타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

이 실험 절차의 전반적인 목표는 맥동형 바이오리액터 시스템을 사용하여 생물학적 기반의 혈관 이식편을 제작하는 것입니다. 이는 세포가 성장할 수 있도록 PGA 메쉬로 생분해성 지지체를 준비하고 이를 바이오리액터 챔버 내에 조립함으로써 달성됩니다. 이후 지지체에 평활근 세포를 배양하고, 공기 및 공급 튜브가 연결된 뚜껑으로 바이오리액터 챔버를 밀봉합니다.

그 다음 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하여 바이오리액터 내의 혈관에 박동성 흐름을 제공합니다. 리액터 내에서 세포는 면역 화학적, 생화학적 및 기계적 테스트를 통과하는 혈관으로 성장합니다. 이 기술은 동맥 우회술을 위한 이식 가능한 소구경 혈관 이식물을 재생하는 유망한 접근 방식이므로, 관상동맥성 심장질환 치료에 응용될 수 있습니다.

이 방법은 혈관 공학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 주기적인 생리학적 힘을 받는 다른 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 수 있습니다. 기술을 완전히 숙달하기 위해서는 많은 연습이 필요합니다.

우리는 공학적 구조물을 재생하기 위해 생리학적 기계적 자극을 적용하는 것의 중요성을 인식했을 때 처음으로 이 접근 방식을 고안했습니다. 바이오리액터 공정은 단계가 많아 습득하기 어렵고 세부적인 시연을 통해서만 배울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저, 증류수를 사용하여 내경 3 mm의 실리콘 튜브 30 cm 섹션을 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다.

가위와 지혈겸자를 사용하여 각 튜브 조각에 맞게 1.1 cm × 8 cm 크기의 PGA 메쉬 섹션을 자릅니다. Dexon 6.0 봉합사를 사용하여 PGA 메쉬를 튜브에 고정하며, 외과적 매듭을 세 번 묶은 후 지혈겸자로 단일 봉합을 수행하여 PGA 스캐폴드를 제작합니다. 스캐폴드를 세척하기 위해 먼저 1 M 수산화나트륨 용액에 1~2분 동안 담근 후, 증류수에 2분씩 총 세 번 담급니다. 세척 단계 사이마다 가볍게 두드려 물기를 제거하고, 세 번째 세척 후에는 후드 내에서 15분 동안 자연 건조합니다.

건조 후, 메시의 양 끝에 1cm Dacron 커프를 세 바늘로 봉합합니다. 튜브가 2~3mm 정도 겹치게 하고 튜브를 찌르지 않도록 주의하십시오. 이후 프로토콜에서 사용할 수 있도록 약 15cm의 봉합사를 남겨 두어야 합니다.

모든 바이오리액터 구성 요소와 도구는 사전에 고압 멸균합니다. 바이오리액터 배양을 시작하기 전날, 바이오리액터를 부분적으로 조립해야 하며, 스캐폴드, 메쉬, 실리콘 튜브, 수술 도구 및 바이오리액터 길이보다 긴 가는 와이어를 포함한 바이오리액터 구성 요소를 70% ethanol 용액에 최소 30분 동안 담가 둡니다. 와이어를 사용하여 실리콘 튜브를 리액터의 사이드암(sidearm) 쪽으로 끌어당겨 통과시킵니다.

이제 바이오리액터를 꺼내어, 확장된 유리 입구 위로 Dacron 커프를 고정하여 내부에 PGA 스캐폴드를 부착합니다. 남은 봉합사로 각 커프를 묶어 고정하십시오. 다음으로, 커넥터를 사용하여 스캐폴드 한쪽의 실리콘 튜빙을 한 쌍의 바이오리액터 암에 연결하고, 스캐폴드 반대편의 튜빙을 나머지 두 개의 암에 연결합니다.

커넥터를 설치한 후, 사이드암에서 커넥터를 빼내고 에탄올로 바이오리액터를 세척합니다. 각 측면에서 10분 동안 리액터를 담가 둡니다. 바이오리액터를 페트리 접시 위에 올려놓고 조직 배양액으로 세척합니다.

물을 넣어 세척합니다. 피펫을 사용하여 메쉬와 튜브 내부도 반드시 씻어내십시오. 이제 향후 사용을 위해 멸균된 마그네틱 바를 반응기에 넣고, 이후부터는 후드 내에서 블로워는 켜고 UV 램프는 끈 상태로 장치를 하룻밤 동안 건조합니다.

오염의 위험이 있으므로 반응기 위로 몸을 기울이지 마십시오. 설치 과정에서 모든 커넥터는 알코올로 깨끗이 닦아야 합니다. 연결하기 전, 많은 조인트 부위를 파라필름으로 보강하며, 파라필름은 사용 전에 70% ethanol에 적셔야 합니다. 따라서 두 가지 모두 충분히 준비하십시오.

오염 방지를 위한 예방 조치로, 각 바이오리액터 개구부 위에 멸균 페트리 접시를 놓아 내부의 PGA 스캐폴드를 보호합니다. 이제 바이오리액터의 사용하지 않은 세 번째 암에 주입 포트를 연결하여 설정을 시작하십시오. 그다음, IV 백을 유량 시스템에 연결합니다.

walrus 튜브 세트를 사용하여, 파란색 끝부분을 Y형 분기점과 최대한 가깝게 묶고 튜브를 클램프로 고정합니다. 빨간색 튜브를 IV 백의 반대쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 흰색 튜브를 유체 시스템의 한쪽에 연결합니다.

