Name: 타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관 이식물을 제조하는 방법입니다. 생분해성 PGA 메쉬에 평활근 세포를 배양하여 기능성 혈관 구조를 형성하고 면역화학적, 생화학적, 기계적 특성을 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 (LEN 양쪽) 국민 건강 그랜트 R01 EB - 008836의 연구소와 R01 HL083895으로 후원됩니다. 우리는 우리의 연구 bioreactors을 만들기위한 다릴 스미스 대학의 유리를 불어 만드는 직공을 감사 드리고 수 있습니다.

압력솥 흐름 시스템 및 그림 1과 그림 2에 지시 생물 반응기 구성 요소 (생물 반응기 자체와 실리콘 마개 덮개)의 튜브를 조립하고 압력솥. 튜브를 수유하면 한쪽에있는 커넥터와 반대쪽에 열린 최종 수 있습니다. 세 짧은 튜브 세그먼트는 가스 교환을위한 실리콘 마개를 통해 삽입됩니다. 1. 재봉 PGA 메쉬 <ol><li> 컷 PGA 메쉬 1.1cm로 X ~ 8cm 시트 (생물 반응기의 크기에 따라 다름). </li><li> 증류수 (dH20)와 사용하기 전에 건조 공기와 깨끗한 실리콘 튜브 (3mm 내경). </li><li> 하나의 바늘로 추종하는자가 세 수술 노트로 시작하는 깨끗한 실리콘 튜브 주위 PGA 메쉬를 바느질 Dexon 6.0 치료를 사용합니다. </li></ol> 2. PGA는 표면 처리를 공사장 공중 발판 <ol><li> 1 - 2min과 치료 시간을 기록하고 모든 PGA 공사장 공중 발판에 대해 같은 시간을 사용 1M NaOH의 수영 PGA 공사장 공중 발판. </li><li> 이분 3 회 대한 dH2O 욕조에서 PGA 공사장 공중 발판을 씻어. </li><li> 팻 PGA는 DH 2 O 욕조의 각 수영 사이 Kimwipes와 건조 공사장 공중 발판. </li><li> 조직 문화 후드 아래에 드라이 PGA는 공사장 공중 발판 송풍기와 함께 15 분 동안 건조 공기. </li></ol> 3. 재봉 Dacron의 무기 <ol><li> 2~3밀리미터의 오버랩으로 PGA 메쉬의 각 엔드에 Dacron 손목에 수갑을 (1cm)의 작은 조각을 바느질 Prolene 4.0 치료를 사용합니다. 참고 :주의하지 찔린 실리콘 튜브 (그림 3). </li><li> Dacron과 손목에 수갑의 무료 결국 주변에 3 개의 실밥을 바느질로 동일한 치료를 사용합니다. 5.1 단계 (그림 3) Prolene 봉합사의 자유로운 끝에 충분한 봉합을 떠날 있는지 확인하십시오. </li></ol> 4. 생물 반응기의 어셈블리 (생물 반응기 문화의 시작 전날) <ol><li> 20-30분의 70 % 에탄올 욕조에 수놓은 메쉬와 실리콘 튜브, 수술 도구, 그리고 얇은 철사를 만끽해보세요. </li><li> 사전 조립 최소한 30 분간 70 % 에탄올 욕조에서 생물 반응기 및 잠수함을 포함하고있는 압력솥 파우치를 엽니다. 에탄올과 함께 철저하게 생물 반응기를 플​​러시해야합니다. 70 % 에탄올에 대한 모든 생물 반응기 구성 요소의 노출은 또한 살균 단계입니다. 이 단계는 또한 autoclaving에 의해 제거하고 혈관 세포에 해로운이 아닌 내독소를 제거합니다. </li><li> 그것을 이겨 내길 얇은 와이어를 사용하여 측면 무기를 통해 실리콘 튜브를 당겨. </li><li> (에탄올에 빠져들 메쉬를 유지) 에탄올 욕조 밖으로 생물 반응기를 가져가라. 긴축과 Prolene의 봉합 (그림 3)을 아래로 묶은하여 flared 유리 입술을 통해 Dacron과 손목에 수갑을 체결하여 생물 반응기 내부의 PGA 발판을 수정. </li><li> 실리콘 튜브를 통해 커넥터 생물 반응기 사이드 팔 한쪽을 연결합니다. </li><li> 충분한 긴장과 실리콘 튜브의 다른 측면을 끌어 오기 및 실리콘 튜브에 남아있는 두 커넥터를 삽입합니다. 커넥터를 삽입하면 단단히 실리콘 튜브에 잡아! </li><li> 꽂아의 에탄올 욕조에 생물 반응기와 부드럽게 측면 무기의 커넥터를 철수하여 에탄올을 잔뜩. </li><li> 생물 반응기 뒤집어하고 10 분 동안 흠뻑 젖어 수 있습니다. </li><li> 뒤집기 생물 반응기는 오른쪽 위, 추가 10 분 만끽해보세요. </li><li> 모든 에탄올 드레인. </li><li> 초과 에탄올은 튜브의 끝부분에서 병뚜껑 틈에다 떨어뜨린 저장할 센터 접시에 시리즈 및 장소 생물 반응기에서 3 대 배양 접시 (10 ㎝)을 설정합니다. </li><li> 5ml 또는 10ml의 피펫을 사용하여 조직 문화 물로 생물 반응기와 PGA 메쉬를 플러시. 실리콘 튜브로 또한 플러시 조직 문화 물. </li><li> 철저하게 생물 반응기의 양쪽에 배양 접시에 모든 여분의 물을 배수. </li><li> 에 송풍기 및 자외선 OFF로 후드에서 하룻밤 건조 생물 반응기. </li><li> 추가 참고 : 살균 저어 표시줄이 생물 반응기에 있는지 확인하십시오. ,이 시점에서 생물 반응기를 통해 "가져가"로 오염을 방지하지 않도록하십시오. 