세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석

세포 죽음의 평가에 대한 정확한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 세포 라인과 동물 모델의 광범위한 범위에서 기본 세포 40 % 허위 - 긍정적인 이벤트까지 표시 기존 Annexin V / propidium 요오드화물 (PI) 프로토콜에 따라이 향상됩니다.

이 실험의 전반적인 목표는 세포사멸 및/또는 괴사에 의한 세포 사멸 평가를 위한 기존 Annexin 5 및 Propidium iodide 염색 기술의 현재 문제를 극복하는 것입니다. 우리는 광범위한 세포주와 일차 세포에 대한 기존의 염색 접근 방식이 최대 40%의 위양성 사건을 초래한다는 것을 발견했습니다. 이러한 위양성 현상은 세포질 RNA의 염색으로 인한 것입니다.

반대로, 당사의 프로토콜은 특정 단계에서 고정 및 RNA 분해 단계를 도입하여 위양성 발생률을 획기적으로 줄입니다.염색 절차에서 첫 번째 세포는 기존 절차에 따라 세포 사멸을 감지하기 위해 5분의 X와 요오드화 페리듐으로 염색됩니다. 다음으로, 세포는 1% 포름알데히드로 고정되어 원형질막의 투과성을 증가시킵니다. 마지막으로, 고정된 세포는 세포질 RNA를 분해하기 위해 RNA A로 처리되어 프로피듐 요오드화물 염색을 유발하는 위양성을 제거합니다.

많은 세포 생물학자와 마찬가지로 당사는 세포사멸 및 괴사성 세포 사멸을 감지하기 위해 기존의 nexin five 및 propidium iodide 유세포 분석 방법을 사용했습니다. 불행히도, 우리는 최근에 이 방법이 다양한 세포주와 일차 세포에서 최대 40%까지 상당한 수의 위양성 사건으로 이어진다는 것을 발견했습니다. 이 업데이트된 방법은 다음과 같은 주의 사항을 극복합니다.

당사의 접근 방식은 절차 전반에 걸쳐 특정 단계에서 세포 고정 및 RNA 분해를 활용하여 cyop Plasmic RNA, 이러한 위양성 이벤트를 직접 유발하는 염색을 선택적으로 제거하고 실험을 위해 분석할 세포를 수확합니다. 이 비디오에서는 원시 대식세포를 사용합니다. 예를 들어, 섭씨 4도에서 10분 동안 335Gs로 샘플을 원심분리하고, 상층액을 디캔팅한 다음 1 XPBS의 2밀리리터에 세포를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 동일한 조건에서 세포를 다시 씻으십시오. 이번에는 1 밀리리터의 X NX 1 버퍼와 5 개의 결합 버퍼에 세포를 현탁시킵니다. 샘플을 원심분리하고 상등액을 다시 디캔팅한 후, 1 X NX Xin 5 결합 완충액의 최종 부피 100마이크로리터에 세포를 재현탁합니다.

제조업체의 권장 사항에 따라 각 세포 샘플에 Xin 5를 추가합니다. 예를 들어, 이 비디오에서는 2.5마이크로리터의 Xin five zi가 각 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 추가됩니다. 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 튜브를 배양합니다.

그런 다음 각 반응 튜브에 5개의 결합 완충액에 1개의 X NX 100마이크로리터를 추가합니다. 이제 각 튜브에 약 200마이크로리터의 용액이 있어야 합니다. 다음으로, 1 X NX.In 5 결합 완충액에 1-10 희석된 프로피듐, 요오드화물 또는 PI를 준비하고, 각 튜브에 4마이크로리터의 희석된 PI를 첨가하여 각 샘플에서 밀리리터 파이당 2마이크로그램의 최종 농도를 산출합니다.

실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 튜브를 다시 배양합니다. 이 배양 기간이 끝나면 500 마이크로 리터의 1 x 및 x 및 5 개의 결합 완충액으로 세포를 세척하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 335 Gs로 샘플을 원심 분리 한 다음 snat을 디캔팅합니다. 또 다른 500마이크로리터의 X NX 1개와 500마이크로리터의 2% 포름알데히드로 5개의 결합 완충액에 세포를 현탁시킵니다.

1% 포름알데히드 용액을 만들려면 부드럽게 튕겨 튜브를 섞습니다. 고정 후 10분 동안 얼음 위에 샘플을 고정합니다. 각 샘플에 XPBS 1ml를 첨가하고 세척 중 섭씨 4도에서 8분 동안 3회 원심분리를 하여 부드럽게 혼합합니다.

