타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

이 절차의 전반적인 목표는 박동성 생물반응기 시스템을 사용하여 생물학적 기반 혈관 이식편을 엔지니어링하는 것입니다. 이는 세포가 줄지어 자랄 PGA 메쉬에서 생분해성 골격을 준비하고 생물반응기 챔버에서 조립함으로써 수행됩니다. 그런 다음 골격에는 평활근 세포가 안착되고 공기와 공급 튜브가 있는 뚜껑이 생물반응기 챔버를 밀봉합니다.

그런 다음 생물 반응기는 흐름 시스템에 연결되어 생물 반응기의 용기에 박동 흐름을 제공합니다. 반응기에서 세포는 면역화학적, 생화학적, 기계적 테스트를 통과한 용기로 성장합니다. 이 기술의 의미는 관상 동맥 질환 치료로 확장되는데, 그 이유는 이 기술이 동맥 우회를 위한 이식 가능한 소구경 혈관 이식편을 재생하기 위한 유망한 접근 방식이기 때문입니다.

이 방법은 혈관 공학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 주기적인 생리학적 힘을 받는 다른 장기 시스템에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 기술을 완전히 습득하려면 많은 연습이 필요합니다.

우리는 공학적 구조물을 재생하기 위해 생리적 기계적 자극을 적용하는 것의 중요성을 깨달았을 때 이 접근 방식에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법의 시각적 시연은 생물반응기 노래 과정이 많은 단계가 있고 자세한 시연을 통해서만 습득할 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 시작하려면 증류수를 사용하여 내경 3mm 실리콘 튜브의 30cm 길이 부분을 청소하고 자연 건조시킵니다.

가위를 사용하여 지혈기를 사용하여 각 튜브 조각에 대해 PGA 메쉬의 1.1cm x 8cm 섹션을 잘라내어 Dexon 6.0 봉합사가 있는 튜브에 대한 PGA 메쉬가 3개의 수술 매듭을 묶고 지혈로 단일 스티치를 한 다음 고정된 메쉬가 PGA 골격을 만듭니다. 먼저 골격을 1몰 수산화나트륨에 1-2분 동안 담근 다음 증류수에 3번 담그고 딥당 2분 동안 세척합니다. 세탁 사이에 두드려 말리고 세 번째 세탁 후 15분 동안 후드에서 자연 건조시킵니다.

건조되면 메쉬의 각 끝에 3개의 스티치로 1cm Dacron 커프스를 봉합합니다. 2-3mm 튜브가 겹치게 하고 튜브에 구멍을 뚫지 마십시오. 이 프로토콜에서 나중에 사용할 수 있도록 약 15cm의 자유 봉합사를 남겨 두십시오.

모든 바이오리액터 구성 요소와 도구는 사전에 자동 클레이빙됩니다. 생물반응기 배양을 시작하기 전날, 생물반응기는 부분적으로 조립되어야 합니다., 생물반응기 구성 요소, 골격, 메쉬 실리콘 튜브, 수술 기구 및 생물반응기의 길이보다 긴 가는 와이어를 70% 에탄올 욕조에 최소 30분 동안 담그는 동안. 와이어를 사용하여 반응기의 사이드암을 통해 실리콘 튜브를 당깁니다.

이제 생물 반응기가 나오고 나팔 모양의 유리 입술에 Dacron 커프를 고정하여 PGA 골격을 내부에 부착합니다. 여분의 봉합사를 사용하여 각 커프를 묶습니다. 다음으로, 커넥터를 사용하여 한 쌍의 생물 반응기 암으로 골격의 한쪽면에있는 실리콘 튜브를 부착하고 골격의 다른쪽에있는 튜브를 다른 두 암에 부착합니다.

커넥터가 설치되면 사이드암에서 커넥터를 당겨 빼내고 생물 반응기를 에탄올로 씻어냅니다. 반응기를 양쪽에서 10분 동안 담가둡니다. 일부 페트리 접시에 생물 반응기를 놓고 조직 배양으로 씻어냅니다.

급료 물. 피펫을 사용하여 메쉬와 튜브도 씻어내십시오. 이제 나중에 사용할 수 있도록 멸균 교반 막대를 반응기에 놓고 이 시점부터 송풍기를 켜고 UV를 끈 상태에서 후드에서 장치를 밤새 건조시킵니다.

오염으로 이어질 수 있으므로 반응기에 기대지 마십시오.설정하는 동안 모든 커넥터를 알코올로 깨끗이 닦아야 합니다. 부착물을 만들기 전에 많은 조인트를 파라폼으로 보강한 다음 적용하기 전에 70% 에탄올에 담가야 합니다. 그러니 둘 다 많이 드십시오.

예방 조치로 각 생물 반응기 개구부에 멸균 페트리 접시를 놓아 내부의 PGA 골격을 오염 물질로부터 보호하십시오. 이제 주입 포트를 사용하지 않는 세 번째 생물반응기 암에 연결하여 설정을 시작합니다. 다음으로, IV 백을 플로우 시스템에 연결합니다.

바다코끼리 튜빙 세트를 사용하여 파란색 끝을 Y 접합부에 최대한 가깝게 묶고 튜브를 고정합니다. 빨간색 튜브를 IV 백의 맨 끝에 부착합니다. 그런 다음 흰색 튜브를 흐름 시스템의 한쪽에 부착합니다.

