Name: Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 소뇌 조직형 배양 기술로 약물 유도 세포사멸을 연구하는 방법을. 야생형 및 돌연변이 마우스의 소뇌 세포 생존율을 면역형광 분석으로 평가하여 신경과학 연구에 활용합니다.

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이 연구는 입슨 재단에 의해 일부 자금했다. IMV는 분자 생물학의 미국 암 협회 교수이며, 모범적인 생명 과학의 어윈 제이콥스와 조안의 의자를 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH, Leducq 재단 Meriaux 재단 엘리슨 의료 재단 입슨 / Biomeasure, Sanofi Aventis, 전립선 암 재단과 HN과 프랜시스 C. 버거 재단의 보조금에 의해 일부 지원되었다. PAS은 신경 과학 및 약물 남용 (R01 DA019022)에있는 국립 연구소에 대한 맥나이트 엔다우먼트 기금 후원됩니다. 저자 마크 슈미트 감사하고 싶습니다. 그래픽 아트는 제이미 T. 사이먼에 의해 디자인되었다. 스폰서가 친절하게 Invitrogen에 의해 제공되었다.

1. Organotypic 소뇌 문화 : <ol><li> 성공적으로 생성하려면 organotypic 소뇌 문화 P0 - P3 또는 P8 - P12 사이에 마우스를 사용합니다. 이 발달 단계가 우리의 연구에 대한 더 적절한했기 때문에 우리가 실험을 위해 우리는 P8 - P12 범위에서 마우스를 사용합니다. </li><li> 해부 및 배지 준비 : <ol><li> 뇌 해부와 슬라이스 준비는 1mM의 염화칼슘을 포함 낮은 나트륨 인공 뇌척수 (ACSF), 10mM D - 포도당, 4mm짜리 칼륨 염화물, 5mM 마그네슘 염화물, 26mM 나트륨 중탄산염, 246mM 자당 및 페놀 레드 용액 (1:1000)에서 이루어졌습니다 , 산도 7.3. 솔루션을 소독하기 위해 4 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 필터 ° C.를 </li><li> 소뇌 조각은 75 % 최소 필수 중간 이글 (멤), 25 % 열 inactivated 말 혈청, 25mM HEPES, 1mM 글루타민, 5mg / ML 포도당, 페니실린 (100 U / ML)과 스트렙토 마이신 (100 U / ML)를 양식하고 있습니다. 2 주간 최대 4 0.22 μm의 필터와 매장 ° C를 통해 매체를 필터링합니다. </li></ol></li><li> 그것이 빨간색에서 주황색으로 이동 있도록 이전 Carbogen (95 % 산소와 5 % 이산화탄소) 참고로 부풀어 오른 얼음처럼 차가운 ACSF 매체에서 머리를 절개하다, Carbogen 가진 채도는 솔루션의 산도가 변경됩니다. 절개는 뇌의 구조를 손상하지 않도록주의하고 가능한 시간의 최소 금액 수행하여야한다. </li><li> vibratome를 사용하여 400 μm의의 화살 섹션에 머리를 슬라이스. <ol><li> 소뇌의 가능한 한 조금 잘라 하나씩 반구에서 면도날과 화살 절단을 확인,이 부러 뜨리 평평한 표면을 제공합니다. 대뇌 피질은 깔끔히 쉽게 지원에 대해서만 사용하지만, 시간이 중요한 문제이기 때문에 그것은 면도날과 피질의 주동이의 절반을 잘라 것이 더 편리입니다. </li><li> 금속 vibratome 판에있는 두뇌의 위치를​​ 수정하는 (Superglue) cyanoacrylate 사용합니다. 