Name: Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 학습하세요 신경계 발달 연구를 위한 3D 조직 배양 및 타임랩스 영상 기법. 대뇌피질 단백질 추출물에 반응하는 강신경절 돌기 세포의 철새 행동을 정량적으로 분석하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 국방부 부여 PT074620 (SLJ)와 NIH 그랜트 R01NS245014 (SLJ)에 의해 지원되었다.

1. 시약 준비 <ol><li> 해동은 실험 (활성 온난화에 의해 처리 속도를하지 않음)하기 전에 충분한 시간을두고, 젖은 얼음에 Matrigel을 냉동. Matrigel가 밀접하게 세포의 마이 그 레이션에 도움이되는 세포외 기질과 유사한 3D 환경을 구축하는 데 사용됩니다. 이것은 기판과 기계 모두 표시할 수와 세포를 제공합니다. Matrigel은 -20 ° C.에 냉동 저장됩니다 사용하기 전에, 그것이 점차적으로 0-4의 온도까지 가지고 있어야 ° C, 즉이 젖었 얼음이나 냉장고에 해동. Matrigel은 irreversibly 인큐베이션의 온도 (37 ° C)에서 젤 형태로 설정합니다. 따라서 그것은 따뜻한 물에 컨테이너를 immersing하여 해동 속도를하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 단백질 분수는 출생 후의 일 0 (P0) 페렛의 대뇌 피질에서 총 단백질 추출물의 isoelectric 초점 (IEF)에 의해 준비가되어 있습니다. 분리 후, 분수가 조직에 독성 수도 초점 버퍼 성분에서 추출한 청소 20mM 트리스 - HCL pH7.2에 대한 하룻밤 dialyzed 있습니다. </li><li> 대뇌 피질에서 추출된 단백질 전달 시스템입니다. 단백질은 다음 천천히 형광 기능 microspheres의 영상 처리에 도움의 사이트에서도 최소한 spillovers 쉽게 검출을 허용 것을 발견 environment.We에 단백질을 출시 형광 라텍스 구슬에 adsorbed 아르 형광 현미경으로 관찰 구슬 예금. <ol class="lalpha"><li> 단백질 용액 100 - 200μl에 형광 구슬의 10μl를 추가 </li><li> 흔드는에서 RT에 어둠 속에서 30 분 대한 부화 </li><li> 최대 속도로 1 시간을위한 벤치의 원심 분리기에서 비즈를 스핀 다운 </li><li> 뜨는 제거 </li><li> 신선한 매체의 10μl를 사용하여 소용돌이에 다시 중지 </li><li> 중지 Matrigel의 30μl를 추가, 잘 믹스하고 얼음에 놓으십시오. </li></ol></li><li> 버퍼와 미디어 <ol><li> 인공 뇌척수를 (; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, 아니 2 PO 4 1.2mM, 3.2mM KCl, MgSO 4 1.2mM, CaCl 2 2.4mM, 10mM 포도당 aCSF) 준비하고 여과 - 소독. 미리 aCSF을 슬러쉬 - 동결, 그래서 그것이 조직 해부의 시간에 준비가되지.하려면, -80 ° C의 냉동고에 살균 aCSF 가득한 플라스틱 플라스크를 놓으십시오. 그래서 얼음 층 벽 안쪽에 빌드 때, 그것을 휴식하고 유체와 혼합, 자주마다 냉동 모니터링합니다. 술병은 대부분 얼음 윤활유를 포함 때까지 반복합니다. 버퍼뿐만 아니라 조직의 생존을 지원하는이 방법을 준비하지만, 낮은 온도가 더 이상 인정할 것이다 게다가, 청키 얼음 조각보다는 조직에 기계적으로 덜 유해합니다. </li><li> N - 2, B - 27 보충은 제조 업체의 제안뿐만 아니라 1mg/100ml gentamycin, 2 MM L - 글루타민, 및 0.6 % 포도당에 따라 추가되었습니다.들과 Neurobasal 매체를 준비 0.22μm 세포막을 통해 여과하여 소독. 37 보온 ° C를 사용까지. </li></ol></li><li> 문화 플레이트 <ol class="lalpha"><li> 문화 학년 플라스틱 여섯 잘 플레이트는 20μl 피펫 팁을 사용하여 감기 Matrigel 소량 (2μl에 대한)를 중심으로 각 우물을 dotting, 각 드롭 autoclaved 라운드 18mm 유리 coverslip을 배치 준비가되어 있습니다. 