많은 parafilm 스트립의를 잘라 작은 70 % 에탄올 목욕 (대형 페트리 접시가 잘 작동)에서 그들을 만끽해보세요. </li></ol> 5. 1 일 : 생물 반응기 설정 <ol><li> 오염 물질의 PGA 비계 내부를 보호하기 위해 각 생물 반응기의 개방을 통해 멸균 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 그림 4와 parafilm 모든 연결 관절에 표시된로 생물 반응기에 흐름 시스템을 조립. <ol><li> 알코올 잎사귀와 첫번째 커넥터를 닦아주십시오. </li><li> 생물 반응기의 세 번째 미사용 팔에 주사 포트를 연결합니다. </li><li> 해마의 튜브를 제거하고 가능한 Y - 접합에 가까운 호수로 설정 희석의 푸른 끝을 묶을. 튜브의이 부분에 어떤 액체 전달을 보장하지 곳에서 튜브 클램프를 당겨 </li><li> IV 가방 제거 및 IV 가방의 먼 끝에 바다 코끼리 튜브 (적색)을 연결합니다. 첫번째 알코올로 닦아 삽입 포트를 닦아 있는지 확인하십시오. </li><li> (화이트 엔드 튜브를 통해) 플로우 시스템의 한쪽으로 해마를 연결합니다. </li><li> 플로우 시스템에 3 방향 꼭지를 삽입합니다. </li><li> 압력 변환기를 제거 및 세 방향 꼭지에 연결합니다. </li><li> 가방에 중간 개방에 압력 변환기의 다른 쪽 끝을 연결합니다. </li></ol></li><li> 연결Y - 접합을 통해 흐름을 시스템에 생물 반응기. IV 가방에 350ml 1 %의 fungizone (PBS의 495ml와 함께 믹스 5ml의 fungizone)을 추가 60ml 주사기를 사용하십시오. </li><li> PBS의 흐름을 허용하도록 중지 자지를 조정하여 흐르는 시스템을 플러시 IV 가방 머리를 묶어라. 참고 :이 유출되도록하지 생물 반응기 내부 확인합니다. </li><li> 각 PGA scafffold에 매체와 씨앗의 1.25ml 8 X10 6 SMCs를 (약 합류 T75) 다시 일시 중지합니다. 세포 현탁액이 균일하게 PGA 메쉬의 하단쪽으로뿐만 아니라 프로 골프 (PGA) 메쉬 - Dacron 접합에 병뚜껑 틈에다 떨어뜨린되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 알코올로 생물 반응기의 RIM이 옆으로 선회 방지 생물 반응기를 회전을 통해 닦아 닦아주십시오. </li><li> 실리콘 스토퍼 뚜껑 조립 (그림 2) <ol><li> 다시 신중하게 압력솥 가방 껍질, 덮개의 바닥을 노출하지 않도록하고. </li><li> 남성 커넥터에서 수유 관에 주입 포트를 연결합니다. </li><li> 세 공기 포트 각 PTFE 0.20 μm의 필터를 부착합니다. </li><li> 이 과정에서 노출 / 덮개의 아래쪽을 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> Parafilm 사출 포트. </li></ol></li><li> 유리 생물 반응기에 실리콘 마개 덮개를 삽입하고 생물 반응기 내부의 공급 튜브가 씨앗 PGA의 공사장 공중 발판을 만지지 있지 않은지 확인하십시오. 뚜껑 주위 Parafilm. </li><li> 인큐베이터 안에 흐름 시스템 (옆에 있습니다)와 생물 반응기를 삽입하여 생물 반응기에게 25-30분위한 5 분마다 회전. </li><li> 로 설명의 4-10 문화 미디어의 400ml (표 1) 생물 반응기 챔버를 입력합니다. 이 배지는 돼지의 설계 동맥의 "최적화"입니다. </li></ol> 6. 일 6-7 : 펌프 켜기하고, 첫 수유 <ol><li> 6-7일에 대한 실리콘 튜브를 통해 펌핑 어떤 타악기없이 정적 씨앗 공사장 공중 발판을 성장. 이 기간 동안 중간 변경하거나 비타민 C의 보완에 대한 필요가 없습니다. </li><li> 펌프를 켜기 전에 PBS 또는 유동 시스템 튜브의 꼬임에 대한 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 흐름 시스템의 펌프의 전원을 켜고 압력이 약 270/-30mmHg 읽는 있도록 펌프 설정을 조정할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 기록 문화 전반에 걸쳐 매일 압력 및 270/-30mmHg에서 압력을 유지합니다. 압력 변환기는 압력을 읽고 모니터를 컴퓨터에 연결할 수 있습니다. </li></ol> 첫 수유 <ol start="5"><li> 매체 변화와 중소 폐기물 deposal 목적으로 모두 피부를 먹이로 사출 포트 &amp; PTFE 필터를 조립. </li><li> 단단히 펌프에 공급 튜브를 삽입하고 생물 반응기와 먹이 뚜껑에 다른 쪽 끝을의 포트를 공급하는 한쪽 끝을 삽입합니다. 에탄올 잎사귀와 함께 사출 포트를 닦아 있는지 확인하십시오. </li><li> 매체의 200ml를 펌프로 듀얼 방향 Masterflex 펌프를 사용합니다. 