망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

제 이름은 Allison Clavon입니다. 저는 텍사스주 샌안토니오에 위치한 UT Health Science Center의 Gree 아동암 연구소에서 Alex Bishop 박사님의 연구 보조원으로 근무하고 있습니다. 오늘은 망막 색소 상피층의 전체 양을 얻기 위해 설치류의 눈을 해부하는 방법을 시연하겠습니다.

이 조직은 망막의 발달과 질병을 연구하는 데 유용하며, 생체 내(in vivo) 상동 재조합 기반 DNA 복구 분석이 이루어지는 부위이기도 합니다. 그럼 시작하겠습니다. 여기 해부 준비가 된 눈이 있습니다.

먼저, 절차 전반에 걸쳐 지표로 사용할 해부학적 구조를 살펴보겠습니다. 이것은 희석된 동물의 눈입니다. 여기 눈 반대편 뒤쪽에 있는 시신경이 있습니다.

이것이 각막입니다. 홍채가 각막을 통해 보입니다. 안구 뒤쪽의 흰색 영역은 공막입니다.

따라서 이 영역을 각막 공막 경계라고 합니다. 박리의 첫 번째 단계는 근육 결합 조직 및 시신경과 같은 불필요한 조직을 제거하는 것입니다. 다음으로, 원형으로 절개하여 각막을 제거해야 합니다.

이 단계에서 렌즈를 밀어내면 빈 안구 컵이 형성됩니다. 다음으로 각막-공막 경계부에서 시신경 유두 방향으로 네 번의 절개를 수행합니다. 이렇게 하면 결과 구조가 네 개의 꽃잎이 있는 꽃과 같은 모양이 됩니다.

그 다음 이 네 개의 꽃잎 각각의 중앙을 절개하여, 결과적으로 여덟 개의 꽃잎이 있는 꽃과 유사한 구조를 만듭니다. 이 단계에서 구형의 특성 때문에 일부 영역이 굴곡질 수 있습니다. 이를 방지하고 더 평평한 홀 마운트를 구현하려면, 굴곡진 부분을 지나도록 여덟 개의 짧은 절개선을 추가로 만들어 줍니다.

100 또는 200 µL 피펫과 해당 팁, X-P-B-S-A 35 mm 디쉬, 슬라이드 및 커버 글라스, 슬라이드 제작을 위한 90% glycerol 및 투명 매니큐어, 슬라이드 건조용 랙, Kim wipes 한 상자, 폐기물 처리 용기 등 여러 재료를 작업대에 준비해야 합니다. 이러한 일반적인 재료 외에도 일직선 핀셋, 45도 각도 핀셋(해부 과정 동안 안구를 고정, 회전 및 전반적으로 조작하는 데 사용)을 포함한 전문 미세 해부 도구 세트가 필요합니다. 15도 각도 핀셋은 위쪽으로 각도가 져 있으며, 이 또한 안구를 취급하고 조작하는 데 사용됩니다.

마지막으로, 스프링 가위 한 쌍이 필요합니다. 일반적인 형태의 가위 대신 반드시 스프링 가위를 사용해야 합니다. 해부를 시작하기 전, 똑바로 앉았을 때 눈의 높이가 접안렌즈와 일치하도록 의자 높이를 조절하십시오.

현미경을 볼 때 자세가 구부정하면 어깨와 등에 통증이 발생하고 해부의 품질이 저하됩니다. 먼저 35 millimeter 접시 뚜껑에 XPBS를 붓습니다. 그다음 해부할 안구를 접시로 옮깁니다.

이것은 야생형 C 57 black 마우스의 눈입니다. 직경이 약 3.5mm 정도로 매우 작음을 알 수 있습니다. 공막의 불투명성으로 인해 푸르스름한 색을 띱니다.

해부의 첫 번째 단계는 근육 결합 조직 및 시신경과 같이 안구 주변의 모든 불필요한 조직을 제거하는 것입니다. 여기서는 왼손에 45도 포셉을, 오른손에 15도 포셉을 잡고 있습니다. 한쪽 포셉으로 안구를 고정한 상태에서 다른 쪽 포셉으로 조직을 당겨 제거할 수 있습니다.