접착제를 추가하기 전에 얼음 접시를 진정하고 얇은 접착 층을 형성하기 위해 튜브의 끝부분을 사용하여 잘 확산하는 것이 중요합니다. Superglue의 초과가있다면 그것이 ACSF 및 샘플이 손실됩니다 접촉되면, 그것은 접시에서 분리합니다. </li><li> 일단 두뇌는 두뇌를 커버하고 차가운 유지하는 접시 아래에 얼음을 넣어 충분히 ACSF 미디어를 추가 vibratome 접시에 첨부되어 있습니다. </li><li> 400 μm의 슬라이스 컷 얼음에 ACSF를 포함하는 6 자 세포 배양 판에 플라스틱 파스퇴르 피펫 (그것을 넓혀과 조각에 손상을 피하기 위해 팁을 절단)으로 그들을 전송합니다. </li><li> 해부 현미경이 인슐린 주사기 (소형 직경 28 게이지 바늘과 주사기)의 도움으로 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분한다. 어떤 조각은 Superglue의 가장자리에 첨부해야합니다 : 이것은 슬라이스의 생존에 영향을 미칠 수로를 제거하려고하는 순간이다. 소뇌 구조를 손상시키지 않고 신중하게 그것을하는 것이 중요합니다. </li></ol></li><li> 0.4 μm의의 모공과 30mm 문화 플레이트 삽입을 포함하는 6 자 접시에 소뇌 조각 전송합니다. 한 문화 미디어의 ML 당 자 37 적어도 2 시간 배양하여 사전에 시설되었다 ° C와 5% CO 2 (세포 배양 인큐베이터에서). 추가 여기 아래에 갇혀있는 공기의 거품이되지 않습니다 그리고 그들이 완전히 확장되었는지 확인하고 삽입 위에 어떠한 액체가 그들을 다루는 없다는 것을 소뇌 조각 (삽입 당 1-3) 장소 확인하는 미디어의 상단에 삽입 놓으십시오. 필요한 경우 미디어의 초과를 대기음. 37 품어 ° C와 5% CO 2 문화 매체마다 2 ~ 3 일 변화. 사용 매체 세포 생존을위한 중요한 슬라이스 - 파생 영양 요소를 포함 이래, 한번에 매체의 일부만 (예 : ½ 볼륨) 교체하는 것이 좋습니다. </li></ol> 2. 파 처리 및 소뇌 조각의 스테 이닝 : <ol><li> apoptotic 도전 실험을 위해, 우리는 첫째 문화 체외 3 (DIV3)에서 하루에 미디어를 변경 오일에 대한 슬라이스. DIV5 문화 미디어의 변화 때문에 세포 죽음의 깨끗한 배경을하기 위해 미디어에 직접 추가하여 파의 작용제의 항체 Jo2 0.5 μg / ML로 처리하는이 문화의 일부 사망률을 일으킬 수 있습니다. 우물의 절반은 컨트롤로 치료 남아 있습니다. </li><li> 24 시간 흡입하여 삽입 아래 미디어를 제거한 후. 조각 해결하려면 아래 얼음 차가운 4% PFA 1 ML 및 삽입 위의 1 ML를 추가합니다. 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 10 분 PFA를 제거하고 차가운 PBS로 세척 후 잠시. </li><li> 다음 PBS를 제거하고 실온에서 5 분간 PBS과 부화에 최고 20 % 차가운 메탄올의 삽입 위의 1 ML의 아래 1 ML를 추가합니다. </li><li> PBS로 다시 세척하고 아래 한 ML 및 permeabilization 위해 PBS에 트리톤 - X - 100 0.5 %의 삽입 위의 1 ML를 추가합니다. 4 12 시간 최소 품어 ° C. </li><li> permeabilization 후 최소 PBS에서 20 % BSA와 차단4 상온에서 시간 또는 4 박 ° C. 이 단계에서는 조각 4 적어도 삼일 ° C.에 대한 차단 용액에 보관 가능 </li><li> 슬라이스가 조심스럽게 소뇌 슬라이스에 연결된 삽입 막의 조각을 잘라 PBS를 포함하는 24 잘 접시로 전송 얼룩하기​​ 위해서. </li><li> immunostaining은 다음 1 시간 Calbidin 항체와 하룻밤을 위해 TUNEL 시약 처음에 순차적으로 이루어집니다. <ol><li> PBS를 대기음하고 각 잘는 슬라이스의 전체 표면을 커버해야하는 시약으로 TUNEL에서 250 μL를 추가합니다. 