다음 생물 반응기에 다시 신선한 매체의 200ml를 펌프에 새로운 먹이 튜브를 사용합니다. 생물 반응기 중간을 다시 펌프 특히 항상 아주 느린 속도로 시작합니다. </li><li> 중간 및 보완의 아스코르비 산의 2x/week을 변경합니다. 아스코르비 산을 추가하려면, 매체 25ml를 가지고 조직 후드에 따로 배치 30ml 주사기를 사용합니다. PBS의 5ml에 아스코르비 산의 25mg을 디졸브 및 필터 0.22 μm의를 통해 필터링합니다. 먼저 이송 관에 멸균 아스코르비 산을 주사 및 이전 버전 제거 25ml 매체를 다시 추가합니다. 중간 제조법은 표 1에 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 흐름 시스템 조립 튜브 및 커넥터가 위에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 실리콘 스토퍼 덮개 어셈블리 위에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 생물 반응기 조립의 설계도가 위에 표시됩니다. 생물 반응기의 Dacron과 손목에 수갑이 푸른 봉합의 옹이와 유리 무기에 고정 아르 인사이드. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 관 그리고 생물 반응기에 연결된 흐름 시스템은 위에 표시됩니다. L/S18 튜브가 Masterflex 펌프에 의해 펌핑하기 때문에 흐름을 운전한다. 압력 변환기는 상류에있는 생물 반응기를 입력하기 전에 압력을 측정합니다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 수확 공학 선박의 이미지. 엔지니어링된 선박 불투명으로 표시하고 타악기 조건 8 주 문화 후 약 250μm의 벽 두께를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 공학 선박의 Haematoxylin과 Eosin 스테인드 상호 섹션. A와 B는 각각 선박 8 주 비 펄스와 펄스 수 있습니다.C와 D는 각각 4 주간 아닌 펄스와 펄스 선박입니다. L은 혈관의 luminal 측면을 나타냅니다. 저울 막대가 100μm이다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 공학 선박의 크로스 섹션에 대한 콜라겐에 대한 메이슨의 Trichrome 얼룩 (청색). A와 B는 각각 8 주 비 펄스와 펄스 선박입니다. C와 D는 각각 4 주간 아닌 펄스와 펄스 선박입니다. 4 주간의 펄스 선박는 아닌 펄스 대응보다 더 많은 콜라겐을 표시합니다. 화이트 화살표는 혈관에 PGA의 조각을 나머지를 가리 킵니다. 저울 막대가 100μm이다. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="그림 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 보빈 설계 동맥의 SMC 마커 Immunochemistry의 얼룩이. 평활근 α - 굴지, calponin - 1, 평활근 마이 오신 중쇄 (SMMHC)는 각각 초기, 중간, 그리고 늦은 SMC 수축성 마커입니다. 12 주 문화의 마지막으로, 선박의 세포 벽 표현 SM α - 굴지 및 Calponin - 1 SMMHC의 중간 정도입니다. 저울 막대가 20μm이다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> DMEM (DME / 낮은 수정) </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> FBS (태아 소 혈청) 열 inactivated </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> HEPES 1.0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> 비타민 C (PBS 또는 DMEM에 용해) </td><td> 25 MG </td></tr><tr><td> 프롤린 / 글리신 / 알라닌 25 mg/25 mg/10 MG (PBS의 5ml에 용해) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 μg (PBS의 in1 ML을 해산) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> 페니실린 만 단위에서 G / ML </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> 10ng/ml에서 PDGF - BB (혈소판 - 유래 성장 인자 - BB) </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10ng/ml에서 bFGF (기본 fibroblast의 성장 인자) </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> 표 1. "40-10"매체의 구성 요소는 위의 테이블에 표시됩니다. PDGF - BB와 bFGF를 제외하고 다른 모든 구성 요소를 사용하기 전에 0.2μm 필터를 통해 필터링하는 것입니다.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
