Name: 해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: 학습하세요 마우스 주변 림프절 해부 및 2광자 이미징 기법을 통해 CD4+ T 세포 이동성을 관찰하는 방법을. 형광 표지된 T 세포의 수용체 전이와 림프절 분리 과정을 포함하며 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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우리는 시약의 준비와 지원 레베카 파켓 감사하고 싶습니다. MPM은 건강과 보조금 GM - 41514 (MDC), NS - 48252 (KGC), 또한 국립 보건원에서 GM - 48071 (IP)의 지원 국립 연구소에서 루스 L. Kirchstein predoctoral 친교에 의해 지원됩니다.

1. 세포의 입양 전송 : 꼬리 정맥 또는 intraocular 주사 셀 추적 - 라벨이나 형광 단백질 표현 lymphocytes의 도입에 대해 모두 적합한 방법입니다. 이 비디오에서. 우리는 꼬리 정맥 주입에 의해 세포의 입양 전송을 보여줍니다. A. 자료 CD4 + T 세포가 37 º C에서 30 분 1.4 μm의의 CFSE으로 표시 들이고, 두 번 씻어 및 RPMI - 1640 100 μL에 다시 정지. 세포 주입을위한 멸균 28 게이지 인슐린 주사기에로드됩니다. 사용하는 세포의 숫자는 실험이 완료되는에 따라 달라집니다. 일반적으로 5 백만 T 세포는 T 세포 간단한 시각화 충분합니다. 마우스 쥐 restrainer은 동물과 자신에게 부상을 방지하기 위해 필요합니다. B. 동물 확보 마우스는 천천히 (동영상 참조) 쥐 restrainer에 동물을 백업하고 부드럽게 플런저를 우울하여 튜브의 열린 끝을 닫아 입양 전송을위한 보안입니다. 몇 가지 작은 동물이 restrainer 내부 돌아 수 있으므로,이 과정에서 마우스 꼬리 놓지 마십시오. 이 방법은 자신을 상처로부터 주입하는 동안 이동에서 동물을 방지할 수 있습니다. 쥐 restrainer을 설정할 때, 앞으로 점프에서 동물을 유지하는 데 필요한보다 더의 플런저를 밀어하지 않습니다. 또한, 오랜 기간 동안 restrainer에있는 동물을 떠나지 않는 동물에 대한 플런저를 밀어하지 않으며. C. 꼬리 정맥을 떠올리 부드럽게가 가볍게 당신의 검지 손가락을 통해 싼와 엄지로 손가락 안쪽에 개최되도록 당신을 향해 꼬리를 가져옵니다. 수직 꼬리의 양쪽에있는 꼬리 정맥을 식별합니다. 시각화는 다음 에탄올로 닦고, 따뜻한 물로 꼬리를 온난 화에서 용이합니다. D. 세포의 분사 정맥이있는되면, 정맥에 얕은 각도 병렬에서 주사기 베벨 쪽을 삽입합니다. 일단 정맥에 부드럽게 플런저를 우울하게, 당신은 정맥에 주사하는 경우에 대해 저항도 없을 것입니다. 어떤 저항이있다면 주사기를 제거하고 다른 위치에 다시 시도하십시오. 당신이 정맥에 주입하는 경우가 완료될 때까지 천천히 플런저를 우울. 꼬리는 사출 동안 팽창이 될 것입니다. 그것이 없으면, 이것은 바늘이 혈관에 있지 않은 것을 의미합니다. 주사하는 동안 정맥를 &quot;분실&quot;하는 것이 가능합니다. 이런 경우에는 바늘을 제거하고 다른 자리에 주사를보십시오. 하나 이상의 주사를 시도해야하는 경우 그것은 원래의 주사 사이트에서 마우스의 몸에 대한 꼬리를 이동하는 것이 좋습니다. 입양 전송에서 또 다른 시도에 대해 자신에게 공간을 제공하기 위해 꼬리에 distally 시작하여이 가능성에 대해 미리 계획을 세우십시오. E. 포스트 분사 고려 주입이 완료되면 정맥의 혈액의 작은 뒤로 흐름이 발생합니다. 부드럽게 출혈이 멈출 때까지 청소 닦아와 주사 사이트를 누릅니다. 플런저를 제거하고 부드럽게 꼬리로 누른 상태에서 동물이 밖 restrainer의 앞으로 갑시다. 