Name: 엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (EHT)에 대한 Bioluminescence 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 생체 발광 이미징을 이용하여 쥐의 엔지니어링된 심장 조직(EHT) 이식 후 면역 반응을 비침습적으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 이식편 생존 및 거부 반응을 장기간 추적하여 심혈관 연구와 면역학 연구에 활용됩니다.

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소냐 Schrepfer, 레나드 콘라디 및 아르네 한센 독일 Forschungsgemeinschaft (; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1 DFG)로부터 자금을 받았습니다. 작품은 또한 유럽 연합 (EU)에서 토마스 Eschenhagen (EUGeneHeart 및 Angioscaff)에 보조금 지원했다.

1. EHT 생성 및 문화 약관 섬유소 기반 EHT의 제조는 다른 네 설명된대로 수행되었다. 간단히, 주입 목적으로 섬유소 기반 EHT를 생성하는, 마스터 믹스는 신생아 로사 / 루시페라제 - 루 형질 전환 쥐의 마음 소 피브리노겐 및 Matrigel에서 분리된 세포를 포함하는 준비되었다. 아가로 오스 캐스팅 금형은 6 잘 문화 요리에 위치 테플론 스페이서를 사용하여 준비되었습니다. 아가로 오스의 응고 후, 스페이서가 제거되었으며 실리콘 포스트 랙에은 금형에 도달 게시물 문화 요리에 배치했다. EHT를 생성하려면, mastermix는 간략하게 트롬빈의 계산된 금액과 혼합하여 몰드에 pipetted되었습니다. 섬유소의 polymerisation 후 게시물을 준수 EHTs와 실리콘 랙에은 부드럽게 주문 제작을 사용하여 새 6 - 웰 세포 배양 접시에 전송하고 37 ° C, 7% CO 2 세포 문화 인큐베이터 유지 아가로 오스 주조 금형에서 제거되었습니다 세포 배양 매체. EHT는 일 열까​​지 세포 배양 조건 하에서 유지되었습니다. 이 기간 동안 신생아 쥐의 심장 세포는 길쭉한, 인터커넥트 시작 실리콘 게시물 사이에 강제로 라인을 따라 정렬합니다. 이식 당시, 자발적인 일관된 수축은 실리콘 게시물을 왜곡하고,​​ 관찰되었다. 2. EHT 주입 EHT 주입은 allogeneic 면역 반응을 조사하기 위해 면역 적격 브라운 노르웨이 (BN) 쥐, 또는 immunodeficient 누드 쥐 중 하나에서 수행되었다. 100 무게 BN와 누드 쥐 - 150g 찰스 강 독일 (Sandhofer 웨그 7 D - 97633 Sulzfeld)에서 구입하여 기존의 조건, 공급 표준 쥐 차우와 물 광고 libidum 아래에서 지내게되었습니다. Immunodeficient 쥐는 무균 침구, 버팀대 및 소독 물 사용에 보관되어 있습니다. 독일 윤리 심사위원회는 검토와 동물 절차를 승인했다. 모든 수술기구는 사용하기 전에 소독을하고 있습니다. 주입 절차는 다음과 같이 수행됩니다 : 랫은 유도 챔버를 사용하여 (2.5-3 %) isoflurane과 anesthesized 있습니다. isoflurane으로 인간의 노출은 downdraft 테이블이나 이외의 순환 모자에서 작업으로 줄일 수있다. 체온은 수술하는 동안 유지됩니다. <ol><li> 복부 영역을 면도하고 마취 동안 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 의 뒷면에있는 쥐를 삽입하고 마취를 유지하기 위해 코와 입을 통해 안면을 넣으십시오. </li><li> Betadine 그리고 80 % 에탄올을 사용하여 복부 지역을 소독. 면도 지역의 중심에서 깨끗한에서 더러운로 면봉은 머리 지역 향해 바깥쪽으로 이동. </li><li> 쥐가 충분히 anesthetized되었는지 확인하는 뒷다리 곤란하게 반사를 확인합니다. </li><li> 동물을 드레이프와 복부를 열려면 두 단계의 피부와 근육을 분리 정중선 복부 절개를 수행합니다. 핫 비드 살균은 피부와 근육 사이에 개방하는 데 사용됩니다. </li><li> 예열 생리 moisturized 분말 무료로 글러브에 장내를 놓습니다. 