1 XPBS에 RNA A를 1-100 희석하여 준비하고, 튜브를 튕겨 펠릿을 재현탁하고, 희석 된 RNAs 16 마이크로 리터를 첨가하고, 최종 농도를 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 용액으로 첨가한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 XPBS로 세포를 세척하고 425 GS에서 튜브를 섭씨 4도에서 8분 동안 튕겨서 부드럽게 혼합한 다음 원심분리합니다.

이제 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 대안적으로, N-X-M-P-I 염색이 다른 절차와 병행하여 수행되는 경우 샘플을 후속 염색 단계에 사용할 수 있습니다. 대표적인 이미지 스트림 유세포분석기 이미지는 세 가지 고유한 세포 집단에서 위양성 염색 정도를 보여줍니다.

일반적으로 사용되는 세포주 원시 대식세포 1개와 골수 대식세포와 금붕어 1차 신장 대식세포를 미러링하는 2개의 1차 세포주. 금붕어 1차 대식세포의 사용은 다양한 세포 플랫폼에서 이 기술의 적용 가능성을 강조합니다. 참 긍정 이벤트는 PI와 DRAC 사이의 핵 구획 내에서 예상되는 공동 국소화를 표시합니다.

Five, 노란색 염색으로 입증된 바와 같이 살아있는 세포와 죽은 세포의 핵 구획을 정확하게 염색하는 멤브레인 투과성이 높은 염료입니다. 여기서, PI 핵 염색의 정확도는 D dr five BRDU 7 A.A D DPI와의 유사성 정도를 기준으로 평가되었으며, DRAC five는 원시 2 64 0.7 대식 세포 세포주에서 핵을 정확하게 염색하는 능력에서 99% 이상의 유사성을 나타냈습니다. 대조적으로, 기존 프로토콜을 사용할 때 발생하는 세포질 PI 염색은 d dr five에 비해 핵 염색의 유사성 비율을 현저히 감소시켰습니다.

이 그림에서는 밀리리터당 50마이크로그램 RNA A의 통합이 비핵 PI 염색을 제거하고 murn, 골수 대식세포 및 금붕어 일차 신장 대식세포 세포에서 d dr five 염색에 비해 유사성을 크게 증가시킨다는 것을 알 수 있습니다. 이 그림에서 일차 신장 대식세포의 대표적인 이미지는 RN a의 처리로 세포질 구획에서 RNA 염색이 소실된 것을 보여줍니다. 1차 금붕어 신장 대식세포의 이러한 산점도는 변형된 넥신 PI 프로토콜로 제조된 세포에서 거짓 세포자멸사 괴사 사건의 현저한 감소를 보여줍니다.

새로운 프로토콜은 세포의 84.9%가 생존 가능하다는 것을 보여줍니다. 게이트는 형광 및 형태학적 특징을 평가하는 병렬 이미지 스트림 샘플을 기반으로 그려졌습니다. 한 가지 예로, 초기 전구 세포인 단핵구 및 성숙한 대식세포는 이 비디오에 설명된 5개의 PI 프로토콜에서 변형된 NX에 의해 염색되었거나, 변형된 프로토콜에 의해 염색된 이 그림에 대한 기존 방법에 의해 염색된 세포는 RNA 처리에 의한 거짓 양성 사건의 제거로 인해 양성 PI 사건의 수가 시각적으로 감소했습니다.

또한, 이러한 효과는 작은 초기 전구 세포보다 큰 성숙한 대식세포 세포에서 더 두드러졌습니다. 기존 프로토콜에 기초한 결론은 더 성숙한 대식세포 하위 집합에 대한 세포 사멸에서 긍정적인 상관 관계를 잘못 제안했을 것입니다.이 염색 절차에 따라 세포 내 또는 표면 염색과 같은 추가 단계를 수행하여 세포 분리 내 하위 집단에 대한 특정 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술의 관련성은 면역 기반 질문을 넘어 세포주기 정지로 처리된 유전독성 스트레스 세포, 티미딘 또는 하이드록시우레아와 같은 약물을 사용하는 실험 시스템, 발달 진행이 세포 RNA 합성의 불연속적인 변화를 특징으로 하는 배아 세포에 대한 연구와도 관련이 있습니다.