항상 당신이 준수되도록하기 위해 동물 관리위원회 동물 사용 프로토콜에 문의하십시오. 실제 실험을 시도하기 전에이 기술 여러 번 연습하는 것이 중요합니다. 2. 림프절 격리 두 광자 이미징을위한 림프절의 절연은 주변 조직에서 올바른 림프 노드의주의 제거가 필요합니다. A. 선택과 주변 림프절의 위치 이미징을위한 림프절의 선택은 실험의 목표에 따라 달라집니다. 지역 감염이나 사출 배수 림프절을 인식하고, 영상에 해당하는 노드를 선택합니다. 반 덴 브로크 외 의한 문서., 세부 3 murine 림프절의 위치와 형태에 대해 설명합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세포 격리 또는 영상에 적합 여섯 대형 주변 림프절의 절단을 보여줍니다. B. 림프절 제거 : 림프절을 제거하는 동안 염두에두고 조직의 무결성을 유지. 하지 파열 캡슐을하거나 어떤 식으로든 손상의 림프절 구조를주의하십시오. 림프절 구조적 무결성의 손실이 실험을 손상됩니다. 필요한 경우, 해부 현미경으로 미세 (# 5 뒤몽) 해부 포셉와 림프절 표면에서 지방을 제거합니다. 임파선이 빛을 산란하여 영상을 흐릿하게하므로, 노드의 표면에 남아있는 지방을 말았 어야지. 림프절의 적절한 절단도 처음으로 실제 실험을하기 전에 연습하는 중요한 기술입니다. 3. 림프 노드E 이미징 설치 및 고려 사항 림프절이 경우에는 recessed 챔버로 구성되어 이미징 단계에 확보해야합니다. 예열 산소 - perfused 미디어가 연동 펌프와 인라인 히터를 사용하여 한쪽에서 챔버에 펌핑하고, 폐기물 수집 플라스크에 진공 튜브와 수집 챔버로 아래쪽 등급 채널을 통해이 종료됩니다. 시스템에서 림프절은 37에 빠져들 수 있습니다 ° C 미디어와 의료 학년 carbogen (5 % CO 2 95 % O 2)와 슈퍼 perfused. 가능한 같은 재관류 미디어의 온도는 림프절에 가까운로 기록되어야합니다. 특정 시스템은 미디어 유량 및 무대 디자인 변화가 현미경의 무대와 목적을 수용해야 할 수도 있습니다. A. 림프절의 이미지 설정 : 마찬가지로 비디오와 같이, 우리가 처음 그것을 부착하여 림프절을 확보, 적절한 크기로 절단 플라스틱 coverslip, 아래로 골수의 쪽 (이미지 T 또는 수직 현미경을 사용하여 B 세포 지역으로). 무독성 조직 접착제를 (우리는 3M 사의 VetBond ™를 사용)를 사용하는 것이 중요합니다. coverslip은 다음 이미징 챔버의 유리 기지에 이것을 준수, 커버 슬립의 아래쪽에 실리콘 그리스의 작은 소량을 배치하여 흐르는 매체 확보됩니다. B. 2 - 광자 이미징 고려 사항 : 여러 가지 요인이 lymphocytes가 이동을 중지시킬 수 있습니다 : 너무 높거나 너무 낮습니다 온도, 과도한 레이저의 파워, 압축 또는 림프절 다른 손상 및 산소 부족합니다. 과도한 레이저 전력이나 온도에 의한 손상&gt; ~ 39 ° C 되돌릴 수 있습니다. 세포가 희미한 경우, 그것은 오히려 세포를 시각화하는 높은 레이저 전원을 사용하여보다 검출기 이득 또는 셀 라벨 프로토콜을 높이기 위해 일반적으로 더 좋습니다. 형광 단백질의 라벨이나 표현의 최적화는 배경 autofluorescence의 수준 위에있는 형광을 제공할 수 필요할 수 있습니다. 기준 이상의 형광의 두 로그의 변화에​​ 대한 합리적인 이득 및 레이저 전원 설정과 함께 (유동세포계측법에 의해 측정) 세포 시각화를위한 합리적이다. 조정할 수있는 두 개의 광자 레이저로 여기에 사용되는 파장은 몇 군데되는 형광단의 더블 단일 광자 여기 최대보다 약간 작아야한다. 하나 이상의 레이블이나 형광 단백질을 사용하여 두 광자 실험에서는 두 레이블에 대한 최적 설정을 찾는 데 사용 여기 파장과 실험해야 할 수도 있습니다. 