 아래 봄에 가위의 아래쪽 블레이드를 유지하려고합니다. 멀리 눈의 나머지 부분에서 꽃창포와 각막을 들어 그들을 폐기. </li><li> 그 측면에 눈을 기울이기 및 렌즈를 강제로, 눈의 뒷부분 이분의 일에 부드럽게 아래로 누르십시오. 렌즈를 폐기하십시오. 나머지 세안 컵의 내부는 부드럽고 불투명 보여야 신경 망막에 의해 줄지어있다. </li></ol> 3. 쿼터 4 결과 결과 세안 컵, - "petaled"꽃 같은 구조를 <ol><li> 눈 세안 컵의 개통은 몸에 직각입니다 같은 위치에 있어야합니다. 꾸준한와 위치 세안 컵에 45 °의 집게를 사용하십시오. </li><li> 당신 앞에 당신의 봄 가위를 들고 그들이 당신의 몸에 수직 있으며, 열린 눈 컵의 상단 가장자리에 봄 가위의 아래쪽 블레이드를 삽입합니다. 당신의 45 °의 집게를 사용하여 조심스럽게 단일 직선 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수 있도록 아이 컵을 맞춥니다. 모든 상처는 corneo - scleral 나눌 수직이어야하며 지정하지 않는 한, 그것으로 절단되지 않고 가능한 시신경의 머리에 가까이 가야한다. </li><li> 신체와의 수직을 유지, 세안 컵 180 ° 회전합니다. 두 번째 수직 인하를 만들기 위해 단계 3.2 기술을 사용합니다. </li><li> 세안 컵 회전하고 두 개 더 상처를 만들기 위해 3.2에 설명된 기법을 반복합니다. 네개의 상처는 가능한 한 떨어져 90 °에 가깝게한다. 어떤 변화가있을 것입니다 그래서 눈을 완벽하게 원형이 아니라고 유의하십시오. </li></ol> 4. 8 꽃잎 꽃 같은 구조의 결과, 절반으로 네 개의 "꽃잎"의 각 컷 <ol><li> 35mm 접시에서 깨끗한 슬라이드에 등분 세안 컵을 전송합니다. 최대 직면한 세안 컵으로 45 °의 집게와 함께 그 아래 특종. 조심스럽게 액체를 밖으로 들고 깨끗한 슬라이드에 배치하십시오. </li><li> 직각 포셉 두 쌍을 이용하여 부드럽게까지 직면하고있는 신경 망막과 안구를 엽니다. 제거하지 마십시오 신경 망막 - 그것이 당신이 그것에 대해 작동하지 않습니다 그래서 눈을는 구면 형상의 일부를 유지하는 데 도움이됩니다. 또한 실수로 다음과 같은 절차에 손상되지 않도록 RPE를 보호합니다. </li><li> 꽃잎 중 하나가 당신의 몸에 수직 때까지 슬라이드를 회전합니다. </li><li> 당신의 15 °의 집게를 사용하여 부드럽게 꽃잎의 모서리를 잡아. 꽃잎의 코너가 아니라 신경 망막 또는 각막 RPE해야합니다. 그것의 곡률을 유지 수 있도록 부드럽게 모퉁이에 올려요. </li><li> 꽃잎과 슬라이드 사이에 스프링 가위 하단의 칼날을 넣습니다. 당신의 가위를 선 하나, 직선, 직각 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수있을 것이다. 가능한 withou으로 시신경의 머리에 가까운 컷t는 그것으로 절단. 이 슬라이드에 누워있게 꽃잎의 가자. </li><li> 슬라이드 90도 회전 °, 다음 꽃잎이 몸에 직각이되도록. 4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 두 번 더 단계를 4.5과 4.6를 반복합니다. 그 결과 구조는 8 꽃잎 꽃과 같이 표시됩니다. </li></ol> 5. 신경 망막을 제거 <ol><li> 표본에 1X PBS의 피펫 100-200 μL. 이것은 RPE의 그걸 벗겨 당신과 떨어져 고집에서 신경 망막을 방지할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 신경 망막은 느슨하게 RPE에 첨부되어 있습니다. 그러나, 그것은 단지 신경 망막 아니라 RPE를 제거하는 연습과 기술을 않습니다. 직각 포셉의 다른 쌍의과 (누른) 안구의 나머지 부분을 안정화하면서 부드럽게 직각 포셉 한 쌍의있는 신경 망막의 꽃잎을 파악. 멀리 눈의 나머지 부분에서 신경 망막을 당겨. 전체 신경 망막이 제거되었습니다 때까지이 절차를 계속합니다. * 도움말 : '눈'을 앵커로 시신경의 머리에 15 ° 포셉의 팁을 스틱. 그러면 신경 망막 아래에 청소에 45 °의 집게를 사용하여 그것을 발사하고 멀리. 이것은 corneo - scleral 나누어 방향으로 시신경의 머리에서 신경 망막을 해제하는 것이 가장 일반적이다. 홍채의 느슨한 잔해를 멀리 당겨주십시오. 