나도 접시이나 coverslips 달리 문화가 대접 필요가 없습니다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 뇌 조직을 구하기 <ol class="lalpha"><li> 깊이 Euthasol과 동물을 anesthetizing 후, 머리를 제거하고 얼음처럼 차가운 aCSF에 배치 </li><li> 메스로 반구를 분리하고 얼음처럼 차가운 aCSF을 포함하는 작은 그릇에 조각을 수집, 선택의 장치를 사용하여 500μm에서 coronally 슬라이스 </li></ol></li><li> 만들기 explants (해부 현미경을 사용) <ol class="a"><li> GE를 통해 내면 추가 단계를 방해할 수 있습니다 ganglionic eminences (GE)과 피질의 트림 지역을 포함하는 조각을 식별 </li><li> GE의 심실 표면에 가까운 지역에 구멍 해리스 유니 코어를 눌러 주로 심실 영역을 포함하는 핵심을 접어야하고 얼음처럼 차가운 매체 (Fig.1)에 플런저로 추방. 0.5의 서너 explants가 mm 직경은 단일 P0 페렛 뇌 슬라이스에 GE에서 할 수 있습니다. 설치류와 기가 실려 모두에서, 중간과 측면 릿지이 나이에 융합되는 유의하시기 바랍니다. 코어 통에 숙박이나 음식의 플라스틱 바닥에 붙어있다면, 차가운 Neurobasal 매체를 포함하는 그릇에 피펫과 피펫 팁 및 전달 aCSF를 squirting하여 동원. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오. </li><li> explants가 완전히 잠겨와 거품을 피하게 할 간병, 별도의 접시에 배치 얼음처럼 차가운 Matrigel의 큰 드롭 (0.25 - 0.5ml 정도)로 매체에서 explants의 배치를 전송합니다. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오. 배치의 크기는 워크플로우 하류의 속도에 따라 달라집니다. </li></ol></li></ol> 3. 문화 설치 (해부 현미경을 사용) <ol><li> 항상 경화를 방지하기 위해 Matrigel 얼음에 Matrigel 함유 믹스를 유지. </li><li> 리믹스 비드 정지 장소 이전에 잘 20μl 피펫 팁을 사용하여 문화 접시에 놓인 유리 coverslip의 중심에 얼음처럼 차가운 Matrigel에 비드 정지 1 - 2μl 이하. 조금을 설정하자 건조하지 마십시오. </li><li> 20μl 피펫 팁을 사용하면 Matrigel 드롭에서 2 explants를 선택하고 반대편에 대칭 (떨어진 보증금의 가장자리에서 1mm 이상) 비드 보증금을 원하는 주변에서 그들을 놓으십시오. 는 상온에서 5 분 이상 더 이상을 설정하자. 단계의 오른쪽시기가 B와 C가 중요합니다. 시간이 너무 짧은 경우에는 그것은 그들이 Matrigel의 최종 층으로 덮여있을 때 이동 문화 설치의 불완전 겔화 및 부품으로 이어질 것이며 시간이 너무 긴 경우 그것은의 젤과 창조 이상의 건조가 발생할 수 있습니다 세포의 자유로운 움직임을 방해 물리적인 장벽. </li><li> explants (Fig.2) 이상을 확대, Matrigel의 30μl 약 평면 레이어로 비즈와 explant 표지. 약 15 분 동안은 인큐베이터에서 설정하자. </li><li> 보조제와 함께 Neurobasal 매체의 2ml를 추가합니다. </li><li> 매일 37 ° C 5 % CO 2 / 95% O 2 모니터링 철새 활동 품어. </li></ol> 4. 라이브 영상 <ol><li> 3-4일에 대한 부화 후, 문화 접시를 검토하고 관심 coverslips를 선택합니다. explants은 세포의 반경 유니폼 구름을 생성한다. 라이브 영상에 사용될 수있는 새로운 문화 접시에 선택한 coverslips를 교체하십시오. </li><li> coverslips 밤 동안 새 접시에 앉아 보자. 이미징을위한 현미경의 번호판을 배치하기 전에, 세포 배양 후드에 coverslip 및 세포 배양 플레이트 사이의 수집에 microbubbles을 공개하기 위해 coverslip을 이동하는 살균 주걱을 사용합니다. 거품의 간섭은 이미지를 망치는 것입니다. 잘의 중심에 coverslips 이동합니다. </li><li> 증발을 방지하기 위해 물을 우물 사이의 공간을 채우십시오. </li><li> 우물의 중심에서 coverslips를 이동하지 않도록으로 세포 배양 후드에서 현미경으로 접시를 주의깊게 전송합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 방식을 정의합니다. 