<li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li>
<li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+arteries+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li>
<li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+porcine+arteries%3A+Effects+of+scaffold+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li>
<li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li>
<li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li>
<li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li>
<li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors%2C+Intravital+Imaging%2C+and+Biomechanical+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li>
<li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li>
<li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+Journal%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+engineered+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li>
<li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biostatistical+fact+sheet%3A+cardiovascular+procedures%22">Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures</a>. , American Heart Association. (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

공학 선박의 품질은 조직 문화에서 사용 SMCs의 품질에 의해 결정 큰 부분이다. SMC 표현형의 중요한 측면은 수축성 형태, 낮은 통로 번호 및 생물 반응기 내부의 세포 분열 따위에 의해 번식하는 능력이 포함됩니다. 우리는 통로 번호 폴리머 비계에 세포 시딩 시에 P3보다 크지 않아야하는 것이 좋습니다. 또한, 그것은 SMC 소스를 사용하기 전에 mycoplasma 무료 있는지 확인하기 위해 중요합니다. 우리는 mycoplasma - 오염된 세포 생물 반응기의 문화에 세포 증식 및 콜라겐 매트릭스 증착의 실질적인 감소로 이어질 것을 관찰했습니다. 이상 400,000 관상 동맥 이식은 작은 직경 (&lt;6mm) 혈관 이식 12 수요의 결과로, 매년 바이패스 작업에 필요합니다. 궁극적인 목표는 기본 조직의 생리 기능을 모방 기능성 소형 직경 혈관 엔지니어입니다. 우리의 타악기 생물 반응기 시스템은 병에 걸린 동맥을 복원하고 대체할 수있는 기능 동맥 이식을 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 재료의 이름 </th><th> 공급 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> FBS (태아 소 혈청) 열 Inactivated </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11,885 </td></tr><tr><td> rhFGF - 기본 </td><td> R &amp; B </td><td> 234 - FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF - BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520 - BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> 시그마 </td><td> 펜나 </td></tr><tr><td> 구리 (II) 황산 </td><td> 시그마 </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> 시그마 </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L - 알라닌 </td><td> 시그마 </td><td> A7469 - 25G </td></tr><tr><td> L - 프롤린 </td><td> 시그마 </td><td> P5607 - 25G </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A4544 - 25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375 - 100G </td></tr><tr><td> 실리콘 스토퍼 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex 튜브 L / S </td><td> 콜 - 파머 </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex 펌프 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron의 커프스 </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA 느낌 </td><td> 콩코디아 </td><td> MO000877 - 01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 통계 Surgipro II 봉합 </td><td> Syneture </td><td> VP - 557 - X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 메트릭 Dexon의 봉합 </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> 쓰리 웨이 스톱 콕 </td><td> 에드워즈 Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> 압력 변환기 </td><td> 에드워즈 Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV 가방 </td><td> 백스터 </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> 살린 희석 세트 </td><td> 화살 </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> 실리콘 튜브 </td><td> 세인트 - Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

많은 노력이 기능 작은 지름 동맥은 무시 재생하는 방법을 개발하고 발전하는데 최선을 다해오고 있습니다. 생리적 환경에서 모두 기계적 및 화학적 자극은 동맥 혈관의 1,2의 적절한 개발 및 기능을 유지하기 위해 필요합니다. 우리의 그룹에 의해 개발된 생물 반응기 문화 시스템은 기본 선박의을 흉내낸 정확하게 제어 화학 기계 환경에서 혈관 재생을 지원하기 위해 설계되었습니다. 우리의 생물 반응기 조립 및 유지 보수 절차는 매우 간단하고 3,4 매우 반복됩니다. 평활근 세포 (SMCs)는 호환 실리콘 튜브를 통해 스레드 및 최대 12 주 동안이나 타악기 자극없이 생물 반응기에서 교양있는 관형 polyglycolic의 산성 (PGA) 메쉬에 씨앗을 품고있다. 일부 이전부터 우리의 생물 반응기를 구분 네 가지 주요 속성이 있습니다. 1) 전용 원시 혈관의 주변 생화학을 시뮬레이트 다른 문화 시스템과는 달리, 우리의 생물 반응기는 또한 문화의 혈관에 순환 방사상 변형을 적용하여 생리 타악기 환경을 만듭니다. 2) 여러 설계 선박은 제어 화학 환경에서 다른 기계 조건 하에서 동시에 교양 수 있습니다. 3) 생물 반응기 쉽게 동물 주입 모델에 대한 설계 선박의 luminal쪽으로 코팅하는 내피 세포의 모노 레이어 (EC)를 수 있습니다. 4) 우리의 생물 반응기는 또한 서로 다른 직경의 크기와 문화 엔지니어링 선박은 특정 직경 크기에 맞게 각 생물 반응기에 맞는 노력을 절약 1mm에서 3mm로 원거리 수 있습니다. 우리의 생물 반응기에서 교양 설계 선박 어느 정도 histologically 원시 혈관을 닮은. 용기 벽의 세포는 평활근 마이 오신 중쇄 (SMMHC) 3 성숙 SMC 수축성 마커를 표현한다. 콜라겐의 상당한 금액이 설계 선박 5 최고의 기계적 강도에 대한 책임있는 세포외 기질 내에 입금됩니다. 생화 학적 분석은 또한 엔지니어링 선박의 콜라겐 함량이 기본 동맥 6에 필적 나타냅니다. 중요한 것은, 타악기 생물 반응기는 지속적으로 동물 모델 3,7 성공적으로 주입 실험을 허용 기계적 성질을 전시 혈관을 재생하고 있습니다. 또한이 생물 반응기는 더욱 비선형 광학 현미경 (NLOM) 8을 사용하여 시간이 지남에 따라 콜라겐 리모델링의 실시간 평가 및 추적, 비 invasively를 허용하도록 수정할 수 있습니다. 결론이 생물 반응기는 기능성 작은 ​​직경 이식 혈관의 재생을 조절 기본 메커니즘을 연구하는 훌륭한 플랫폼 역할을한다.

우리 그룹은 심장 혈관 시스템의 생리 타악기의 스트레스가 implantable 작은 직경 혈관 이식을 다시 생성하기 위해 일일 생물 반응기 문화 시스템을 개발했습니다.