어두운 한 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 한 시간 TUNEL 믹스를 제거하고 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어 후. </li><li> 마지막 세척 후 PBS를 제거하고 PBS에서 Calbindin 항체의 1천분의 1 희석 250 μL를 추가하고 4 밤새 품어 ° 어둠 속에 C. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거하고 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 이차 항체의 추가 250 μL은 어둠 속에서 실온에서 최소한 세 시간은 PBS와 부화의 1 / 500 희석. 우리가 사용하는 TUNEL 키트는 TMR 빨간색으로 표시되므로 Calbindin위한 보조 항체는 알렉사 - 488에 복합이다. </li><li> PBS로 10 분 동안 세 번 씻고 DAPI를 포함하는 설치 미디어를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 슬라이스를 탑재합니다. </li><li> 각각 488 nm의과 Calbindin 및 TUNEL 위해 561 나노미터 여기 wavelenght를 사용하여 공촛점 현미경으로 이미지를 조각. </li></ol></li></ol> 3. 대표 결과 : 이 프로토콜의 주요 문제는 우리의 마지막 판독은 세포 죽음을 것입니다 특히 때문에, 건강한 소뇌 슬라이스 문화를 생성할 수 있도록합니다. 건강한 문화는 세포 몸 레이어는 투명 하나로 표시하고 현미경 (그림 1)에서 소뇌의 foliated 구조를 볼 수 있습니다. 문화의 몇 일 후에 조각이 얇고 비의 연결을 세포 시작은 조각의 가장자리로부터 멀리 마이 그 레이션 볼 수 있습니다. 문화의 몇 일 후에 조각 커버 어두운 원형 전지는 (대부분 macrophages), 결국 체외 (그림 2) 5 10-14일 후 번호 줄어 듭니다. 조각의 생존에 대한 궁극적인 증명은 Purkinje 세포와 같은 Calbindin 등 다양한 세포 마커에 대한 착색하는 것입니다. 그림 3은 몇 가지 TUNEL 긍정적인 핵으로 Purkinje 세포 층 대표 공촛점 현미경 이미지를 보여줍니다. 어떤 조각이 apoptotic 자극을받은 경우에도, 그들은 단 24 시간 동안 노출 있다고 생각하는 것이 중요합니다. 이것은 TUNEL의 얼룩과 죽어가는 세포의 DNA 조각을 관찰하기 위해 충분한 시간을 허용하지만 정의 Purkinje 세포 계층은 여전히​​ 존재했다. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. DIV2에서 건강한 소뇌 슬라이스.이 이미지는 투명한 세포 몸 레이어와 건강 통에 foliated 소뇌 구조를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. DIV 7 건강 소뇌 슬라이스.이 그림에서 우리는 여전히 소뇌와 어두운 세포 기관의 모양의 foliated 구조를 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 파 - 대우 소뇌 슬라이스의 대표 이미지는.이 공촛점 이미지 Calbindin (녹색) 및 TUNEL의 얼룩 (적색)에 대한 긍정적인 apoptotic 세포 물들일 Purkinje 세포를 보여줍니다. Purkinje 세포는 하나의 연속으로 표시되지 않지만 folium 같은 구조를 형성 클러스터 있습니다.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