유량 시스템에 3방향 스톱콕을 삽입합니다. 압력 변환기 튜브의 한쪽 끝을 스톱콕에 연결하고, 다른 쪽 끝을 IV 백의 중간 개구부에 연결합니다. 이제 유량 시스템을 부분적으로 채우고 누출 여부를 확인하기 위해, IV 백에 350 milliliters의 PBS와 1% fungi zone을 추가합니다.

유동 시스템에 연결하기 전 또는 후에 60 milliliter 주사기를 사용하여, 스톱콕을 조절해 PBS의 흐름 방향을 제어하고 백을 짜서 시스템을 세척합니다. 이 단계는 세포 안착 전이나 후에 모두 수행할 수 있습니다. 이제 바이오리액터에 세포를 안착시킬 수 있습니다.

본 예시에서는, 약 T 75 플라스크 한 개 분량의 합류 상태인 8 million SM 세포를 1.25 milliliters의 배지에 부유시킨 후, Dacron 접합부에서 Dacron 접합부까지 PGA 스캐폴드 위에 균일하게 떨어뜨려 접종합니다. 세포를 추가한 후, 알코올을 사용하여 바이오리액터의 테두리를 깨끗이 닦아냅니다. 리액터 위로 몸을 숙여 머무르지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 실리콘 스토퍼 리드를 조심스럽게 조립합니다. 리드를 오토클레이브 백에서 꺼낼 때나 이후의 부착 단계에서 리드의 바닥면이 노출되지 않도록 주의하십시오. 먼저, 인젝션 포트를 피딩 튜브의 수커넥터(male connector)에 부착합니다.

둘째, 세 개의 에어포트 각각에 PTFE 0.20 micron 필터를 부착합니다. 셋째, 주입구를 파라필름으로 밀봉합니다. 조립된 실리콘 스토퍼 뚜껑을 유리 바이오리액터에 삽입합니다.

급식관이 안착된 PGA 스캐폴드에 닿지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 파라폼(paraform)으로 밀봉합니다. 이제 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하고, 바이오리액터와 유동 시스템을 37 °C 인큐베이터 안에 넣으십시오.

25분에서 30분 동안 반응기를 옆으로 눕힌 상태에서 5분마다 회전시켜야 합니다. 다음으로, 인큐베이터 내에서 펌프와 피딩 튜브를 사용하여 바이오리액터 챔버에 400 milliliters의 4:10 배양액을 채웁니다. 이제 세포가 접종된 스캐폴드를 박동성 펌핑 없이 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 6~7일 동안 배양합니다.

펌프를 켜기 전까지 이 기간 동안에는 배지 교체나 비타민 C 보충이 필요하지 않으며, 튜빙에 누출이나 꼬임이 없는지 점검하십시오. 그런 다음 펌프의 속도를 조절하여 압력 범위를 -30에서 270 mmHg 사이로 유지하십시오. 배양 기간 내내 매일 이 압력을 모니터링하고 유지하십시오.

배지 교체 및 아스코르브산 보충은 맥동 펌핑을 통해 신선한 배지를 공급하며 스캐폴드를 배양하는 동안 일주일에 두 번 수행해야 합니다. 먼저, 배지 교체 및 폐배지 제거를 위해 피딩 리드에 주입 포트와 PTFE 필터를 부착하십시오. 다음으로, 피딩 튜브를 양방향 펌프에 단단히 고정하고 한쪽 끝은 바이오리액터의 피딩 포트에, 다른 쪽 끝은 피딩 리드에 삽입하십시오. 이제 200 milliliters의 배지를 천천히 펌핑하여 배출하십시오.

펌프 속도를 서서히 높입니다. 그런 다음 새 공급 튜브를 연결하고 200 milliliters의 신선한 배지를 천천히 펌핑하기 시작합니다. 반응기에 아스코르브산을 첨가하려면 멸균된 30 milliliter 주사기를 사용하여 배지 25 milliliters를 제거하십시오.

멸균된 아스코르브산 용액 5 mL를 첨가한 후, 25 mL의 배지로 다시 채웁니다. 공학적으로 제작된 혈관은 8주간의 배양 후 불투명하게 보이며 벽 두께는 약 250 µm에 도달합니다. 박동 조건 하에서, 제작된 혈관의 hematoxylin, eosin 염색 결과는 시간이 경과함에 따라 그리고 박동에 따라 조직 형태의 변화를 보여줍니다.

혈관의 내강 쪽은 L로 표시하였으며, Masson's trichrome 염색을 실시하였습니다. 콜라겐의 경우, 4주간 펄스-처리를 한 혈관이 비펄스 대조군보다 더 많은 콜라겐을 보유하고 있음을 보여줍니다. 흰색 화살표는 12주 차 혈관 내에 남아 있는 PGA 파편을 가리킵니다. 면역화학 분석 결과, 초기 평활근 마커인 alpha actin, 중간 평활근 마커인 calponin 1, 그리고 후기 평활근 마커인 myosin heavy chain의 발현이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 7~8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 본 지침에 따라 모든 과정을 최대한 깨끗하고 무균적으로 진행하는 것이 중요합니다. 생체 내(in vivo) 연구 기간 동안 공학적으로 제작된 혈관의 유지 관리에 있어 내강 표면 수정의 중요성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 제작된 혈관의 내강을 수정하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 완료 후 말입니다.

이 기술은 조직 공학, 특히 혈관 공학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 관상동맥 질환을 치료할 수 있는 잠재적 수단을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 동적 사후 배양을 통해 이식 가능한 공학적 혈관 이식편을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수산화나트륨을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보안경 및 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.