조리개는 아주 끈적하고 그렇지 않으면 RPE에 붙어받을 수 있습니다. </li><li> 1X PBS로 표본을 씻어. 피펫 100-200 표본에 1X PBS의 μL 그것을 다시 빨아. PBS를 폐기하십시오. 먼지와 부스러기를 제거하는 필요한 반복합니다. </li></ol> 6. 슬라이드에서 여러분에게 표본 (들)을 마운트 <ol><li> 직사각형 모양의 새 슬라이드에 90 % 글리세롤의 피펫 80-90 μL. 글리세롤의도, 직사각형 얼룩을 할 수있는 피펫 팁의 측면을 사용합니다. (이 한 슬라이드에 두 RPE를 설치하는 절차입니다.) </li><li> 표본에 따라 15 ° 포셉의 낮은 팔을 넣습니다. 부드럽게 해부 슬라이드에서 표본을 리프트. </li><li> 천천히 글리세롤로 표본을 낮추십시오. 부드럽게 당신은 표본 아래에서 그들을 나가면 포셉은 호기심. </li><li> 반복 다른 표본에 대한 6.1-6.3 단계를 반복합니다. </li><li> 긴 측면이 몸에 직각되도록 슬라이드를 회전합니다. 귀하의 커버 유리를 잡고 45 °가 슬라이드를 감동되도록 슬라이드 각도. 그들이 터치 때까지 글리세롤의 얼룩쪽으로 그것을 이동합니다. 커버 유리와 슬라이드 사이의 연락 유지, 서서히 슬라이드의 가장자리쪽으로, 멀리 얼룩의 커버 유리를 이동합니다. 슬라이드의 긴 측면과 커버 유리 최대 라인 수 있도록 그들이 평행하고 있습니다. 당신의 엄지와 집게손가락 사이에 커버 유리의 모서리를 잡아. </li><li> 다른 손에 15 °의 집게를 선택하십시오. 팔 사기꾼의 커버 유리의 위쪽 (무료) 모서리 크레이들. 아주 천천히, 커버 유리를 낮추십시오. 연락이 커버 유리와 글리세롤 사이에 만들어진 경우, 중지하고 마이 그 레이션하는 글리세롤 기다립니다. 이 낮추고 RPE 전체 마운트가 완전히 덮여 때까지 기다리고를 반복합니다. 이것은 기포를 캡처에서 높은 점성 글리세롤을 방지하는 것입니다. COVERGLASS 아래로 누르지 마 - 글리세롤은 접착력이 매우 가난하고, 그 아래에서 뽑는 것입니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 유리 슬라이드 만나는 주위에 페인트. </li><li> 건조에 빈 랙 상단에 슬라이드를 삽입합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 이 절차의 결과는 꽃처럼 보이는 공정 대칭되어야 구조해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. wildtype C67Bl/6J 마우스에서 전체 마운트 RPE. 검은색 또는 agouti 동물의 RPE는 컬러 갈색 어두운이어야하며 부드러운 표면을 가지고해야합니다. 그것은 꽃잎의 지형에 기복을 통지하기 위해 정상입니다. 어떤주는 표본의 착색은 RPE와 기본 맥락막 모두의 착색의 변수 밀도 때문에 다소 변수가있을 수 있습니다. 화이트 화살표 hypopigmented "채널"을 가리 키 -이 정상이며, 안구의 기본 vasculature 때문입니다. RPE와 기본 맥락막 모두에 물리적 손상이 파란색 화살표를 가리 킵니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 희석 마우스 전체 마운트 RPE가. 희석 동물에서 수확 표본 거의 투명한에서 카페 프 lait에 색깔이 다양하고 한 표본 여기에 검은 동그라미로 표시, 그 안에서 다양성을 가지고 같습니다. 일반적으로 어린 동물에서 수확 RPE는 가볍고 아르 세 동물의 수확들은 어두운 있습니다. 블랙 화살표 hypopigmented 나타나는 기본 vasculature의 일부를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Phalloidin의 얼룩은 RPE에 물리적 손상을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Phalloidin의 얼룩은 분명히 상피의 육각형 모양을 보여주는 세포 세포막을 설명합니다. 검은 마우스 (A) 예. 희석 마우스 (B) 예. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 희석 마우스 제대로 해부 RPE. (A) 괄호 및 / 또는 접는 좌굴가 발생할 수 있습니다 너무 넓은 데요 각막의 여백을 나타냅니다. 블랙 서클 내에서 눈 뒤쪽에서 제거되지 않은 외부 조직의 과도한 금액을 볼 수 있습니다. 