두 광자 여기는 원리 푸른 초 고조파 생성을 활용하여 이미지 내생 콜라겐 구조하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 고조파 세대 (SHG가) 2 광자가 물질 내에서 결합 어디 발생하고 원래의 광자의 두 주파수의 단일 광자 방출. 조직에서 두 광자 여기는 사고 레이저 빛이 같은 콜라겐과 같은 고도로 주문 단백질 구조 직각 경우에 발생합니다. 두 광자 이미징에 관한 실용적인 문제는 미리 리뷰 4, 5에서 논의되었습니다.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
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</ol>

이 비디오 프로토콜에서 우리는 입양 세포 전송 및 주변 림프절의 영상 림프구의 운동성에 필요한 림프절 절연 및 준비 절차를 보여줍니다. 두 광자 이미징 모두 explanted 티슈 (여기에 표시) 및 intravital 준비에 공촛점 이미징을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 특히, 빛의 산란을 최소화하고 림프절의 캡슐 아래 영상 ~ 300 micrometers 가능하며 일부 조직 4 깊이 적외선 여진 중 하나를 사용하십시오. 또한, 다중 광자 여기는 표백 사진 및 초점 비행기 측면 밖으로 조직 손상을 최소화, 목적의 초점으로 제한됩니다. 새로운 기술과 마찬가지로, 그러나, 두 광자 영상은 만병 통치약이 아니므로 그 제한과 잠재적인 함정은 마음 5 보관해야합니다. 관심 콜라겐 - 세포와 같은 두 번째 고조파 세대로 본질적인 신호를 제외하면 찬란 외부 프로브 또는 형광 단백질의 표현에 의해 표시되어야합니다 - 이러한 가운데 그 요구 사항입니다. 노출 따라서 이러한 분류 세포가 검은 무효로 수영하는가 생성됩니다, 사실 그들은에 열중하고 있으며, 구조적 요소와 무수한 다른 레이블이 지정되지 않은, 보이지 않는 세포의 복잡한 환경과 상호 작용하는 반면. 면역학에 두 광자 이미징의 도입 이후 6 년 만에,이 기술은 직접 세포 - 세포 상호 작용, 세포 운동성 및 현지화, 세포 신호 전달 경로와 세포 독성 세포를 포함하여 그대로 살아있는 조직 프로세스의 시각화하여 오랜 질문을 해결하기 위해 연구자 수 있습니다 이벤트를 죽이고. 필드는 신속하게 초기 현상 학적 설명을 넘어 진화하고 있으며, 함께 컴퓨터 모델링 및 시뮬레이션과 정량 분석​​은 지금 림프절 내에 분명히 혼란 세포 움직임과 상호 작용이 효율적인 면역 반응으로 이어질 방법을 이해하기 위해 시작되었습니다. 이 진행은 종합적으로 immunoimaging에 대한 두 광자 현미경의 응용 프로그램을 설명하는 100 종이 넘는리스트 최근 간행물 1에서 검토합니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 1의 개시에 운동성 및 세포 상호 작용의 우아한 안무를 밝혔다. 여기, 우리는 표시된 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + 첫번째 2002 2에서 설명한대로 explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을위한 방법을 제시한다. 면역 세포의 2 광자 영상은 세포가 찬란 셀 추적기 색소와 얼룩이나 형광 단백질을 표현을 통해, 레이블 것을 요구합니다. 우리는받는 동물의 꼬리 정맥 약 15-30 분 이내에 림프 장기들이 집.에 공여 마우스에서 파생된 주입 세포의 입양 전송 절차를 보여주는 우리는 림프 노드의 절연 설명하고 excised 림프 노드의 적절한 장착을 보장하는 방법을 설명합니다. 이러한 perfused 미디어, 온도 및 레이저 파워의 적절한 산소와 같은 다른 고려 사항은 설명합니다. 마지막으로, 우리는 순진한 CD4의 3D 영상 + T 세포 37 정상 상태 운동성을 전시을 제시 ° C.를