큰 조직 조각이 떨어져 나오면 핀셋을 킴와이프로 조심스럽게 닦아내십시오. 이때 안구를 압착하거나 찌르지 않도록 주의하십시오. 현탁 상태에서 이 해부를 수행할 때의 장점 중 하나는 안구에서 떨어져 나와 떠다니는 결합 조직을 쉽게 확인할 수 있다는 점입니다.

결국 핀셋으로 더 이상 조직을 제거할 수 없는 시점에 도달하게 됩니다. 15도 각도 핀셋을 스프링 가위로 교체하십시오. 스프링 가위를 사용하여 시신경을 절단하십시오.

블레이드의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 조직을 각막-공막 경계 방향으로 밀어내십시오. 그런 다음 가위의 끝을 다듬고 킴와이프로 조심스럽게 닦아내십시오. 다시 한번 살펴보겠습니다.

조직이 위로 솟아 있을 때는 가위의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 조직을 각막-공막 경계 방향으로 밀어내십시오. 조직의 일부를 가위의 뭉툭한 면으로 계속해서 앞으로 밀어내고 이를 잘라내는 과정을 반복하여 모든 불필요한 조직을 제거하십시오. 일반적으로 안구에는 두 개의 질긴 조직 밴드가 존재합니다.

첫 번째는 각막-공막 경계부에 부착되어 있으며, 두 번째는 다듬어지는 모습입니다. 이 지점은 각막-공막 경계부와 시신경 유두의 중간쯤에 위치합니다. 박리의 다음 단계는 각막과 수정체를 제거하는 것입니다.

45도 핀셋을 사용하여 각막의 중앙 부근에 플랩을 집어 들어 올립니다. 그다음 스프링 가위를 사용하여 플랩의 기저부에 작은 절개를 가합니다. 가위의 아래쪽 날을 홍채 아래의 절개창으로 삽입합니다.

각막 공막 경계 방향으로 절개하되, 경계선 내부까지 절개하지 마십시오. 이제 안구를 360도 천천히 회전시키며 주변 전체에 걸쳐 작은 절개창을 만듭니다. 가위를 홍채 아래에 유지하여 각막과 홍채를 동시에 절개하도록 하십시오.

여기서 보여드리는 것처럼 쉽게 수행하려면 많은 연습이 필요합니다. 각막을 제거한 후, 안구를 옆으로 돌려 안구 외부를 부드럽게 눌러 수정체를 밀어냅니다. 그러면 남은 구조는 컵 모양이 됩니다.

안구를 4등분해야 합니다. 이를 위해 안구를 옆으로 눕히고 스프링 가위의 아래쪽 날을 삽입하십시오. 시신경 유두 방향으로 세로 절개를 가하되, 시신경 유두까지 완전히 자르지 않도록 주의하십시오.

이를 위해 양팔을 몸 옆에 붙이고 가위는 신체 및 안구 절개선과 거의 수직이 되도록 앞에 둡니다. 첫 번째 절개선의 정반대 방향으로 두 번째 절개를 실시합니다. 매끄럽게 절개할 수 있도록 시간을 갖고 정렬하십시오.

여러 번 절개하면 단면이 거칠어질 수 있으나, 주의 깊게 정렬하면 눈에 띄지 않습니다. 안구가 정상적인 형태를 유지하기 때문에, 구형의 안구 구조를 거스르지 않고 이를 활용하여 작업하는 방식에 주목하십시오. PBS에 침지시킨 상태에서 나머지 해부 과정은 슬라이드 위에서 진행됩니다. 45도 각도의 핀셋으로 안구를 조심스럽게 잡아 PBS에서 들어 올리십시오.

눈을 새 슬라이드 위에 놓습니다. 두 쌍의 각도 핀셋을 사용하여 눈을 조심스럽게 펼칩니다. 눈의 둘레에 각막과 홍채의 작은 여백이 있어 취급하기 용이함을 확인하십시오.

다음으로, 4개의 꽃잎을 각각 반으로 절단해야 합니다. 꽃잎 하나가 몸과 수직이 되도록 안구를 회전시키십시오. 15도 각도 핀셋으로 꽃잎의 모서리를 잡으십시오.