샘플은 희석 동물에서이기 때문에 그들은 특히 분명합니다. 하단 왼쪽에있는 꽃잎은 부분적으로 이상 접혀 있습니다. (B)이 전체 마운트 바람개비의 모양을하고 있습니다. 블랙 화살표 만들어진 상처의 일부를 나타냅니다. 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 디비드에서 상처의 대부분은 직경에 맞게되지 않습니다. (C) 블랙 화살표 인하가 접선에 수직 직경과 라인에서 만들어진해야하는 방법을 나타냅니다.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RPE는 상동 - 감독 수리 생체내 분석에서 P 유엔 분석의 사이트입니다. P 유엔 분석은 상동 - 감독 수리의 주파수에서 다른 DNA의 손상의 효과 1,2 및 DNA 손상 신호 및 복구 유전자 3,4,5을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 RPE 1 단일 셀 이벤트를 감지, 매우 민감합니다. 또한 개발 6 중 상동 - 감독 복구 이벤트의 타이밍의 차이를 감지할 수 있습니다. murine 눈은 시신경 7 바깥쪽 반경 개발 및 따라서, 시신경의 머리에서 이벤트의 상대적인 거리들이 발생하는 개발 시간을 연결합니다. RPE는 또한 망막 개발이나 망막 질환을 연구하는 사람들에게 관심이있다. RPE 세포 교양 수 있지만, 이렇게하기 위해 중요한 제한이 있습니다. 성인 RPE 세포를 게시할 - mitotic <su...

<table><tbody><tr><td>직형 포셉</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>팁: .08 x .04 mm 재질: INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0; 포셉</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>팁: .05 x.01 mm 재질: INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0; &quot;up&quot; 포셉</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>팁: .1 x.06 mm 재질: INOX</td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>결합 팁 너비 0.3mm 절단면 길이 3mm 재질: 스테인리스강</td></tr><tr><td>양안 해부 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>반사 광원 사용</td></tr><tr><td>팔로이딘</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

망막 안료 상피 (RPE)는 단지 photoreceptors을 (막대 및 원뿔)이 들어있는 신경 망막, 아래, 포유 동물 눈의 뒤쪽에 자리잡고 있습니다. RPE는 밀접하게 그냥 위에있는 신경 망막과 색소 세포 cuboidal과 동료의 monolayer입니다. 이 협회는 망막 질환을 공부하고 연구하기 위해 큰 관심의 RPE를합니다. RPE는 상동 - 감독의 DNA 수리, P 유엔 분석의 생체내 분석에의 사이트입니다. 작은 크기로 인해 해부하다 (직경 3.5mm 정도)와 구면 모양 마우스 눈 특히 어렵습니다. 이 문서 상세 RPE의 전체 마운트에 발생하는 안구의 해부를위한 절차를 설명합니다. 이 절차에서는, 우리는 눈 구면 구조에 대해 함께보다는 일을하는 방법을 보여줍니다. 간단히, 결합 조직, 근육, 그리고 시신경이 안구의 뒤쪽에서 제거됩니다. 그런 다음, 각막과 렌즈가 제거됩니다. 다음 전략적 상처가 남아있는 조직의 중요한 평평화에 결과를 만들 수 있습니다. 마지막으로, 신경 망막은 부드럽게 여전히 기본 맥락막과 공막엔에 첨부되어 그대로 RPE를 공개, 해제 해제됩니다. 이 모든 마운트는 P 유엔 분석 또는 RPE 조직의 immunohistochemistry 또는 immunofluorescent 평가를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막색소상피(RPE)는 포유류 안구의 후면에 위치하며, 광수용기(간상세포 및 원추세포)가 포함된 신경망막 바로 아래에 자리 잡고 있습니다.