문화 설정의 3D 특성으로 인해 세포가도 수직으로 이동, 따라서 그것은 이주 구름의 전체 깊이를 포함한 Z - 비행기를 수집하는 것이 중요합니다. 몇 군데 지역의 XY 범위는 또한 상대 explant의 각도 방향 및 마이 그 레이션하는 세포를 기록, 녹음의 과정에서 마이 그 레이션 세포에 의해 채워진 것으로 예측된 영역을 커버하고 위해 비드 보증금을 포함할 정도로 큰 설정해야합니다 단백질의 소스. 또한 더 군데 Z의 비행기, 또는 더 많은 지역, 그건 샘플 및 세포 추적의 시간적 해상도의 손실 사이의 긴 시간 간격을 강요, 특정 시점에서 사이클을 기록하는 데 걸리는 시간을 더 적용되는 고려하십시오. 우리의 경우에는 10 배 목표를 사용하여 최적의 계획은 10 각각의 Z - 비행기 30 분 간격으로 모든 20μm를 간격을위한 3x3 타일 녹음했습니다. 우리는 30 분 간격으로 자신들의 움직임에 안정적인 추적을위한 중요 연속 시간 지점에서 세포의 애매하지 않은 신분을 허용하는 가장 긴을 발견했습니다. </li><li> 시간 경과 이미징을 시작합니다. </li><li> 원하는 시간 후, 접시를 제거하고 4퍼센트 인산염 버퍼 paraformaldehyde의 문화를 해결할 수 있습니다. 그것은 더 형태학의와 immunocytochemical 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 운동의 분석 <ol><li> 추가 처리를위한 가장 편리한 형식, TIFF는 가장 휴대용으로 하나되는 이미지의 기록 시간 시리즈를 변환합니다. </li><li> 녹음 XY 좌표에 의해 시간이 지남에 따라 개별 세포의 움직임을 추적합니다.이 매뉴얼 추적 플러그인, 또는 ImagePro, Volicity 또는 AutoQuant 같은 다른 상업적인 응용 프로그램과 함께 ImageJ (NIH)과 같은 자유롭게 사용할 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> Excel 또는 자체 개발한 소프트웨어를 사용하여 트랙을 플롯. </li><li> 각 추적 세포는 같은 평균 속도, 경로의 곡률, 시간이 지남에 따라 방향 다양성, 분기, 단백질의 원천 대한 편차로 운동 매개 변수를 계산에 대한 등 계산은 MS Excel 또는 이와 동등한 스프레드 시트에서 할 수 있습니다. 그들은 그보다 더 정교한 분석 방법을보다 유연 사용자 정의 및 포함을 허용으로 우리의 경험, 그것이 사내 스크립트를 (R, Matlab, 파이썬, 펄 혹은 다른 주로 오픈 소스 언어를 사용) 개발 훨씬 더 생산적는 것을 나타냅니다 엑셀의 기본 설치 가능합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 해부 학적 origi의 다이어그램N explants니다. 이것은 hemisected 페렛 두뇌의 코로나 조각의 그림입니다. 회색 동그라미 explants을 찍은하는 지역을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 문화 설치 프로그램의 다이어그램. 비드 보증금 단백질의 원천이며 explants가 양쪽에 위치하고 있으며 모든 요소가 Matrigel 덮여있다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. quadrants (비드 보증금 방향 화살표 지점)에 의해 색깔 세포 트랙에 해당 플롯. 오른쪽에 셀 트랙 세포를 유치하기 위해 나타나는 분수 D, 대한 마이 그 레이션되며 왼쪽에있는 세포가 마이 그 레이션 세포를 격퇴하기 위해 나타나는 분수 방면 마이 그 레이션됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. explant 밖으로 마이 그 레이션하는 세포의 성장을 보여주는 구름 선택한 timepoints에서 이미지의) 일련의. (스케일 바 200μm) 아래에 표시로 화살표로 표시 예제 세포는, 시간을 통해 추적할 수 있습니다. 이 explant은 38 H. 삶의 이미지와 함께 시각했습니다 . B) 세포는 시간이 표시된 부분에 표시된 최종 이미지로 이미지를 기록 처음부터 explant 떠나 세포의 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포는 반복 분기 (스케일 바 50μm)을 보여줍니다.