약간 들어 올린 다음, 각막 공막 경계부에서 시신경 유두 방향으로 절개합니다. 이 절개선들은 접선에 수직이어야 합니다. 접선이란 지름에 수직인 직선을 말합니다.

따라서 절단 부위는 안구의 직경과 일치해야 합니다. 이제 슬라이드를 회전시켜 다음 페달이 몸과 수직이 되도록 한 후 과정을 반복하십시오. 페달의 모서리를 잡으십시오.

살짝 들어 올려 절단합니다. 4개의 큰 꽃잎 모양 부위가 모두 절반으로 절단될 때까지 이 과정을 반복합니다. 흰색 물질은 RPE 바로 위에 겹쳐져 있는 신경망막입니다.

신경 망막이 RPE를 보호할 수 있으므로, 모든 절개를 마칠 때까지 이를 그대로 두십시오. 페달이 약간 휘어져 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 곡선을 억지로 펴려고 하지 마십시오.

정교하게 한 번에 절단할 수 있도록 천천히 정렬하십시오. 안구는 둥근 형태이므로 찌그러지는 경향이 있는데, 이를 방지해야 합니다. 여덟 번의 약식 절단을 수행할 수 있습니다.

각 꽃잎에 하나씩 수행합니다. 이전의 4회 절단 단계와 동일한 기본 전략을 사용하십시오. 꽃잎의 모서리를 들어 올려 절단하되, 이 경우에는 꽃잎 길이의 약 절반 정도까지만 절단하십시오.

모든 절단이 완료되면 신경망막을 제거할 수 있습니다. 여기서는 시료에 1X PBS를 몇 방울 첨가하고 있습니다. RPE가 건조해지지 않도록 주의하십시오.

신경망막은 하층의 RPE와 느슨하게 연결되어 있어야 합니다. 망막이 매우 쉽게 분리되는 것을 확인할 수 있습니다. 하지만 대개 각막-공막 경계 부위에는 부착된 상태로 유지되는데, 안구 내부에서 이 부위는 모양체라고 불리는 울퉁불퉁한 능선 형태를 띱니다.

15도 포셉의 팁을 시신경 유두에 삽입하여 표본을 고정한 상태에서 신경망막을 제거할 수 있습니다. 모양체는 함께 제거된 어두운 색소 조직인 망막색소상피(RPE)의 가장자리를 나타냅니다. 여기는 RPE가 아니라 홍채입니다.

홍채는 매우 끈적거리며, 신경망막이 조각나거나 그 잔해물이 RPE에 붙어 있는 경우 접혀서 RPE에 달라붙을 수 있으므로 가능한 한 많이 제거하는 것을 권장합니다. 아마도 두 가지 중 하나의 문제가 발생했을 것입니다. 고정 시간이 너무 길거나 짧아서 안구가 제대로 고정되지 않았거나, 혹은 해부 전 보관 기간이 너무 길었을 가능성이 있습니다.

여기에서 확인하고 있는 페달은 아직 단축키가 설정되지 않은 상태입니다. RPE 가장자리에서 약 3분의 1 지점에 페달이 위치한 것을 볼 수 있습니다. 이것이 8개의 단축키 사용을 권장하는 이유입니다.

신경 망막을 모두 제거한 후, 피펫을 사용하여 RPE를 100~200 µL의 PBS로 여러 번 헹구어 모든 먼지와 잔해를 제거합니다. 새 슬라이드 위에 90% glycerol 80~90 µL를 직사각형 모양으로 분주합니다. 참고로, 이는 22 x 50 mm 커버글라스에 최적화된 glycerol 부피이며, 상황에 따라 적절히 조절해야 합니다.

다른 크기의 커버 글라스의 경우, 피펫 팁을 사용하여 글리세롤을 펴 바르십시오. 글리세롤에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 기포가 생긴 경우에는 기포를 가장자리로 끌어당겨 터뜨리십시오.

15도 핀셋의 하단 팔을 RPE 아래로 밀어 넣어 조심스럽게 들어 올린 후, RPE를 글리세롤 속으로 천천히 내립니다. RPE는 글리세롤 위에 뜨게 되며, 약간 말리거나 뒤틀릴 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 RPE를 펴고 RPE 표면 위로 글리세롤이 덮이도록 끌어당깁니다.