3방향 정지 콕을 흐름 시스템에 삽입합니다. 압력 변환기 튜브의 한쪽 끝을 스톱 콕에 부착하고 다른 쪽 끝을 IV 백의 중간 구멍에 부착합니다. 이제 흐름 시스템을 부분적으로 채우고 누출을 확인하기 위해 IV 백에 350ml의 PBS와 1%곰팡이 영역을 추가합니다.

유량 시스템에 연결하기 전이나 후에 60ml 주사기를 사용하여 마개를 조정하여 PBS의 흐름 방향을 제어하고 백을 짜서 시스템을 세척합니다. 이 단계는 감방에 앉기 전이나 후에 수행할 수 있습니다. 이제 세포를 생물반응기에 앉힐 수 있습니다.

이 예에서 resus는 1.25밀리리터의 배지에 약 하나의 합류 T 75인 800만 개의 SM 세포를 현탁시키고 Dacron 접합에서 Dacron 접합까지 PGA 골격에 균일하게 떨어뜨립니다. 세포를 추가한 후 알코올로 생물 반응기의 가장자리를 깨끗이 닦습니다. 반응기 위로 마우스를 올리지 마십시오.

그런 다음 실리콘 마개 뚜껑을 조심스럽게 조립합니다. 오토클레이브 백에서 뚜껑을 꺼낼 때 또는 다음 부착 단계 중 하나를 수행하는 동안 뚜껑 바닥이 노출되지 않도록 하십시오. 먼저 주입 포트를 수 커넥터의 공급 튜브에 부착합니다.

둘째, 3개의 공항 각각에 PTFE 0.20미크론 필터를 부착합니다. 세 번째 파라, 주입구를 촬영합니다. 조립된 실리콘 마개 뚜껑을 유리 생물반응기에 삽입합니다.

공급 튜브가 장착된 PGA 비계에 닿지 않도록 하십시오. 그런 다음 파라폼으로 밀봉합니다. 이제 바이오리액터를 유량 시스템에 연결하고 바이오리액터와 유량 시스템을 섭씨 37도의 인큐베이터 내부에 배치합니다.

25분에서 30분 동안 반응기를 옆으로 눕히고 5분마다 회전해야 합니다. 다음으로, 인큐베이터에 있는 동안 공급 튜브를 통한 펌프를 사용하여 400ml의 4-10 배양 배지로 생물 반응기 챔버를 채웁니다. 이제 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 6-7 일 동안 박동 펌핑없이 파종 된 골격을 배양하십시오.

이 기간 동안 중간 변화나 비타민 C 보충이 필요하지 않습니다.펌프를 켜기 전에 튜브에 누출이나 꼬임이 있는지 검사하십시오. 그런 다음 펌프의 속도를 조정하여 수은 음의 30mm에서 270mm 사이의 압력 범위를 유지합니다. 배양 전반에 걸쳐 이 압력을 매일 모니터링하고 유지하십시오.

아스코르브산의 중간 변화 및 보충은 일주일에 두 번 수행해야 하며, 골격이 박동 펌핑으로 성장하여 새로운 배지를 먼저 공급하고, 배지 교체 및 중간 폐기물 처리 목적을 위해 주입 포트와 PTFE 필터를 공급 뚜껑에 부착해야 합니다. 그런 다음 공급 튜브를 이중 방향 펌프에 단단히 놓고 한쪽 끝을 생물 반응기의 공급 포트에 삽입하고 다른 쪽 끝을 공급 덮개에 삽입합니다. 이제 천천히 200ml의 매체를 펌핑하기 시작합니다.

점차적으로 펌프 속도를 높일 수 있습니다. 그런 다음 새 공급 튜브를 연결하고 200ml의 새 배지를 천천히 펌핑하기 시작합니다. 반응기에 아스코르브산을 추가하려면 멸균 30ml 주사기를 사용하여 25ml의 배지를 제거합니다.

멸균 아스코르브산 용액 5ml를 넣은 다음 25ml를 반환합니다. 중형 엔지니어링 용기는 불투명하게 보이며 8주간의 배양 후 약 250미크론의 벽 두께를 달성합니다. 박동성 조건에서 공학적 혈관의 hemat, toin 및 eosin 염색은 시간과 맥동에 따른 조직 형태 변화를 보여줍니다.

혈관의 발광면은 L masson의 tri CHRO stain으로 표시됩니다. 콜라겐 쇼의 경우, 4주 동안 펄스를 앓은 혈관은 펄스가 없는 혈관보다 콜라겐이 더 많음을 보여주며, 흰색 화살표는 혈관에 12주까지 남아 있는 PGA 단편을 가리킵니다. 면역화학 분석은 초기 평활근 마커 알파 액틴, 중간 평활근 마커 cal poin one 및 후기 평활근 마커 미오신 중쇄의 발현을 보여줍니다. 이 기술은 한 번 숙달되면 적절하게 수행되면 7-8시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 모든 것을 가능한 한 깨끗하고 엄격하게 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 생체 내 연구 중 엔지니어링된 용기의 유지 관리에서 내광 표면 수정의 중요성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 엔지니어링된 용기의 루멘 수정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후.

이 기술은 조직 공학, 특히 혈관 공학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 관상 동맥 질환을 치료할 수 있는 잠재적인 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 역동적인 우편 문화를 통해 이식형 엔지니어 혈관 이식편을 달성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 수산화나트륨으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 눈 보호 및 실험실 가운과 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.