진행 모든 동물의 작업은 IACUC에 의해 설립 정책에 따라 이루어졌다. 솔크 연구소는 AAALAC 인증 시설입니다.

이 방법의 연결 organotypic 문화의 여러 가지 응용 프로그램 중 하나를 설명하고 그것은 우리가 야생 유형 및 돌연변이 소뇌 조각에서 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 수 있습니다. 본 실험의 가장 중요한 부분은 지속적으로 건강 소뇌 슬라이스 문화를 생성할 수 있도록합니다. 핵심 요소는 해부하고 깔끔히 기술과 가능한 최소 시간에 프로토콜을 수행할 수있는 능력이 있지만, 동시에 신중하면 조각을 손상하지 않습니다. 또 다른 중요한 요인은 문화 미디어의 준비 및 구성이며, 이러한 문화는 매우 민감합니다, 그래서 우리는 미디어의 여러 조리법과 브랜드를 테스트했습니다. 혈청 또는 미디어의 다른 구성 요소도 다른 배치는 조각의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 Invitrogen 롯 # 480116에서 호스의 세럼과 함께 최상의 결과가 나왔어요. 소뇌 슬라이스가 생성되면 하나는 소뇌 개발, 전기 생리학, 세포 생존 혼자 또는 apoptotic 자극, excitotoxicity 또는 산소가 결핍되어서에 대한 응답으로 공부를하실 수 있습니다. 야생 타입과 돌연변이 소뇌 조각을 사용하여 비교 연구는 소뇌 기능과 개발의 여러 측면에서 매우 통찰력이있다.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청(Horse Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>순간접착제(Superglue)</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 well / 24 well 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>30mm 배양 플레이트 인서트 (0.4-&amp;mu;m 공극)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>정제된 NA/LE 햄스터 anti-mouse CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; 세포 사멸 검출 키트, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>토끼 anti-Calbindin D-28k 항체</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-염소 anti-rabbit IgG 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 포함 Vectashield 마운팅 매질</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic 소뇌 문화 : apoptotic 도전과 감지

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

의 연결 조직 Organotypic 문화가 처음 1947 년 1,2 호그에 의해 소개되었으며 신경 과학 분야의 주요 돌파구를 형성했습니다. 그 이후,이 기술은 더욱 발전하여 현재 organotypic 문화를 준비하는 방법에는 여러 가지가 있습니다했습니다. 방법은 Stoppini 외에 기술된 하나에서 적응되었다 여기에 제시했습니다. 슬라이스의 준비 및 Gogolla 외에서. 얼룩 절차 3,4하십시오. 이 기법의 독특한 기능은 모든 세포 조직과의 연결 네트워크가 중단되는 dissociated 문화 비해 큰 장점을 제공합니다, 당신이 원래 구조로 해마 또는 소뇌 등 뇌의 다른 부분을 공부 수 있도록하는 것입니다. 그것이 dissociated 기본 문화로 얻을 수 Purkinje 세포의 연구가 매우 어렵습 수 있기 때문에 소뇌의 경우는 훨씬 더 유리한 것입니다. 이 방법은 체외에서 소뇌의 특정 발달 기능을 연구뿐만 아니라, 야생의 종류와 돌연변이 생쥐 모두에서 electrophysiological 및 약리 실험하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 apoptotic 세포 죽음을 측정하는 TUNEL 염색법을 사용하여 이러한 개발 소뇌의 파의 리간드로 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. TUNEL의 얼룩이 Purkinje 세포에 대한 이러한 Calbindin 같은 세포 유형 특정 마커와 결합하는 경우, 그것은 세포 인구 구체적인 방식으로 세포 죽음을 평가하는 것이 가능합니다. Calbindin의 얼룩은 또한 소뇌 문화의 품질을 평가의 목적을 제공합니다.