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</ol>

동물을 사용 : 동물과 관련된 모든 절차 USUHS와 NIH 기관 지침에 따라 수행하고 USUHS IACUC 승인되었습니다.

여기 우리가 화학 신호에 대한 응답으로 신경 세포의 철새 행동을 연구하고 분석하는 간단한 시스템을 제시한다. 체외 마이 그 레이션 assays에서 세포의 운동에 영향을 미치는 세포 분자를 식별하는 데 사용되었습니다. 우리의 패러다임은 공부를 각각의 세포 상호 작용에있는 3 차원 (3D) 환경을 보장합니다. . 그것은 세포외 기질 (예 : Hirschberg 외 &#39;10과 상호 작용함으로써 찾아볼 수없는, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip의 평평한 표면에 이동하도록 강요 아르 세포 explants 밖으로 마이 그 레이션 문화에 비해 상당한 장점이다; 8. Métin 외. &#39;07). 세포가 세로 가로 자유에 비해 바닥에 유리 coverslip 상대적으로 얇은입니다 Matrigel의 상단 표면 사이의 공간에 제약이 있으므로 그러나 추적 마이 그 레이션하는 세포의 큰 규모에 관하여는, 2 차원 유지 마이 그 레이션. 이러한 설정은 여전히​​ 본질적으로 2 차원 운동의 유적 쉽게 분석을 위해 수 있습니다. . 마티니 동부 표준시, 콜라겐이나 Matrigel에 포함된 GE 세포의 GE의 explants하거나 다시 집계 구성된 비슷한 3D 패러다임은 이전에 화학 신호의 소스 (예 : Liodis 외 &#39;07로서 특정 신호 단백질을 표현하는 세포의 집계를 사용하여 고용했다 .. 알 &#39;09,. Nóbrega - 페레 외 &#39;08; Wichterle 외 &#39;03).. 여기서 제시하는 방법은 시스템이 특히 적합, 단백질은 매체에 직접 추가보다 높은 지역 환경에 지속적인 수준에 대해 허용을 준수 단백질과 라텍스 구슬의 형태로 속도가 느린 릴리스 시스템을 사용하면 사용 가능한 양을 단백질은 단백질의 복잡한 혼합물이 테스트 때 제한이나됩니다. 구슬의 선택은 라텍스 기반 제품에 한정하고, 또한 다른 재료, 예를 들어, 아가로 오스 비즈, 다양한 특성과 각각 포함되지 않습니다. 추가 분석의 밀도를 증가하기 위해, 우리는 반대편에있는 비즈 입금 apposed이 explants를 사용합니다. 원산지의 특정 영역을 보장하기 위해, 우리는 세포의 소스로 ganglionic 에미넨스 explants를 사용했습니다. 우리는 ganglionic 예하의 중간과 측면 부분의 차이를 평가하지만, 어떤 차이를 보지 못했어요. 우리는이 연구가 기가 실려을 사용하는 지적한다,이 종류에있는 중간과 측면 ganglionic eminences은 (. Poluch 외 &#39;08) 설치류보다 이전 퓨즈. 문화가 만들어진 시간 (P0)의 중간과 측면 ganglionic eminences는 네크로 텍스 채우지 많은 세포가 여전히 발생하고 마이 그 레이션되고있다하더라도, 융합되었다. 세포의 진정한 동질적인 소스가 선호하는 경우 그러나, 세포 현탁액은 해부 조직에서 준비할 수 있으며, 직접 Matrigel과 혼합하거나, 또는 아래로 돌다 결과 펠렛은 &#39;explants&#39;을 만들어 냈어. proteolytic 활동도 잔여 흔적이 실험의 과정을 통해 Matrigel 녹일 수에 대한 세포 현탁액을 준비하는 효소 조직 소화의 사용은 낙담이다. 또한, 실사는 문화 설치의 타이밍에 적용되어야합니다. Matrigel은 온난 기간은 건조 공기 원인과 마이 그 레이션 세포로 꿰뚫을 수 있으며, 지울 수없는 쉘에있는 결과에 Matrigel의 작은 방울의 노출 (이 프로토콜에서 사용되는)의도 약간 연장 기간을 중합하기 위해 필요하지만 신선한 Matrigel과 후속 취재하여.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </td><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Neurobasal 중간 (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2 보충 (100X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B - 27 보충 (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085 - SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel의 지하 막 매트릭스 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어, 0.5mm 크기 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 69036-05 </td><td> 펀치 구멍 </td></tr><tr><td> 그린 Retrobeads IX </td><td> Lumafluor 주식 회사 </td><td></td><td> 라텍스 microspheres </td></tr></tbody></table>

ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

세포의 마이 그 레이션은 척추 중추 신경계의 발달과 성숙 (헤튼, 99)에 연결 일반적인 과정이다. 흥분성의 억제와 : 대뇌 피질은 두 가지 기본 유형의 연결로 구성되어 있습니다. 이러한 세포는 뚜렷한 지역에서 발생하고 다른 노선 (Pearlman 외., 98)을 따라 피질로 마이 그 레이션. 억제 interneurons 대부분은 ganglionic eminences (.; 쑤 외, &#39;04. Gelman 외, &#39;09)의 여러 지역에서 tangentially subcortical 소스로부터 마이 그 레이션. (; 헤튼, &#39;90 년, Rakic​​, &#39;90 년 카비 &amp; Rakic​​, 78) 그들의 운동은 대뇌 피질에 적절한 cytoarchitecture 및 연결의 설립 수 있도록, 환경 신호에 의해 부과된 정확한 spatiotemporal 컨트롤이 필요합니다. 체외에서 신생아 기가 실려에 ganglionic eminences (GE)의 proliferative 영역에서 생성된 세포의 철새 동작을 연구하기 위해 우리는 BD Matrigel 매트릭스의 3 차원 문화 배치를 사용했습니다. 문화 설치 두 GE의 explants 및 대뇌 피질에서 추출하고 explants (.; 리들 외, 97. 외를 Hasling, &#39;03) 사이에 위치 형광 라텍스 Retrobeads IX에 adsorbed 테스트 단백질의 소스로 구성되어. 문화로부터 2-3 일 후에, 세포는 요골 방향으로 조직을 떠날 성향을 보여주는 explant의 가장자리에 나타나는 시작합니다. 라이브 영상은 세포를 라벨링 또는 마킹의 필요성없이 철새 패턴의 관찰을 허용했다. isochronic 페렛 피질에서 얻은 추출물 단백질의 분수에 노출되면, GE 세포는 각 세포의 이동 정량 분석​​ 운동에 의해 판단으로 다른 동작을 표시합니다.

3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

세포 이동은 척추동물의 중추신경계 발달과 성숙을 이끄는 보편적인 과정입니다 (Hatten, '99). 대뇌...