수분의 손실을 방지하기 위해 내장 주변의 장갑을 접으십시오. </li><li> 지방 조직을 제거하고 비장을 폭로. </li><li> 포셉로 큰 omentum을 시각화 및 확산. </li><li> 조심스럽게 큰 omentum에 실리콘 게시물 및 전송을 중단에서 EHT 잘라. </li><li> EHT 주변의 큰 omentus를 싸서 (Ethicon, Norderstedt, 독일) 2 싱글 7-0 prolene의 봉합을 사용하여 수정 </li><li> 다음 복부에 다시​​ 장내를 이동합니다. </li><li> prewarmed 무균 식염수에 복부를 플러쉬. </li><li> 6-0 prolene 실행 봉합 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용하여 복벽의 근육 레이어를 닫습니다. </li><li> 피부를 닫습니다 봉합을 실행 5-0 prolene을 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용합니다. </li><li> 쥐가 마취 여전히 있지만, subcutaneously 5 MG / kg Carprofen를 삽입. </li><li> 절차의이 유형, 진통제 (예 : Metamizol 등) 3 일간 게시 이식을위한 진통제에 대한 식수 (100 ML 당 50 MG Metamizol)에 추가됩니다 충분한 진통제를 제공합니다. </li></ol> 3. EHT 다음 이식의 Bioluminescence 이미징 IVIS의 bioimaging 플랫폼 (Xenogen 알라 메다, CA, 미국) 생체내에서 비침습 bioluminescence 이미징에 사용되며 결과는 IVIS 생활 이미지 (Xenogen) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하고 있습니다. 이미징은 매일 이시간 postoperatively 시작 수행됩니다. 유도 챔버를 사용하여 - (3 % 2.5) isoflurane 함께 쥐를 마취. <ol><li> 널리 프로보 - 요오드, 다음 사용하는 80 % 에탄올을이 단계를 세 번 반복을 사용하여 복부 및 흉부 영역을 소독. </li><li> IP, D - Luciferin (375 MG / kg 체중 Xenogen)을 주사 </li><li> IVIS 이미징 챔버 (최대 4 쥐가 동시에 분석할 수)에 anaesthetized 쥐를 놓습니다. </li><li> 리터의 신호 강도를 평가UC + 광자 / 초 / cm 2 / steridianin 기준에의 관심 영역 (ROI) (이식 후 120분)의 단위와 일 1, 2, 3, 5, 7, 10, 그리고 주 2 EHT 내부 세포, 3 4. 정상 신호 (D - Luciferin 분사 이후 20 분 정도가 나타납니다) 참고. </li></ol> 시간이 지남에 따라 신호 강도를 보여주는 그래프를 (엑셀)를 만듭니다. 4. BLI 결과의 상관 관계와 ELISPOT 면역 적격 BN 및 immunodeficient 누드 쥐의 세포로 생체내 면역 - 응답 EHT 이식 후 공부했다. 받는 동물의 비장이 EHT 이식받는 splenocytes를 분리 5 일 후에 수확했다. 응답 세포가 IFN - γ와 IL - 4 코팅을 사용하여 제조 업체의 프로토콜 (BD Biosciences)에 따라 수행 것처럼 Elispot의 assays 사용 자극기 5 X10 6받는 splenocytes로 EHTs을 (시그마 알드리치, 세인트 루이스, MO, 미국) mitomycin을 저해 조사 접시 TH1을하고, TH2 반응, 각각. IFN - γ 및 IL - 4 명소 immunodeficient 모델에 비해 면역 적격, 모델 상당히 높은되었습니다 (IFN - γ : P = 0.001, IL - 4 : P = 0.023; 학생의 T - 테스트). 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. BLI 결과와 ELISPOT의 상관 관계) 면역 적격 브라운 노르웨이와 immunodeficient 누드 쥐의 생체내 면역 반응의 세포는 이식 후 EHT 공부했다. 받는 사람 splenocytes은 오일 EHT 주입 후에 수확했다. IFN? 및 IL - 4 표현식은 응답 세포로 stimulators 및 5x106받는 splenocytes으로 mitomycin - 저해 EHT를 사용하여 ELISpot의 assays에 의해 평가되었다. Th1과 Th2 반응은 각각 IFNγ와 IL - 4 생산에 의해 입증으로 immunodeficient 모델에 비해 면역 적격 모델에서 상당히 높은되었습니다. B) 룩 + EHTs는 면역 적격 BN의 쥐 또는 immunodeficient 누드 쥐 하나의 큰 omentus로 이식되었다. 세포 생존은 길이 방향 BLI 다음되었다. 이식 EHTs을 거부 동물의 요금이 제공됩니다. 세포가 T 세포 결함 쥐에서 살아남은 반면 모든 BN의 쥐가 빠르게, EHT 이식을 거부했다.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