이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

신경 조직의 장기배양(Organotypic cultures)은 1947년 Hogue에 의해 처음 도입되었으며 1,2, 신경과학 분야의 중대한 돌파구가 되었습니다. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 야생형 및 돌연변이 생쥐의 발달 중인 소뇌에서 세포 사멸 유도 자극제인 fast ligand의 영향을 조사하는 것입니다. 이를 위해 우선 생후 8일에서 12일 사이의 야생형 및 녹아웃 생쥐의 뇌를 해부합니다. 두 번째 단계로 뇌를 400 µm 두께의 절편으로 자르고 각 절편에서 소뇌를 분리합니다.세 번째 단계는 fast ligand로 세포 사멸을 유도하기 전, 소뇌 절편이 건강한 상태인지 확인하기 위해 5일 동안 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 apoptotic marker인 tunnel의 면역형광 염색과 Purkinje 세포를 위한 calbindin과 같은 세포 유형 특이적 마커를 결합하여, 야생형 및 녹아웃 생쥐의 서로 다른 소뇌 세포 집단에서 fast ligand의 효과를 분석하는 것입니다. 소뇌 절편 배양의 주요 장점은 신경망과 여러 조직 구조가 파괴되는 일차 해리 배양과 달리, 소뇌의 지역적 구조와 형태를 유지할 수 있다는 점입니다.따라서 이 방법은 야생형과 돌연변이 마우스를 모두 보유하고 있다는 점에서 신경과학의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 것을 가능하게 할 것입니다. 이를 통해 비교 발달 연구는 물론 생리학, 전기생리학 및 약리학 연구가 가능합니다. 이 방법은 소뇌의 세포 생존에서 fast ligand의 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 피질과 해마에서 fast ligand의 효과를 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 어려움을 겪을 수 있는데, 건강한 소뇌 용해물을 얻기 위해서는 조직의 무결성을 손상시키지 않으면서 최대한 빨리 배양액에 넣는 것이 매우 중요하기 때문입니다. 따라서 전체 과정을 시도하기 전에 능숙한 해부 및 절편 제작 기술을 갖추는 것이 중요합니다. 가능한 경우에 그렇게 하십시오.다음 절차의 단계들은 박리 전 조직 배양 후드 내에서 수행해야 합니다. 뇌 박리 및 슬라이스 제작을 위한 A CSF 배지와 슬라이스 배양 배지를 작성된 프로토콜에 따라 준비하고, 박리 당일에 4°C에서 보관하십시오. 소뇌 슬라이스 배양을 위한 조직 배양 플레이트를 준비하십시오.6-웰 플레이트의 각 웰에 슬라이스 배양 배지 1 mL를 넣습니다. 그다음 멸균 핀셋을 사용하여 배양 플레이트 인서트를 각각 넣습니다. 이때 인서트 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오.배지를 사전 처리하기 위해 배양 플레이트를 37°C, 5% 이산화탄소로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 최소 2시간 동안 둡니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 CSF 배지에 카보젠 가스를 버블링합니다. 배지를 카보젠으로 포화시키면 용액의 pH가 변경되어 색상이 빨간색에서 주황색으로 변합니다.얼음처럼 차갑게 식혀 기포를 제거한 A CSF 배지를 멸균 페트리 접시와 6-웰 플레이트에 조금씩 붓습니다. 이를 뇌 절편 제작에 사용할 vibrato 플레이트와 함께 얼음 위에 놓습니다. 기포를 제거한 차가운 A CSF 배지가 담긴 페트리 접시는 해부 후 P8에서 P12 단계의 생쥐 새끼로부터 뇌를 분리하는 데 사용됩니다.면도날을 사용하여 한쪽 뇌 반구에 시상절개(sagittal cut)를 하여 진동 플레이트에 장착할 수 있는 평평한 표면을 만듭니다. 피질의 전방(rostral) 부분 또한 절단할 수 있습니다. 냉각된 진동 플레이트를 페이퍼 타월로 닦아 건조시킵니다.그런 다음 스테이지에 순간접착제를 약간 바르고, 순간접착제 튜브의 끝부분을 이용해 지그재그 모양으로 펴 바릅니다. 접착층을 얇게 형성하기 위해, 스파튤라를 사용하여 뇌의 평평한 면이 순간접착제와 닿도록 하여 바이브레이토 스테이지로 옮깁니다. 뇌가 바이브람 플레이트에 부착되면, 뇌가 충분히 잠길 정도로 A CSF 배지를 첨가하고 플레이트 아래에 얼음을 배치하여 차갑게 유지합니다.뇌를 400 µm 두께의 절편으로 자릅니다. 그다지 끝부분을 넓게 자른 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여, 해부 현미경 하에서 얼음 위에 놓인 aCSF 배지가 담긴 6-웰 플레이트로 절편을 옮깁니다.직경이 작은 28 gauge 바늘이 달린 인슐린 주사기 두 개를 사용하여 소뇌를 뇌의 나머지 부분과 분리합니다. 절편의 가장자리에 순간접착제가 묻어 있는 경우, 두 개의 주사기 바늘을 사용하여 절편에서 접착제를 제거합니다. 끝부분을 잘라 넓힌 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여 절편을 필터 상단으로 옮깁니다.인서트당 1~3개의 절편을 추가하여 절편이 완전히 펴져 있고 액체에 덮이지 않았는지 확인합니다. 필요한 경우, 37 °C 및 5% CO2로 배양된 피펫으로 과잉 배지를 흡입합니다. 