기능적인 소구경 동맥 우회로를 재생하기 위한 방법론을 개발하고 발전시키기 위해 많은 노력이 기울여져 왔습니다. 생리학적으로...

본 절차의 전반적인 목표는 박동성 바이오리액터 시스템을 사용하여 생물학적 기반의 혈관 이식편을 제작하는 것입니다. 이는 세포가 성장할 수 있는 PGA 메쉬로 생분해성 스캐폴드를 제작하고 이를 바이오리액터 챔버 내에 조립함으로써 수행됩니다. 그 다음 스캐폴드에 평활근 세포를 배치하고, 공기 및 공급 튜브가 연결된 덮개로 바이오리액터 챔버를 밀봉합니다.그 후 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하여 바이오리액터 내의 혈관에 맥동성 흐름을 제공합니다. 리액터 내에서 세포는 면역화학적, 생화학적 및 기계적 테스트를 통과하는 혈관으로 성장합니다. 이 기술은 동맥 우회술을 위한 이식 가능한 소구경 혈관 이식편을 재생하는 유망한 접근 방식이므로, 관상동맥 질환 치료에까지 그 활용 가능성이 확장됩니다.이 방법은 혈관 공학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 주기적인 생리학적 힘을 받는 다른 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람은 어려움을 겪을 수 있습니다. 기술을 완전히 숙달하기 위해서는 많은 연습이 필요합니다.우리는 공학적 구조물을 재생하기 위해 생리학적 기계적 자극을 가하는 것이 중요하다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 접근 방식에 대한 아이디어를 얻었습니다. 바이오리액터 싱(sing) 공정은 단계가 많아 익히기 어렵고 상세한 시연을 통해서만 습득할 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 증류수를 사용하여 내경 3 mm의 실리콘 튜브를 30 cm 길이로 절단하여 세척한 후 자연 건조시킵니다.가위와 지혈 겸자를 사용하여 각 튜브 조각당 1.1 centimeter by 8 centimeter 크기의 PGA 메쉬 섹션을 절단합니다. Dexon 6.0 봉합사로 PGA 메쉬를 튜브에 고정하기 위해 외과적 매듭을 세 번 묶고 지혈 겸자로 단일 봉합을 수행하면, 고정된 메쉬가 PGA 스캐폴드가 됩니다. 스캐폴드를 1 molar 수산화나트륨에 1~2분 동안 담근 후, 증류수에 2분씩 세 번 담가 세척합니다. 세척 단계 사이마다 가볍게 닦아 물기를 제거하고, 세 번째 세척 후에는 후드 내에서 15분 동안 자연 건조시킵니다.건조시킨 후, 메쉬의 양쪽 끝에 1 cm 길이의 Dacron 커프를 세 바늘로 봉합합니다. 튜브가 2~3 mm 정도 겹치게 하고 튜브에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 본 프로토콜의 후속 단계를 위해 봉합사 약 15 cm를 여유 있게 남겨두어야 합니다.모든 바이오리액터 구성 요소와 도구는 사전에 오토클레이브 멸균합니다. 바이오리액터 배양을 시작하기 전날, 바이오리액터를 부분적으로 조립해야 하며, 스캐폴드, 메쉬, 실리콘 튜브, 수술 도구 및 바이오리액터 길이보다 긴 가는 와이어 등의 바이오리액터 구성 요소를 70% ethanol 용액에 최소 30분 동안 담가둡니다. 와이어를 사용하여 실리콘 튜브를 리액터의 사이드암으로 끌어당겨 통과시킵니다.이제 바이오리액터를 꺼내고, 플레어 처리된 유리 입구 위에 Dacron 커프를 고정하여 내부에 PGA 스캐폴드를 부착합니다. 남은 봉합사로 각 커프를 묶어 고정합니다. 다음으로, 커넥터를 사용하여 스캐폴드 한쪽의 실리콘 튜브를 바이오리액터 암 한 쌍에 연결하고, 스캐폴드 반대편의 튜브를 나머지 두 개의 암에 연결합니다.커넥터가 설치되면, 이를 사이드암에서 빼내고 바이오리액터 내부를 에탄올로 세척하십시오. 리액터를 각 측면당 10분 동안 담가 두십시오. 바이오리액터를 페트리 접시 위에 올려놓고 조직 배양액으로 세척하십시오.물을 흘려보내 세척합니다. 피펫을 사용하여 메쉬와 튜브 내부까지 충분히 세척하십시오. 이제 추후 사용을 위해 멸균된 마그네틱 바를 반응기에 넣고, 이때부터는 후드 내에서 블로어는 켜고 UV 램프는 끈 상태로 장치를 하룻밤 동안 건조하십시오.