심장 수리를 위해 EHT 기술의 임상 구현하기 전에, 이러한 이식 후 세포와 매트릭스 구성 요소 또는 이식 생존 모두 immunogenicity 같은 근본적인 질문은 실험 모델로 평가해야합니다. 인 - 생체내 bioluminescence 이미징은 이식 후 모니터링 세포 생존에 유용한 새로운 기술을 나타냅니다 . 우리는 성공적으로 들어있는 섬유소 기반 EHT를 생성 긍정 루시페라제 (루크 +) 설립 프로토콜 4 적응에 의해 심장 세포. 이러한 EHT는받는 사람 쥐의 큰 omentum에 심어했다. 특정 기판 (D - Luciferin)의 Intraperitoneal 분사는 IVIS의 bioimaging 플랫폼 (Xenogen)를 사용하여 감지되었습니다 신호를 생성합니다. 기준에서 신호 강도 (이식 후 120분가) / 초 / cm 2 / steridian는 이식할 EHTs 내부 세포의 숫자에 대한 대리 변수 역할을 광자 단위로 측정. 매일 측정 이식편 생존의 비침습 세로 ass...

<ul><li> 루 - TG (GT (로사) 26Sor - 륙) 11Jmsk 쥐 (NBPR 랫 번호 0299​​, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> 보빈 피브리노겐 (재고 솔루션 : NaCl 200 MG / ML 플러스 aprotinin 5 μg / ML의 섬유소 0.9 %, 시그마 F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> 호스 혈청 (Gibco 26050) </li><li> 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Gibco 15140) </li><li> 인슐린 (시그마 - 알드리치 I9278) </li><li> Aprotinin (시그마 알드리치 A1153) </li><li> D - Luciferin (Biosynth L - 8220) </li><li> 효소 링크된 면역 명소 (ELISpot) 분석 플레이트 (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (eht)에 대한 bioluminescence 이미징

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

심장 조직 공학의 다양한 기법을 기본 또는 bioartificial 중 발판 재료, 같은 섬유소 또는 콜라겐 등 hydrogels에 심장 myocytes의 함정 수사와 myocyte monolayers 1 스택을 사용하여 비계 전략을 포함하여 지난 수십 년간 추진하고 있습니다. 이러한 개념은 손상된 심장 기능 (예 : 심근 경색 후)의 복원 또는 실험 모델 (예 : 예측 독성학 및 약물 검사 또는 질병 모델링)로 목표로하고 있습니다. 설계 심장 조직 (EHT)의 주입 후 세포 생존의 정확한 모니터링 이제 bioluminescence 이미징 (BLI) 기법 2 - 생체내에서 사용 가능한되었다. 여기 반딧불 루시페라제 (; 3 로사 / 루시페라제 - 루 TG)의 유비 쿼터스 표현과 유전자 변형 쥐 긴장에서 섬유소 기반 EHT의 생성에 대해 설명합니다. 주입은 주입 EHT 다음받는 유기체의 면역 반응을 평가하기 다른 쥐 종자의 큰 omentum으로 수행됩니다. BLI와 효소 링크된 단백질 스팟 기법 (ELISPOT) 면역 반응의 평가 BLI의 가용성을 확인에 의해 생성된 결과의 비교.

이 비디오의 사용을 보여줍니다<em&gt; 생체내에</em쥐에서 엔지니어링된 심장 조직 이식 (EHT) 이후 면역 반응을 연구하기&gt; bioluminescence 이미징.

엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (EHT)에 대한 Bioluminescence 이미징

지난 수십 년 동안 천연 또는 ...을 이용한 스캐폴딩 전략을 포함하여 심장 조직 공학의 다양한 기술들이 연구되어 왔습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 내 생물발광 이미징을 사용하여 쥐에서 공학적 심장 조직(engineered heart tissue, EHT) 이식 후의 면역 반응을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 루시페레이스 양성 EHT를 제작합니다. 그다음, 루시페레이스를 안정적으로 발현하는 EHT를 수용 쥐의 대망에 이식합니다.그 후, 수혜 동물에 대해 생체 내 생물 발광 이미징을 수행하여 비침습적이고 종단적인 EHT 생존 및 거부 반응을 모니터링할 수 있습니다. 이 모델을 사용하면, 예를 들어 급성 거부 반응의 강도와 역학을 시간이 경과함에 따라 관찰되는 생물 발광 신호 강도의 감소와 상관관계 지어 분석할 수 있습니다. 조직학적 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 매일 측정이 가능하여 이식편 생존에 대한 비침습적 종단 평가를 수행할 수 있다는 점입니다.이 방법은 공학적 심장 조직의 생존 및 거부 반응에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 연구 질문에도 적용 가능합니다. 예를 들어, ehs의 대사 연구 등이 있습니다. 본 기술은 이 과정을 매일 수행하고 있는 Christiana Parman이 시연할 예정입니다.본 연구실에서는 이식 목적으로 피브린 기반의 DHT를 생성하기 위해 먼저 Luciferase Lu 신생 쥐로부터 형질전환 심장 세포를 분리합니다. 신생 luciferase, lu 형질전환 쥐 심장에서 분리한 세포, bovine fibrinogen 및 matrigel을 X-D-M-E-M 및 NKM에 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 6-웰 배양 접시의 각 웰에 2% aros/PBS 9ml를 추가하고 테플론 스페이서를 웰에 배치하여 aros 캐스팅 몰드를 준비합니다. aros가 응고되면 스페이서를 제거하고, 포스트가 몰드 내부로 들어갈 수 있도록 실리콘 포스트 랙을 배양 접시 위에 배치합니다.EHT를 생성하기 위해 마스터 믹스를 부드럽게 혼합한 다음, 계산된 양의 thrombin을 마스터 믹스에 첨가하고 짧게 혼합합니다. 그런 다음 마스터 믹스 1100 µL를 각 몰드에 빠르게 피펫팅합니다. fibrinogen이 중합되면, EHT가 부착된 포스트가 있는 랙을 agros 캐스팅 몰드에서 조심스럽게 제거하고, 웰당 8 mL의 맞춤형 배지가 들어 있는 새로운 6-웰 세포 배양 디쉬로 랙을 옮깁니다.EHT는 37 °C, 7% carbon dioxide 세포 배양 인큐베이터에서 10일 동안 유지됩니다. 배지는 일주일에 세 번 교체합니다. 이 배양 기간 동안 신생 쥐 심장 세포는 신장되고 서로 연결되며, 실리콘 포스트 사이의 힘의 선을 따라 정렬되기 시작합니다.이식 시점에 자발적인 일관성 수축이 관찰될 것입니다. 수술 도구는 사용 전 오토클레이브로 멸균하고 멸균 식염수 30 milliliters를 데워 준비하십시오. 이식용 쥐는 체중이 100에서 150 grams 사이여야 하며, 표준 쥐 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 일반적인 조건에서 사육되어야 합니다.본 영상에서는 마취 후의 brown Norway rat을 사용합니다. 수술 전 쥐를 진정시키고, 마취 상태에서 발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인하여 진정 여부를 판단합니다. 체중 kg당 5 mg의 케라민을 복부에 피하 주사하고, 복부 영역을 제모한 뒤 동물의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 마취 중에 Betadine을 사용하여 복부 영역을 소독한 다음, 80% ethanol로 깨끗한 부위에서 오염된 부위 방향으로 닦아냅니다. 이 소독 과정을 반복합니다.