48시간 후, 배지 부피의 절반을 신선한 배지로 교체하며, 이때 인서트 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의합니다.남은 원래의 배지는 세포 생존에 중요한 분비 유래 영양 인자들을 포함하고 있습니다. 세포 배양 5일 후에 세포 사멸 유도 처리를 수행합니다. 처리할 웰의 세포 배양 배지에 신속 작용제 항체 JO two를 첨가하십시오.웰의 절반은 대조군으로 처리하지 않은 채 둡니다. 24시간이 경과하면 웰 아래의 배지를 흡입하여 제거합니다. 그 후 인서트 아래에 얼음처럼 차가운 4%paraformaldehyde 1 mL를 피펫팅하고 인서트 위에 PFA 1 mL를 추가하여 슬라이스를 고정합니다.슬라이스를 PFA에 10분간 상온에서 고정시킵니다. PFA를 흡입하여 제거하고 2 mL의 차가운 PBS로 짧게 세척합니다. 이때 인서트 위쪽에 1 mL, 인서트 아래쪽에 1 mL를 파이펫팅하여 넣어줍니다.다음으로, PBS를 흡입하여 제거하고 인서트 아래쪽과 위쪽에 각각 20% 얼음 냉각 methanol/PBS 1 mL를 피펫으로 분주합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 후, 웰에서 20% methanol을 흡입하여 제거하고 슬라이스와 D 웰을 PBS로 세척합니다. 이전과 동일하게, 인서트 위쪽에 0.5% Triton X 100/PBS 1 mL를 분주하고, 인서트 아래쪽에 추가로 1 mL를 분주합니다.투과 처리 후 슬라이스에 투과가 이루어지도록 4°C에서 최소 12시간 동안 배양합니다. PBS 내 0.5% Triton X 100을 흡입하여 제거하고, 슬라이스 위와 아래에 각각 PBS 내 20% BSA 1mL를 피펫으로 분주합니다. 슬라이스를 실온에서 최소 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹합니다.블로킹이 완료되면, 깨끗한 가위로 소뇌 절편에 부착된 멤브레인 인서트 조각을 조심스럽게 잘라냅니다. 그 다음, 깨끗한 핀셋을 사용하여 멤브레인 조각을 PBS가 들어있는 24웰 플레이트로 옮깁니다. PBS를 흡입하여 제거하고 각 웰에 250 µL의 TUNEL 시약을 첨가합니다. 이때 시약이 절편의 전체 표면을 덮도록 합니다.암소에서 37°C로 1시간 동안 배양합니다. 1시간이 지나면 웰에서 터널 시약을 흡입하여 제거하고 500 µL의 PBS로 교체합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하며 실온에서 10분 동안 배양하여 세척합니다.마지막 세척 후 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. PBS를 흡입하여 제거하고, PBS로 1:1000으로 희석한 calbindin 항체 250 microliters를 첨가한 후 4 °C 암실에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날,1차 항체 용액을 흡입하여 제거하고 PBS로 10분 동안 3회 세척합니다. 그다음 PBS에 1:500으로 희석한 2차 항체 250 µL를 첨가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다.절편을 PBS로 10분씩 3회 세척하고, dappy가 포함된 마운팅 용액을 사용합니다. 절편을 유리 현미경 슬라이드와 커버 슬립에 마운팅합니다. 공초점 현미경을 사용하여 kale, bendin, 그리고 tunnel에 대해 각각 488 nanometer 및 561 nanometer 여기 파장으로 절편을 촬영합니다.이 이미지는 건강한 소뇌 절편을 보여줍니다. 체외 배양 2일 후, 세포체 층은 반투명하게 나타나며 소뇌의 엽상 구조가 현미경 하에서 뚜렷하게 관찰됩니다. 체외 배양 7일 후에도 건강한 소뇌 절편의 엽상 구조는 여전히 관찰됩니다.또한, 아마도 대식세포일 것으로 생각되는 어두운 세포체들이 슬라이스를 덮고 있을 가능성이 큽니다. 여기에서 보이는 공초점 이미지는 빠르게 처리된 소뇌 슬라이스의 대표적인 모습입니다. 비키니 세포(bikini cells)는 1차 항체로 염색한 후, Alexa 488이 결합된 2차 항체로 염색하여 녹색으로 나타납니다.사용된 TUNEL 키트는 TMR로 표지되어 있으므로, TUNEL 염색 양성인 세포사멸 세포는 빨간색으로 나타납니다. 빨간색 Bikini 세포는 단일 행으로 나타나지 않고, 이 절차를 수행하는 동안 군집을 이루어 구조를 형성합니다. 가능한 한 항상 조직 배양 후드 내에서 작업하고, 뇌 조직이 박테리아나 곰팡이와 같은 잠재적 오염 물질에 노출되는 시간을 최소화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.본 절차를 활용하여 생화학 및 전기생리학적 분석을 포함한 다른 방법들을 이 절편들에 적용함으로써, 단백질 함량뿐만 아니라 신경세포 흥분성에 관한 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 본래 fast 경로에 영향을 주는 돌연변이를 보유한 Perkin 세포에서 fast 매개 세포 사멸의 효과를 연구하기 위해 개발되었습니다. Perial 세포는 일차 배양에서 거의 생존하지 못합니다.따라서 이 절차는 가장 최선의 실험적 접근 방식이었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 대뇌 피질 절편을 제작하는 방법과 에피네프린 자극 및 그것이 다양한 대뇌 세포 유형에 미치는 영향을 어떻게 연구할 수 있는지에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