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

이광자 이미징을 통해 기저 상태 및 ... 상황에서 림프절 내 운동성과 세포 상호작용의 정교한 조율 과정이 밝혀졌습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California Irvine)의 Micah Helen 연구실 소속 Melanie Matthew입니다. 오늘은 insitu to photon imaging을 목적으로 마우스의 림프절을 적출하는 과정을 살펴보겠습니다.여기에는 서혜 림프절, 액와 림프절 및 경부 림프절의 제거가 포함됩니다. 마우스의 림프절에 형광 세포를 도입하기 위해, 접근이 용이한 6개의 말초 림프절을 이용합니다. 두 개의 버튼 이미징으로 영상화하기 위해, 먼저 형광 표지된 세포의 입양 전이를 수행해야 합니다.본 실험에서는 먼저 입양 이식(adoptive transfer) 과정을 보여드리겠습니다. 여기 28게이지 인슐린 주사기가 있습니다. 여기에 세포 또는 세포 현탁액을 채우겠습니다.먼저 시린지가 부드럽게 작동하도록 막힌 부분을 뚫어주겠습니다. 그런 다음 세포를 조심스럽게 로딩하겠습니다. 인슐린 시린지로 튜브의 벽면을 건드리지 않도록 주의할 것인데, 이는 시린지 끝이 무뎌져 쥐의 꼬리 정맥 주사가 더 어려워질 수 있기 때문입니다.기포가 있는 경우, 가볍게 쳐서 기포를 제거하거나 옆으로 밀어내야 합니다. 여기를 톡톡 쳐서 제거하십시오. 이제 완료되었습니다.이제 이 세포들을 꼬리 정맥에 주입할 준비가 되었습니다. 여기 C 57 black six 마우스가 있습니다. 마우스를 꼬리 정맥 주입기에 천천히 그리고 부드럽게 밀어 넣겠습니다.많은 생쥐가 이를 싫어하지만, 실제 주사를 놓을 때 생쥐가 뛰어올라 스스로 다치거나 실험자가 바늘에 찔리는 사고를 방지할 수 있습니다. 따라서 생쥐를 내부로 매우 천천히 고정합니다. 이제 생쥐 꼬리의 측면을 따라 꼬리 정맥을 찾습니다.상단부에는 큰 동맥이 하나 지나갑니다. 그리고 마우스 꼬리의 양측에는 끝부분까지 길게 이어지는 두 개의 정맥이 있습니다.바늘을 잡고 꼬리 아래쪽부터 시작하여 정맥을 찾습니다. 여기 정맥이 보이는군요. 에탄올로 살짝 닦아내면 정맥을 조금 더 명확하게 볼 수 있습니다.이제 미정맥에 주사하겠습니다. 이때 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하도록 유지하는 것이 중요합니다. 즉, 바늘의 열린 끝부분이 위쪽으로 가게 해야 합니다. 그리고 꼬리와 거의 평행하게 이동하며 주사하십시오.정맥이 바로 위에 있기 때문에 각도를 주어 진입해서는 안 됩니다. 바늘을 꼬리 정맥 속으로 매우 천천히 미끄러지듯 삽입하십시오. 경험이 쌓이면 바늘이 들어가는 느낌을 느낄 수 있을 것입니다.하지만 처음 한두 번은 액체를 밀어 넣어 저항이 있는지 확인하고 싶을 것입니다. 저항이 없다면 꼬리 정맥에 진입한 것이므로, 제가 방금 수행한 것처럼 빠르고 쉽게 주사할 수 있습니다. 그 후 바늘을 천천히 뽑아내면 됩니다.정맥에 제대로 진입했음을 확인하는 또 다른 방법은 역류로 인해 혈액이 약간 맺히는 것을 확인하는 것입니다. 주사 부위에서 혈액이 조금 역류한다면 꼬리 정맥에 확실히 진입했음을 확인할 수 있습니다. 주사 후에는 곧 출혈이 멈춰야 합니다.이제 여기 C57BL/6 마우스가 있습니다. 우리는 이 마우스의 서혜부 측면인 여기와 겨드랑이 아래쪽의 액와 림프절이 위치한 여기, 그리고 반대편 여기에서 림프절을 제거할 것입니다. 그런 다음 목 부위의 여기와 저기, 즉 양측에 하나씩 있는 표면 경부 림프절을 제거하겠습니다.안녕하세요. 이제 마우스를 해부할 준비가 되었습니다. 