본 절차에서는 대뇌 피질 단백질 추출물의 서로 다른 분획이 신경절 융기에서 대뇌 피질로의 세포 이동에 미치는 영향을 연구하기 위해 인비트로(in vitro) 배양 시스템을 구축합니다. 먼저, 단백질이 서서히 방출되는 공급원을 준비하기 위해 라텍스 미세구체를 개별 분획과 함께 배양합니다. 그 후 페렛의 뇌를 적출하여 두꺼운 관상면 절편으로 자릅니다.신경절 융기(ganglion eminences)에서 조직 절편을 펀칭하여 추출합니다. 마이크로구체와 조직 절편을 세포외 기질(extracellular matrix)에 매립하여 3차원 배양 시스템을 구축합니다. 일정 기간 배양 후, 명시야 현미경을 이용하여 타임랩스 이미지 기록을 수행합니다.화학주성 챔버를 사용하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 개별 세포의 이동을 관찰하고 정량화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 화학주성 및 Kama의 운동성 속도론적 제어와 같이 신경계 발달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 Matrigel이 포함된 작은 조직 이식편을 다루는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, Matrigel이 해동되는 동안 매트릭스가 조기에 고형화되지 않도록 온도를 충분히 낮게 유지하며 젖은 얼음 위에서 서서히 해동하십시오. 500 mL의 인공 뇌척수액(A CSF)을 여과 멸균한 후, 플라스틱 플라스크에 담아 -80°C 냉동고에 넣어 슬러시 상태로 급속 냉동하십시오.플라스크 벽면에 얇은 얼음층이 형성되면 플라스크를 흔들어 이를 제거하고, 다시 얼음층이 형성되도록 하여 적절한 슬러리 상태가 될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 neuro basal medium을 준비하고 여과법으로 멸균합니다. 0.22 µm 필터 막을 통과시킨 후, 단백질 분획이 형광 라텍스 미세구 또는 비드에 흡착되어 Matrigel 내부로 확산될 준비가 될 때까지 37 °C에서 배양합니다. 이후 100~200 µL의 다섯 가지 서로 다른 단백질 분획이 각각 들어 있는 EOR 튜브에 비드 10 µL를 각각 첨가합니다.교반기 위 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 30분간의 배양 후, 벤치탑 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 1시간 동안 비트를 침전시킵니다. uol로 동물을 깊게 마취시킨 후, 뇌 전체를 적출하여 미리 준비한 얼음처럼 차가운 A CSF에 담급니다.메스로 양쪽 뇌반구를 완전히 분리하고 관상면을 500 micrometers 두께로 절편합니다. 조직 절단기(tissue chopper) 또는 유사한 장치를 사용하여 절편을 얼음처럼 차가운 A CSF가 담긴 작은 페트리 접시에 수집하고, 이를 젖은 얼음 위에 둡니다. 해부 현미경을 사용하여 신경절 융기(ganglionic eminences) 또는 ge가 포함된 절편을 확인하고, 이후 단계에 방해가 될 수 있는 피질 부위를 잘라내어 제거합니다.GE의 뇌실 표면과 가까운 영역에 Harris 유니콘 보어를 누릅니다. 주로 뇌실 구역을 포함하는 코어를 회수하고 플런저를 사용하여 얼음처럼 차가운 neuro basal medium으로 밀어냅니다. 배지에서 임플란트 묶음을 옮겨 별도의 접시에 놓인 0.5 mL의 얼음처럼 차가운 mat gel 방울 속으로 이동시킵니다.설명자(explan)가 완전히 잠기도록 주의하며 기포가 생기지 않도록 합니다. 조직 배양 후드 내에서 배양 접시를 젖은 얼음 위에 올려둡니다. 배양액을 준비합니다.각 웰의 중앙에 2 µL의 차가운 Matrigel을 점적하여 6구 웰 플레이트를 코팅합니다. 20 µL 피펫 팁을 사용하여 각 방울 위에 오토클레이브 멸균된 직경 18 mm 유리 커버슬립을 배치합니다. 상층액을 제거하고 볼텍스 믹서를 사용하여 비즈를 10 µL의 Neurobasal medium에 재현탁하거나, 현탁액에 얼음을 녹인 Matrigel 30 µL를 첨가합니다.잘 섞은 후 얼음에 둡니다. 