기포가 형성된 경우, 커버글라스를 약 45도 각도로 유지한 채 기포를 가장자리로 밀어내어 터뜨리십시오. 커버글라스가 글리세롤의 가장자리에 닿게 하십시오.

그런 다음 이를 슬라이드 가장자리 쪽으로 이동시킵니다. 엄지와 검지로 커버 글라스의 하단을 잡고, 반대쪽 가장자리를 15도 핀셋으로 받쳐줍니다. 접촉이 일어나는 즉시 커버 글라스를 슬라이드 쪽으로 매우 천천히 내립니다.

RPE와 닿으면 내리기를 멈추고 글리세롤이 퍼지게 한 뒤, 다시 커버 글라스를 천천히 내리십시오. 커버 글라스를 너무 빨리 내리면 슬라이드에 기포가 섞여 들어갈 수 있습니다. 저는 커버 글라스가 RPE에 닿도록 천천히 내리면서 글리세롤이 퍼지도록 하겠습니다.

커버 글라스를 빠르게 놓으면 기포가 유입되는 것을 볼 수 있습니다. 투명 매니큐어를 충분히 사용하여 커버 글라스의 가장자리를 고정하십시오. 슬라이드 글라스의 둘레 전체를 따라 고정합니다.

이것은 C 57 black 마우스의 전형적인 RPE입니다. 여기에 표시된 바와 같이 하부 혈관이 보이는 것은 정상입니다. 또한 색소가 적게 나타나는 패치와 같이 색소 침착에 일부 변이가 보이는 것도 정상입니다.

하지만 이와 같은 투명한 반점은 RPE와 그 아래의 맥락막에 가해진 물리적 손상으로 인해 발생했을 가능성이 높습니다. 눈의 맥락막 또한 색소가 함유되어 있기 때문입니다. 따라서 맥락막이 온전하게 남아 있다면 검은색 RPE의 손상이 눈에 띄지 않을 가능성이 있습니다.

이것은 희석된(dilute) 마우스의 전형적인 RPE입니다. 표시된 바와 같이, 혈관 구조를 확인할 수 있으며 어두운 부분과 밝은 부분처럼 색소 침착에 일부 차이가 있을 것입니다. 하지만 희석된 RPE에서는 손상 부위를 확인하는 것이 거의 불가능합니다.

이 작은 반점들이 손상인지 아니면 정상적인 색소 침착 변이인지 확인이 필요합니다. 이 질문을 해결하기 위해 고정(fixation)과 염색을 제안합니다. 이를 통해 샘플을 너무 거칠게 다루고 있는지 확인할 수 있을 것입니다.

염색을 통해 세포막이 뚜렷하게 윤곽이 잡혀 손상된 부위를 쉽게 확인할 수 있지만, 실제로 RPE는 상당히 탄력이 있어 각막을 통해 안구를 잡고 조작한다면 손상을 입힐 가능성은 낮습니다. 여기 여러 가지 문제가 있는 전면 표본(whole mount)이 있는데, 가장 사소한 문제는 여기에 표시된 각막 마진이 너무 넓다는 점이며, 이는 구불구불한 조직이 굽어지거나 접히는 결과로 이어질 수 있습니다. 여기 안구 뒷면에 거대한 이물질 조직이 남아 있는 것을 볼 수 있습니다.

이 페달은 부분적으로 접혀 있으며, 여기에서 RPE가 부분적으로 찢어진 것을 볼 수 있습니다. 또 다른 문제는 이 안구가 바람개비와 같은 형태를 띠고 있다는 점입니다. 여기에 절개 각도를 그려 넣었습니다.

하지만, 결과물은 이와 같아야 합니다. 절단면은 접선에 수직이며 직경과 일직선이 되어야 한다는 점을 기억하십시오. 지금까지 망막 색소의 전체 마운트(whole mount)를 위해 마우스 안구를 해부하는 방법을 시연하였습니다.

상피 세포의 경우, 가장 중요한 것은 올바른 자세를 유지하는 것이지만, 동시에 몸의 긴장을 풀도록 노력하십시오. 이 영상이 유익했기를 바라며, 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.