오염의 원인이 될 수 있으므로 반응기 위로 몸을 기울이지 마십시오. 설정 과정에서 모든 커넥터는 알코올로 깨끗이 닦아야 합니다. 연결하기 전, 많은 조인트 부위를 파라필름으로 보강하며, 파라필름은 적용 전 70% ethanol에 적셔야 합니다. 따라서 두 가지 모두 충분히 준비하십시오.예방 조치로, 내부의 PGA scaffold를 오염물질로부터 보호하기 위해 각 바이오리액터 개구부 위에 멸균 페트리 접시를 놓아 준비합니다. 이제 바이오리액터의 세 번째 미사용 암에 주입 포트를 부착하여 설정을 시작합니다. 다음으로, IV 백을 유량 시스템에 연결합니다.walrus 튜빙 세트를 사용하여, Y 분기점과 최대한 가까운 곳에서 파란색 끝단을 묶고 튜브를 클램프로 고정합니다. 빨간색 튜빙을 IV 백의 반대쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 흰색 튜브를 유체 흐름 시스템의 한쪽에 연결합니다.유량 시스템에 3방향 스톱콕(three-way stop cock)을 삽입합니다. 압력 트랜스듀서 튜브의 한쪽 끝을 스톱콕에 연결하고, 다른 쪽 끝을 IV 백의 중앙 개구부에 연결합니다. 이제 유량 시스템을 부분적으로 채우고 누출 여부를 확인하기 위해, IV 백에 350 milliliters의 PBS와 1% fungi zone을 추가합니다.흐름 시스템에 연결하기 전 또는 후에 60 milliliter 주사기를 사용하여, 스탑콕을 조절해 PBS의 흐름 방향을 제어하고 백을 짜서 시스템을 세척합니다. 이 단계는 세포 안착 전이나 후 어느 때든 수행할 수 있습니다. 이제 바이오리액터에 세포를 안착시킬 수 있습니다.본 예시에서는, 약 1개의 confluence 상태인 T 75 플라스크 분량에 해당하는 8백만 개의 SM 세포를 1.25 milliliters의 배지에 현탁하여, Dacron 접합부에서 Dacron 접합부까지 PGA 스캐폴드 위에 균일하게 떨어뜨려 줍니다. 세포를 첨가한 후, 알코올을 사용하여 바이오리액터의 테두리를 깨끗이 닦아냅니다. 리액터 위에서 몸을 기울이는 행동은 피하십시오.다음으로, 실리콘 마개 뚜껑을 조심스럽게 조립하십시오. 오토클레이브 백에서 뚜껑을 꺼낼 때나 이후의 부착 단계 동안 뚜껑 바닥면이 외부로 노출되지 않도록 주의하십시오. 먼저, 수커넥터(male connector) 부분에서 주입구와 공급 튜브를 연결하십시오.둘째, 세 개의 에어포트 각각에 PTFE 0.20 micron 필터를 부착합니다. 셋째, 주입구를 밀봉합니다. 조립된 실리콘 마개 덮개를 유리 바이오리액터에 삽입합니다.공급 튜브가 안착된 PGA 스캐폴드에 닿지 않도록 주의하십시오. 그 다음 파라폼으로 밀봉합니다. 이제 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하고, 바이오리액터와 유동 시스템을 37 °C 인큐베이터 안에 넣으십시오.25분에서 30분 동안 반응기를 옆으로 눕힌 상태로 5분마다 회전시켜야 합니다. 다음으로, 인큐베이터 내에 있는 상태에서 펌프를 통해 피딩 튜브로 바이오리액터 챔버에 4-10 배양액 400 milliliters를 채웁니다. 이제 파동 펌핑 없이 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 세포가 파종된 스캐폴드를 6~7일 동안 배양합니다.펌프를 켜기 전 이 기간 동안에는 배지 교체나 비타민 C 보충이 필요하지 않으며, 튜빙에 누출이나 꼬임이 없는지 점검하십시오. 그런 다음 펌프의 속도를 조절하여 압력 범위를 -30에서 270 mmHg 사이로 유지하십시오. 배양 기간 내내 매일 이 압력을 모니터링하고 유지하십시오.배지 교체 및 아스코르브산 보충은 스캐폴드가 맥동 펌핑을 통해 성장하는 동안 주 2회 수행해야 하며, 신선한 배지를 먼저 공급하기 위해 배지 교체 및 폐배지 제거용 공급 리드에 주입구와 PTFE 필터를 부착합니다. 다음으로, 공급 튜브를 이방향 펌프에 단단히 고정하고 한쪽 끝은 바이오리액터의 공급 포트에, 다른 쪽 끝은 공급 리드에 삽입합니다. 이제 200 milliliters의 배지를 천천히 펌핑하여 배출합니다.펌프 속도를 점진적으로 높입니다. 