해부 현미경의 도움을 받아 20 µL 피펫을 사용하여 비드 현탁액 1~2 µL를 분주하고, 마르지 않도록 주의하며 1~2분 동안 그대로 둡니다. Matrigel 방울에서 두 개의 explan을 집어 비드가 증착된 곳의 원하는 인근 위치에 놓습니다.0.5~1 mm 거리를 두고 대칭적으로 반대편에 배치합니다. 상온에서 5분 이내로 설정하십시오. X eggplant의 비드를 약 30 µL의 matrigel로 평평하게 덮은 후, 37 °C 조직 배양 인큐베이터에서 15분 동안 둡니다. 배양 후 2 mL의 neuro basal medium을 첨가하고, 다시 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양합니다.배양 후 매일 이동 활성도를 모니터링하며, 방사형으로 균일한 세포 클라우드를 형성한 임플란트가 포함된 관심 커버슬립을 선택합니다. 선택한 커버슬립을 새로운 배양 플레이트에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 이미징 전, 조직 배양 후드 내에서 멸균 스파툴라를 사용하여 커버슬립을 움직여 커버슬립 아래의 마이크로 버블을 제거합니다.건조를 방지하기 위해 웰 사이의 공간을 물로 채우고, 플레이트를 조심스럽게 현미경으로 옮깁니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미징 계획을 설정합니다. z 평면 시리즈를 수집하여 배양의 3D 특성을 반드시 고려하십시오.파라미터 설정이 완료되면 타임랩스를 시작합니다. 여기에는 이동하는 세포를 생성하는 신경절(ganglion)과 융기부(eminence explan)의 대표적인 타임랩스 기록 영상이 나와 있습니다. 세포들은 조직 밖으로 방사형으로 이동합니다.단백질 공급원에 대한 이들의 끌림은 공급원의 성격에 따라 다릅니다. 이 고배율 영상에서는 개별 이동 세포를 쉽게 추적할 수 있습니다. 화살표로 표시된 바와 같이, 많은 세포가 분지하는 모습이 관찰됩니다.이 중 일부는 화살표로 표시되어 있습니다. 개별 세포의 궤적을 추적하면 추가 분석이 가능한 위치 정보를 얻을 수 있습니다. 예시 그래프는 explant를 떠나는 세포들의 뚜렷한 궤적을 통해 분획 A와 D 사이의 차별적인 반응을 보여줍니다. 숙달된 후에는.이 기법은 적절하게 수행될 경우 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 mat gel을 계속 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 단백질의 서방성 공급원을 준비하고, 3차원 조직 배양을 설정하며, 개별 세포의 움직임을 관찰하고 분석하기 위한 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

여기 SCS는 확장 axons을 함께 개발 할 수 있습니다하는 Schwann 세포 (SC) 마이그레이션 분석을 설명합니다.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부입니다. 병아리 CG 뉴런의 신경 배양신경 근육 상호 작용의 연구에서 효과적인 세포 모델 것으로 나타났다. 우리는 병아리 배아에서 CG 뉴런의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

이 다목적 프로토콜은 병아리 배아에서 두개골 신경 주름의 절제를 통해 이식 신경 볏 세포 (NCC)의 분리를 설명합니다. 도금 및 배양 시 이동 NCC가 신경 접힘 외식편에서 나와 단순화된 2D 환경에서 세포 형태 및 이동을 평가할 수 있습니다.

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

이 프로토콜은 마우스 등뿌리신경절(DRG)의 전체 마운트 및 해리 배양을 확립하는 방법과 종양-신경 상호 작용을 평가하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

학습하세요 신경계 발달 연구를 위한 3D 조직 배양 및 타임랩스 영상 기법. 대뇌피질 단백질 추출물에 반응하는 강신경절 돌기 세포의 철새 행동을 정량적으로 분석하는 방법을 익히세요.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

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