제 이름은 Allison Clavon입니다. 저는 텍사스주 샌안토니오에 위치한 UT Health Science Center의 Gree 아동암 연구소에서 Alex Bishop 박사님의 연구 보조원으로 근무하고 있습니다. 오늘은 망막 색소 상피층의 전체 양을 얻기 위해 설치류의 눈을 해부하는 방법을 시연하겠습니다.이 조직은 망막의 발달과 질병을 연구하는 데 유용하며, 생체 내(in vivo) 상동 재조합 기반 DNA 복구 분석이 이루어지는 부위이기도 합니다. 그럼 시작하겠습니다. 여기 해부 준비가 된 눈이 있습니다.먼저, 절차 전반에 걸쳐 지표로 사용할 해부학적 구조를 살펴보겠습니다. 이것은 희석된 동물의 눈입니다. 여기 눈 반대편 뒤쪽에 있는 시신경이 있습니다.이것이 각막입니다. 홍채가 각막을 통해 보입니다. 안구 뒤쪽의 흰색 영역은 공막입니다.따라서 이 영역을 각막 공막 경계라고 합니다. 박리의 첫 번째 단계는 근육 결합 조직 및 시신경과 같은 불필요한 조직을 제거하는 것입니다. 다음으로, 원형으로 절개하여 각막을 제거해야 합니다.이 단계에서 렌즈를 밀어내면 빈 안구 컵이 형성됩니다. 다음으로 각막-공막 경계부에서 시신경 유두 방향으로 네 번의 절개를 수행합니다. 이렇게 하면 결과 구조가 네 개의 꽃잎이 있는 꽃과 같은 모양이 됩니다.그 다음 이 네 개의 꽃잎 각각의 중앙을 절개하여, 결과적으로 여덟 개의 꽃잎이 있는 꽃과 유사한 구조를 만듭니다. 이 단계에서 구형의 특성 때문에 일부 영역이 굴곡질 수 있습니다. 이를 방지하고 더 평평한 홀 마운트를 구현하려면, 굴곡진 부분을 지나도록 여덟 개의 짧은 절개선을 추가로 만들어 줍니다.100 또는 200 µL 피펫과 해당 팁, X-P-B-S-A 35 mm 디쉬, 슬라이드 및 커버 글라스, 슬라이드 제작을 위한 90% glycerol 및 투명 매니큐어, 슬라이드 건조용 랙, Kim wipes 한 상자, 폐기물 처리 용기 등 여러 재료를 작업대에 준비해야 합니다. 이러한 일반적인 재료 외에도 일직선 핀셋, 45도 각도 핀셋(해부 과정 동안 안구를 고정, 회전 및 전반적으로 조작하는 데 사용)을 포함한 전문 미세 해부 도구 세트가 필요합니다. 15도 각도 핀셋은 위쪽으로 각도가 져 있으며, 이 또한 안구를 취급하고 조작하는 데 사용됩니다.마지막으로, 스프링 가위 한 쌍이 필요합니다. 일반적인 형태의 가위 대신 반드시 스프링 가위를 사용해야 합니다. 해부를 시작하기 전, 똑바로 앉았을 때 눈의 높이가 접안렌즈와 일치하도록 의자 높이를 조절하십시오.현미경을 볼 때 자세가 구부정하면 어깨와 등에 통증이 발생하고 해부의 품질이 저하됩니다. 먼저 35 millimeter 접시 뚜껑에 XPBS를 붓습니다. 그다음 해부할 안구를 접시로 옮깁니다.이것은 야생형 C 57 black 마우스의 눈입니다. 직경이 약 3.5mm 정도로 매우 작음을 알 수 있습니다. 공막의 불투명성으로 인해 푸르스름한 색을 띱니다.해부의 첫 번째 단계는 근육 결합 조직 및 시신경과 같이 안구 주변의 모든 불필요한 조직을 제거하는 것입니다. 여기서는 왼손에 45도 포셉을, 오른손에 15도 포셉을 잡고 있습니다. 한쪽 포셉으로 안구를 고정한 상태에서 다른 쪽 포셉으로 조직을 당겨 제거할 수 있습니다.큰 조직 조각이 떨어져 나오면 핀셋을 킴와이프로 조심스럽게 닦아내십시오. 이때 안구를 압착하거나 찌르지 않도록 주의하십시오. 현탁 상태에서 이 해부를 수행할 때의 장점 중 하나는 안구에서 떨어져 나와 떠다니는 결합 조직을 쉽게 확인할 수 있다는 점입니다.결국 핀셋으로 더 이상 조직을 제거할 수 없는 시점에 도달하게 됩니다. 15도 각도 핀셋을 스프링 가위로 교체하십시오. 