세 번 탭한 후, 동물을 드레이프로 덮고 복부 정중선 절개를 실시하며, 피부와 근육을 두 단계에 걸쳐 분리하여 복부를 엽니다. 절개 사이마다 도구를 핫비드(hot bead)로 멸균하십시오. 파우더 프리 장갑을 식염수로 적십니다.장물을 장갑 안에 넣습니다. 수분 손실을 방지하기 위해 장갑을 장물 주변으로 접어줍니다. 절개 부위를 벌려 비장을 노출시킵니다.포셉을 사용하여 대망을 확인하고 넓게 펼칩니다. 현수 실리콘 포스트에서 EHT를 조심스럽게 절단하여 대망 위로 옮깁니다. 대망으로 EHT를 감싼 후, 두 개의 7-0 Prolene 봉합사를 사용하여 단일 매듭으로 고정합니다.다음으로, 장을 다시 복강 내로 이동시킵니다. 미리 데워둔 멸균 식염수 1 mL로 복강을 세척합니다. 6-0 proline 연속 봉합사를 사용하여 복벽의 근육층을 폐쇄합니다.이러한 유형의 시술에서 충분한 진통 효과를 제공하기 위해 5-0 Prolene 연속 봉합사를 사용하여 피부를 폐쇄합니다. 이식 후 3일 동안 음용수에 100 mL당 50 mg의 ole을 첨가합니다. IVIS Bioimaging 플랫폼을 사용하여 생체 내 비침습적 생물 발광 이미징을 수행하며, 결과는 IVIS Living Image 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.영상 촬영은 수술 후 2시간부터 매일 수행합니다. EHT 생물발광을 시각화하기 전, 쥐를 마취시키고 발가락 반사를 통해 진정 상태를 확인합니다. 복부 영역을 핀치 소독합니다.Lucifer를 초기 체중 kg당 375 mg의 용량으로 투여한 후, 마취된 쥐를 ivu 이미징 챔버에 넣습니다. 최대 4마리의 쥐를 동시에 분석할 수 있습니다. IVUS living image 소프트웨어를 사용하여 Lucifer 투여 후 약 20분이 지나면 나타나는 피크 신호를 관찰하고 기록합니다.그런 다음, 이식 후 120분 및 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일, 그리고 2주, 3주, 4주 차에 관심 영역 내 EHT 내부의 루시퍼라제 양성 세포의 기선 신호 강도를 photons per second per centimeter squared per Ceridian 단위로 설정합니다. 데이터는 시간에 따른 신호 강도를 나타내는 그래프 형태로 표현할 수 있습니다. 면역 능력이 있는 Brown, Norway 랫드와 면역 결핍 랫드의 세포 내 생체 내 면역 반응을 확인합니다.EHT 이식 후 누드 랫을 대상으로 연구를 진행하였으며, EHT 이식 5일 후에 수혜자 SP 세포를 수집하였습니다. 마이토마이신으로 억제된 EHT를 자극 세포로, 수혜자 세포 5 × 10⁶개를 반응 세포로 사용하여 ELISA 분석을 통해 인터페론 감마 및 IL-4 발현을 평가하였습니다. 인터페론 감마 및 IL-4 생성 결과, 면역결핍 모델에 비해 면역능력이 있는 모델에서 Th1 및 Th2 반응이 유의하게 더 높게 나타났습니다.LUCIFERASE 양성 EHS를 면역 능력의 PN 쥐 또는 면역 결핍 누드 쥐의 대망에 이식하였습니다. BLI를 통해 세포 생존 여부를 종단적으로 추적 관찰하였습니다. 이식된 EHS를 거부한 동물의 비율을 제시하였습니다.모든 BN 쥐는 EHT 이식물을 빠르게 거부한 반면, T-세포 결핍 쥐에서는 세포가 생존하였습니다. 수술 기법을 완전히 익히면 적절하게 수행했을 때 수술을 수분 내에 완료할 수 있습니다. 세포 침윤 및 체액성 면역 반응과 관련된 다른 의문점을 해결하기 위해 면역 분석 및 조직학적 검사와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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연구

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Bioengineering

생명공학

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엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (EHT)에 대한 Bioluminescence 이미징

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