이 비디오는 쥐 강아지의 뇌에서 소뇌 유기형 절편을 채취하여 영양소와 성장 인자로 보충된 배지에서 절편을 배양하여 체외에서  소뇌 발달을 모방하는 기술을 보여줍니다.또한 특정 소뇌 절편을 테스트 화합물로 처리하고 면역형광 염색 기술을 사용하여 화합물의 신경 보호 능력을 분석합니다.

유기형 소뇌 절편 배양에서 Purkinje 세포 생존 분석

이 비디오는 플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용한 이중 염색을 사용하여 소뇌 과립 뉴런과 신경교세포의 혼합 배양에서 뉴런을 식별하는 방법을 보여줍니다.

이중 염색을 통한 소뇌 뉴런 배양에서 신경 세포 생존력 평가

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.

오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

소뇌 Purkinje 세포(PC)는 DNA 손상 반응의 결핍에 특히 민감합니다. DNA 손상에 대한 PC 반응의 역학을 시각적으로 평가하기 위한 프로토콜이 제시되며, 여기에는 소뇌 기관형 배양 내 단백질 결합 폴리(ADP-ribose) 사슬 염색이 포함됩니다.

소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화

배우세요 소뇌 조직형 배양 기술로 약물 유도 세포사멸을 연구하는 방법을. 야생형 및 돌연변이 마우스의 소뇌 세포 생존율을 면역형광 분석으로 평가하여 신경과학 연구에 활용합니다.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

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