스프링 가위를 사용하여 시신경을 절단하십시오.블레이드의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 조직을 각막-공막 경계 방향으로 밀어내십시오. 그런 다음 가위의 끝을 다듬고 킴와이프로 조심스럽게 닦아내십시오. 다시 한번 살펴보겠습니다.조직이 위로 솟아 있을 때는 가위의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 조직을 각막-공막 경계 방향으로 밀어내십시오. 조직의 일부를 가위의 뭉툭한 면으로 계속해서 앞으로 밀어내고 이를 잘라내는 과정을 반복하여 모든 불필요한 조직을 제거하십시오. 일반적으로 안구에는 두 개의 질긴 조직 밴드가 존재합니다.첫 번째는 각막-공막 경계부에 부착되어 있으며, 두 번째는 다듬어지는 모습입니다. 이 지점은 각막-공막 경계부와 시신경 유두의 중간쯤에 위치합니다. 박리의 다음 단계는 각막과 수정체를 제거하는 것입니다.45도 핀셋을 사용하여 각막의 중앙 부근에 플랩을 집어 들어 올립니다. 그다음 스프링 가위를 사용하여 플랩의 기저부에 작은 절개를 가합니다. 가위의 아래쪽 날을 홍채 아래의 절개창으로 삽입합니다.각막 공막 경계 방향으로 절개하되, 경계선 내부까지 절개하지 마십시오. 이제 안구를 360도 천천히 회전시키며 주변 전체에 걸쳐 작은 절개창을 만듭니다. 가위를 홍채 아래에 유지하여 각막과 홍채를 동시에 절개하도록 하십시오.여기서 보여드리는 것처럼 쉽게 수행하려면 많은 연습이 필요합니다. 각막을 제거한 후, 안구를 옆으로 돌려 안구 외부를 부드럽게 눌러 수정체를 밀어냅니다. 그러면 남은 구조는 컵 모양이 됩니다.안구를 4등분해야 합니다. 이를 위해 안구를 옆으로 눕히고 스프링 가위의 아래쪽 날을 삽입하십시오. 시신경 유두 방향으로 세로 절개를 가하되, 시신경 유두까지 완전히 자르지 않도록 주의하십시오.이를 위해 양팔을 몸 옆에 붙이고 가위는 신체 및 안구 절개선과 거의 수직이 되도록 앞에 둡니다. 첫 번째 절개선의 정반대 방향으로 두 번째 절개를 실시합니다. 매끄럽게 절개할 수 있도록 시간을 갖고 정렬하십시오.여러 번 절개하면 단면이 거칠어질 수 있으나, 주의 깊게 정렬하면 눈에 띄지 않습니다. 안구가 정상적인 형태를 유지하기 때문에, 구형의 안구 구조를 거스르지 않고 이를 활용하여 작업하는 방식에 주목하십시오. PBS에 침지시킨 상태에서 나머지 해부 과정은 슬라이드 위에서 진행됩니다. 45도 각도의 핀셋으로 안구를 조심스럽게 잡아 PBS에서 들어 올리십시오.눈을 새 슬라이드 위에 놓습니다. 두 쌍의 각도 핀셋을 사용하여 눈을 조심스럽게 펼칩니다. 눈의 둘레에 각막과 홍채의 작은 여백이 있어 취급하기 용이함을 확인하십시오.다음으로, 4개의 꽃잎을 각각 반으로 절단해야 합니다. 꽃잎 하나가 몸과 수직이 되도록 안구를 회전시키십시오. 15도 각도 핀셋으로 꽃잎의 모서리를 잡으십시오.약간 들어 올린 다음, 각막 공막 경계부에서 시신경 유두 방향으로 절개합니다. 이 절개선들은 접선에 수직이어야 합니다. 접선이란 지름에 수직인 직선을 말합니다.따라서 절단 부위는 안구의 직경과 일치해야 합니다. 이제 슬라이드를 회전시켜 다음 페달이 몸과 수직이 되도록 한 후 과정을 반복하십시오. 페달의 모서리를 잡으십시오.살짝 들어 올려 절단합니다. 4개의 큰 꽃잎 모양 부위가 모두 절반으로 절단될 때까지 이 과정을 반복합니다. 흰색 물질은 RPE 바로 위에 겹쳐져 있는 신경망막입니다.신경 망막이 RPE를 보호할 수 있으므로, 모든 절개를 마칠 때까지 이를 그대로 두십시오. 