April 21st, 2011
3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.
이 절차에서는 신경절 돌출부에서 대뇌 피질로의 세포 이동이 피질 단백질 추출물의 다른 분획에 의해 어떻게 영향을 받는지 연구하기 위해 체외 배양이 설정됩니다. 첫째, 라텍스 미세구는 천천히 방출되는 단백질의 공급원을 준비하기 위해 개별 분획과 함께 배양됩니다. 흰족제비 뇌를 해부하여 관상동맥을 두꺼운 조각으로 절단합니다.
조직 익스플란트는 신경절 돌출부에서 펀칭됩니다. 세포외 기질에 내장된 미세구와 외식식물을 포함하는 3차원 배양이 설정됩니다. 일정 기간의 배양 후 타임랩스 이미지 기록은 명시야 현미경으로 수행됩니다.
화학주성 챔버 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 개별 세포의 움직임을 관찰하고 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 화학주성 및 카마(Kama)와 같은 신경계 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 운동성의 운동 제어.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 마트라 겔로 작은 조직 외식을 다루기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 먼저 젖은 얼음에서 얼어붙은 마트라 겔을 서서히 해동하여 마트리 겔이 해동되는 동안 매트릭스의 조기 응고를 방지할 수 있을 만큼 온도가 충분히 낮게 유지되도록 합니다. 필터를 살균한 다음 슬러시를 사용하면 플라스틱 플라스크를 영하 80도 냉동고에 넣어 500ml의 인공 뇌척수액 또는 CSF를 동결합니다.
벽에 얇은 얼음 층이 형성되면 플라스크를 흔들어 얼음을 부수고 멋진 슬러리가 생성될 때까지 다른 동형 층이 반복되도록 합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 신경 기저 배지를 준비하고 여과로 살균합니다. 22 마이크로미터 필터 멤브레인을 투척하여 단백질 분획을 형광 라텍스 마이크로스피어 또는 비드에 흡수하여 마트리겔로 확산시킬 준비가 될 때까지 섭씨 37도에서 배양하고, 5개의 서로 다른 단백질 분획 각각에 대해 100-200마이크로리터를 별도로 포함하는 EOR 튜브에 10마이크로리터의 비드를 추가합니다.
어두운 곳에서 셰이커로 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 배양 후 벤치탑 원심분리기를 사용하여 1시간 동안 최대 속도로 비트를 회전시킵니다. uol로 동물을 깊이 마취시킨 후 뇌 전체를 해부하고 미리 준비한 얼음처럼 차가운 A CSF에 담급니다.
메스를 사용하여 반구를 완전히 분리하고 코로나를 500마이크로미터로 자릅니다. 티슈 다지기 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 얼음처럼 차가운 CSF가 들어 있는 작은 페트리 접시에 조각을 모아 젖은 얼음 위에 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 신경절 돌출부(ganglionic eminences) 또는 ge를 포함하는 절편을 식별하고 후속 단계를 방해할 수 있는 피질 영역을 잘라냅니다.
GE의 심실 표면에 가까운 영역에서 Harris 유니콘 구멍을 누릅니다. 주로 심실 영역을 포함하는 코어를 집어넣고 플런저로 얼음 속으로 배출합니다. 차가운 신경 기저 매체. 배지의 임플란트 배치를 별도의 접시에 넣은 0.5ml 한 방울의 얼음 차가운 매트 젤로 옮깁니다.
엑스플란이 완전히 잠기고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 조직 배양 후드에서 작동하는 젖은 얼음 위에 접시를 보관하십시오. 배양을 준비합니다.
6 개의 우물 플레이트를 2 마이크로 리터의 차가운 matri gel로 중앙에 점으로 점으로 찍습니다. 20 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하고 18 밀리미터 유리 커버 커버의 오토 클레이브를 각 방울에 밀어 넣습니다. 상층액을 제거하고 와류를 사용하여 10마이크로리터의 신경 기저 매체에 비드를 다시 현탁시키거나 30마이크로리터의 얼음 해동 마트리겔을 현탁액에 추가합니다.
잘 섞어 얼음 위에 올려 놓습니다. 8개의 해부 현미경을 사용하여 20마이크로리터의 비드 현탁액을 1-2마이크로리터에 놓고 건조되지 않도록 1-2분 동안 그대로 둡니다. matri gel drop에서 두 개의 엑스플랜을 집어 비드 침전물의 원하는 근처에 놓습니다.
5-1mm 떨어진 곳에서 대칭으로 반대쪽을 가리킵니다. 실온에서 5분 이상 설정하지 마십시오. X 가지의 구슬을 약 30마이크로리터의 마트리겔로 만든 평평한 층으로 덮고 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 2밀리리터의 신경 기저 배지에서 배양 후 15분 동안 넣은 다음 다시 인큐베이터에 3-4일 동안 넣습니다.
배양 후 매일 이주 활동을 모니터링하고, 방사형으로 균일한 세포 구름을 생성한 임플란트와 함께 관심 있는 커버 슬립을 선택합니다. 선택한 덮개를 신선한 배양 플레이트에 넣고 밤새 배양합니다. 이미징하기 전에 조직 배양 후드에 있는 멸균 주걱을 사용하여 커버 슬립을 움직여 커버 슬립 아래에서 미세 기포를 제거합니다.
건조를 방지하기 위해 우물 사이의 공간을 물로 채우고 플레이트를 조심스럽게 현미경으로 옮깁니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미징 체계를 정의합니다. z 비행기 시리즈를 수집하여 문화의 3D 특성을 고려해야 합니다.
매개변수가 설정되면 타임랩스를 시작합니다. 이미징 대표자, 신경절의 타임 랩스 기록, 이동하는 세포를 생성하는 저명한 explan이 여기에 표시됩니다. 세포는 조직 밖으로 방사상으로 이동합니다.
단백질 공급원에 대한 그들의 매력은 공급원의 특성에 따라 다양합니다. 이 고출력 동영상에서는 움직이는 개별 세포를 쉽게 추적할 수 있습니다. 화살촉에서 알 수 있듯이 많은 세포가 분기되는 것을 볼 수 있습니다.
이 중 일부는 화살표로 표시됩니다. 개별 세포를 추적하면 추가로 분석할 수 있는 위치 정보를 얻을 수 있습니다. 예시 플롯은 분획 A와 D 사이의 차등 반응을 보여주며, 이는 일단 마스터되면 explan을 떠나는 세포의 뚜렷한 궤적에 의해 입증됩니다.
이 기술은 제대로 수행되면 4 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 매트 젤을 얼음 위에 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 개별 세포의 움직임을 관찰하고 분석하기 위해 서방형 단백질 소스를 준비하고, 3차원 조직 배양을 설정하고, 타임 랩스 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 3D 조직 배양의 타임 랩스 이미지를 활용하여 뇌 피질의 단백질 추출물에 반응하는 신경절 융기의 개별 세포 이동 행동을 조사합니다.
Understanding cell migration mechanisms is critical for de-risking neurodevelopmental target validation and improving predictive confidence in early discovery. This method enables quantitative analysis of chemotactic responses to protein fractions, supporting mechanistic interrogation of inhibitory interneuron pathways. The approach provides translational value by modeling human-relevant migratory processes in a controlled in vitro system.
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation through phenotypic screening of migratory responses to protein-derived signals.