그런 다음 새로운 공급 튜브를 연결하고 200 milliliters의 신선한 배지를 천천히 펌핑하기 시작합니다. 반응기에 아스코르브산을 첨가하려면, 멸균된 30 milliliter 주사기를 사용하여 배지 25 milliliters를 제거하십시오.멸균된 ascorbic acid 용액 5 mL를 첨가한 후 25 mL를 다시 채웁니다. 공학적으로 제작된 혈관은 8주간의 배양 후 불투명하게 보이며 벽 두께는 약 250 µm에 도달합니다. 박동 조건 하에서 공학적 혈관의 hematoxylin, eosin 염색 결과는 시간 경과 및 박동에 따라 조직 형태가 변화함을 보여줍니다.혈관의 내강 측은 Masson's trichrome 염색에서 L로 표시됩니다. 콜라겐의 경우, 4주간 펄스 처리를 한 혈관이 비펄스 대조군보다 더 많은 콜라겐을 보유하고 있음을 보여줍니다. 흰색 화살표는 12주 차 혈관에 남아 있는 PGA 파편을 가리킵니다. 면역화학적 분석 결과, 초기 평활근 마커인 alpha actin, 중간 평활근 마커인 calponin 1, 그리고 후기 평활근 마커인 myosin heavy chain의 발현이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 7~8시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 본 지침에 따라 모든 과정을 최대한 깨끗하고 멸균된 상태로 진행하는 것이 중요합니다. 생체 내(in vivo) 연구 중 공학적 혈관의 유지에 있어 내강 표면 수정의 중요성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 공학적 혈관의 내강을 수정하는 것과 같은 다른 방법들을 개발 후에 수행할 수 있습니다.이 기술은 조직 공학, 특히 혈관 공학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 관상동맥 질환을 치료할 수 있는 잠재적 수단을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 동적 포스탈 배양(dynamic postal culture)을 통해 이식 가능한 공학적 혈관 이식편을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수산화나트륨을 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보안경과 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

타악기 흐름 생물 반응기에서 교양 혈관 평활근 세포와 탄성 PGS의 공사장 공중 발판은 비교적 짧은 기간에 문화 기본 ECM 생산과 유망 중소 지름 동맥 구조가 발생할 수 있습니다.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

동물의 희생까지 생체 내에서 엔드 - 투 - 엔드 문합 및 실시간 디지털 평가를 사용하여 양의 경동맥에 조직 설계된 선박 (TEVs)의 상호 위치 배치를위한 단계별 프로토콜입니다.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

이것은 조직 공학 챔버 내부의 미세 수술 동정맥 루프 또는 관류 척추경 구성을 사용하여 생체 내 혈관 조직을 구성하기 위한 지침입니다. 생성된 혈관 조직은 장기 재생 및 조직 결함 교체, 약물 검사 및 질병 모델링에 사용할 수 있습니다.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 흐름 챔버 모델, 조직 이식에 세균성 부착의 조사 수 있는 설명 합니다.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

배우세요 타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관 이식물을 제조하는 방법입니다. 생분해성 PGA 메쉬에 평활근 세포를 배양하여 기능성 혈관 구조를 형성하고 면역화학적, 생화학적, 기계적 특성을 평가합니다.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

더 많은 동영상 탐색