페달이 약간 휘어져 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 곡선을 억지로 펴려고 하지 마십시오.정교하게 한 번에 절단할 수 있도록 천천히 정렬하십시오. 안구는 둥근 형태이므로 찌그러지는 경향이 있는데, 이를 방지해야 합니다. 여덟 번의 약식 절단을 수행할 수 있습니다.각 꽃잎에 하나씩 수행합니다. 이전의 4회 절단 단계와 동일한 기본 전략을 사용하십시오. 꽃잎의 모서리를 들어 올려 절단하되, 이 경우에는 꽃잎 길이의 약 절반 정도까지만 절단하십시오.모든 절단이 완료되면 신경망막을 제거할 수 있습니다. 여기서는 시료에 1X PBS를 몇 방울 첨가하고 있습니다. RPE가 건조해지지 않도록 주의하십시오.신경망막은 하층의 RPE와 느슨하게 연결되어 있어야 합니다. 망막이 매우 쉽게 분리되는 것을 확인할 수 있습니다. 하지만 대개 각막-공막 경계 부위에는 부착된 상태로 유지되는데, 안구 내부에서 이 부위는 모양체라고 불리는 울퉁불퉁한 능선 형태를 띱니다.15도 포셉의 팁을 시신경 유두에 삽입하여 표본을 고정한 상태에서 신경망막을 제거할 수 있습니다. 모양체는 함께 제거된 어두운 색소 조직인 망막색소상피(RPE)의 가장자리를 나타냅니다. 여기는 RPE가 아니라 홍채입니다.홍채는 매우 끈적거리며, 신경망막이 조각나거나 그 잔해물이 RPE에 붙어 있는 경우 접혀서 RPE에 달라붙을 수 있으므로 가능한 한 많이 제거하는 것을 권장합니다. 아마도 두 가지 중 하나의 문제가 발생했을 것입니다. 고정 시간이 너무 길거나 짧아서 안구가 제대로 고정되지 않았거나, 혹은 해부 전 보관 기간이 너무 길었을 가능성이 있습니다.여기에서 확인하고 있는 페달은 아직 단축키가 설정되지 않은 상태입니다. RPE 가장자리에서 약 3분의 1 지점에 페달이 위치한 것을 볼 수 있습니다. 이것이 8개의 단축키 사용을 권장하는 이유입니다.신경 망막을 모두 제거한 후, 피펫을 사용하여 RPE를 100~200 µL의 PBS로 여러 번 헹구어 모든 먼지와 잔해를 제거합니다. 새 슬라이드 위에 90% glycerol 80~90 µL를 직사각형 모양으로 분주합니다. 참고로, 이는 22 x 50 mm 커버글라스에 최적화된 glycerol 부피이며, 상황에 따라 적절히 조절해야 합니다.다른 크기의 커버 글라스의 경우, 피펫 팁을 사용하여 글리세롤을 펴 바르십시오. 글리세롤에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 기포가 생긴 경우에는 기포를 가장자리로 끌어당겨 터뜨리십시오.15도 핀셋의 하단 팔을 RPE 아래로 밀어 넣어 조심스럽게 들어 올린 후, RPE를 글리세롤 속으로 천천히 내립니다. RPE는 글리세롤 위에 뜨게 되며, 약간 말리거나 뒤틀릴 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 RPE를 펴고 RPE 표면 위로 글리세롤이 덮이도록 끌어당깁니다.기포가 형성된 경우, 커버글라스를 약 45도 각도로 유지한 채 기포를 가장자리로 밀어내어 터뜨리십시오. 커버글라스가 글리세롤의 가장자리에 닿게 하십시오.그런 다음 이를 슬라이드 가장자리 쪽으로 이동시킵니다. 엄지와 검지로 커버 글라스의 하단을 잡고, 반대쪽 가장자리를 15도 핀셋으로 받쳐줍니다. 접촉이 일어나는 즉시 커버 글라스를 슬라이드 쪽으로 매우 천천히 내립니다.RPE와 닿으면 내리기를 멈추고 글리세롤이 퍼지게 한 뒤, 다시 커버 글라스를 천천히 내리십시오. 커버 글라스를 너무 빨리 내리면 슬라이드에 기포가 섞여 들어갈 수 있습니다. 저는 커버 글라스가 RPE에 닿도록 천천히 내리면서 글리세롤이 퍼지도록 하겠습니다.커버 글라스를 빠르게 놓으면 기포가 유입되는 것을 볼 수 있습니다. 투명 매니큐어를 충분히 사용하여 커버 글라스의 가장자리를 고정하십시오. 슬라이드 글라스의 둘레 전체를 따라 고정합니다.이것은 C 57 black 마우스의 전형적인 RPE입니다. 여기에 표시된 바와 같이 하부 혈관이 보이는 것은 정상입니다. 또한 색소가 적게 나타나는 패치와 같이 색소 침착에 일부 변이가 보이는 것도 정상입니다.하지만 이와 같은 투명한 반점은 RPE와 그 아래의 맥락막에 가해진 물리적 손상으로 인해 발생했을 가능성이 높습니다. 눈의 맥락막 또한 색소가 함유되어 있기 때문입니다. 따라서 맥락막이 온전하게 남아 있다면 검은색 RPE의 손상이 눈에 띄지 않을 가능성이 있습니다.이것은 희석된(dilute) 마우스의 전형적인 RPE입니다. 표시된 바와 같이, 혈관 구조를 확인할 수 있으며 어두운 부분과 밝은 부분처럼 색소 침착에 일부 차이가 있을 것입니다. 하지만 희석된 RPE에서는 손상 부위를 확인하는 것이 거의 불가능합니다.이 작은 반점들이 손상인지 아니면 정상적인 색소 침착 변이인지 확인이 필요합니다. 이 질문을 해결하기 위해 고정(fixation)과 염색을 제안합니다. 이를 통해 샘플을 너무 거칠게 다루고 있는지 확인할 수 있을 것입니다.염색을 통해 세포막이 뚜렷하게 윤곽이 잡혀 손상된 부위를 쉽게 확인할 수 있지만, 실제로 RPE는 상당히 탄력이 있어 각막을 통해 안구를 잡고 조작한다면 손상을 입힐 가능성은 낮습니다. 여기 여러 가지 문제가 있는 전면 표본(whole mount)이 있는데, 가장 사소한 문제는 여기에 표시된 각막 마진이 너무 넓다는 점이며, 이는 구불구불한 조직이 굽어지거나 접히는 결과로 이어질 수 있습니다. 여기 안구 뒷면에 거대한 이물질 조직이 남아 있는 것을 볼 수 있습니다.이 페달은 부분적으로 접혀 있으며, 여기에서 RPE가 부분적으로 찢어진 것을 볼 수 있습니다. 또 다른 문제는 이 안구가 바람개비와 같은 형태를 띠고 있다는 점입니다. 여기에 절개 각도를 그려 넣었습니다.하지만, 결과물은 이와 같아야 합니다. 절단면은 접선에 수직이며 직경과 일직선이 되어야 한다는 점을 기억하십시오. 지금까지 망막 색소의 전체 마운트(whole mount)를 위해 마우스 안구를 해부하는 방법을 시연하였습니다.상피 세포의 경우, 가장 중요한 것은 올바른 자세를 유지하는 것이지만, 동시에 몸의 긴장을 풀도록 노력하십시오. 이 영상이 유익했기를 바라며, 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

해부 기술은 유리체, 망막, 그리고 마우스 눈에서 렌즈, 원심 분리에 의해 분리하고, 단백질 as​​says과 특성화의 내장 적출을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC).  설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.

설치류 눈의 미세 해부

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 마우스 눈 해부 기법으로 망막 색소 상피 전체 마운트를 제작하는 방법을. 이 기술은 망막 발달 및 질병 연구에 필수적인 고품질 조직 샘플 확보에 활용됩니다.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

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