먼저 마우스를 여기 해부판에 핀으로 고정하는 것부터 시작하겠습니다. 마우스를 핀으로 고정하겠습니다. 네.핀 고정이 확실하게 되었는지 확인해야 합니다. 이렇게 해야 말초 림프절을 더 잘 노출시킬 수 있습니다. 따라서 저는 보통 네 발을 모두 핀으로 고정합니다.꼬리는 걱정하지 않아도 됩니다. 어떤 분들은 꼬리도 핀으로 고정하는 것을 선호하시기도 합니다. 그런 다음, 털이 해부 부위로 들어가 림프절이나 기구 여기저기에 묻는 것을 방지하기 위해, 마우스에 70% ethanol을 분무합니다.이제 마우스가 에탄올로 진정되었으므로, 정중선을 따라 절개하겠습니다. 털을 몸에서 멀리 당겨서 절개합니다. 보시는 것처럼 피부를 위로 당겨 작은 텐트 모양으로 만들 수 있습니다.이렇게 하면 이번 사례에서 피해야 할 복막 절개를 방지할 수 있습니다. 이제 여기 위쪽에서 정중선 절개를 시작하겠습니다. 작은 절개를 내어 복막에 닿지 않았는지 확인합니다.그 아래로 복막이 보입니다. 가위를 절개 부위 아래로 밀어 넣어 피부와 복막을 서서히 분리하며, 경부 림프절을 적출해야 하므로 조금씩 절개하며 진행합니다. 주요 혈관을 건드리지 않도록 매우 주의하며 천천히 생쥐의 턱선까지 끝까지 절개하겠습니다.그 다음, 피부 플랩의 하단부에 위치한 서혜 림프절을 채취해야 하므로, 꼬리 기저부까지 이어지는 정중선 절개를 시행하겠습니다. 자, 이렇게 꼬리 쪽까지 정중선 절개를 완료하여 채취 경로를 확보했습니다.이제 피부를 복막에서 분리하겠습니다. 포셉을 사용하여 피부를 복막으로부터 조심스럽게 당겨 분리하며 진행하겠습니다. 그러면 우리가 절제할 첫 번째 림프절이 노출됩니다.여기 아래쪽 피부 플랩에 있는 서혜 림프절입니다. 마우스의 본체에서 피부 플랩을 젖혀냈으므로, 이제 서혜 림프절을 노출시키기 위해 핀으로 고정하겠습니다. 이렇게 하면 서혜 림프절이 더 잘 노출되어 깨끗하게 절제해낼 수 있습니다.여기 핀으로 고정한 후 노출된 서혜 림프절이 있습니다. 이는 일반적으로 여기 다리 바로 위의 피부 플랩에서 발견됩니다. 그리고 그 위로 지나가는 혈관들의 Y자형 분기점을 확인하여 찾을 수 있습니다.자, 여기 있습니다. 약간의 지방 조직에 둘러싸여 있으며 그 위로 혈관들이 지나가고 있습니다. 이제 서혜 림프절을 제거하겠습니다.포셉을 림프절 양측으로 긁어 지방으로부터 분리합니다. 지방이 섞이지 않아야 합니다. 두 광자 이미징(two photon imaging) 시 지방이 있으면 조직의 레이저 투과를 방해하기 때문입니다.보시죠. 림프절의 지방을 모두 제거하는 것과 동시에 림프절의 피질을 온전하게 유지하는 것이 중요합니다. 좋습니다, 다 되었습니다.여기 리엔(lienal) 림프절이 있습니다. 이를 배지에 넣겠습니다. 지방이 모두 제거되었는지 확인하는 좋은 방법은 림프절이 가라앉는지 보는 것입니다. 배지에 넣었을 때 바닥까지 바로 가라앉으면 지방이 모두 제거된 것입니다.지방이 있다면 위로 뜰 것입니다. 이제 보조 림프절을 제거하겠습니다. 이 림프절은 쥐의 겨드랑이 쪽, 주요 혈관 바로 옆에 위치해 있습니다.때로는 출혈이 심해 림프절이 잘 보이지 않을 수 있어 까다로울 수 있습니다. 제가 처리하는 방법을 보여드리겠으며, 이번에는 출혈이 없기를 바랍니다. 우선 피부 플랩을 절개하고, 실제로 제거하려는 림프절 옆의 전완부 부위를 절개합니다.이렇게 하면 손가락을 사용하여 피부를 더 능숙하게 젖힐 수 있으며, 겨드랑이 위로 지나가는 이 근육을 잡고 부드럽게 당기면 액와 림프절이 튀어나오게 됩니다. 지금 바로 찾아보겠습니다. 여기 있네요.주요 혈관을 따라 겨드랑이에 바로 위치해 있습니다. 이제 액와 림프절을 박리하겠습니다. 피부를 다시 핀으로 고정하거나 손가락으로 잡아도 되며, 편하신 방법을 선택하십시오. 다만 저는 신중하게 작업하는 것을 선호합니다.이 림프절 주변에는 지방이 거의 없어 영상 촬영에는 유리하지만, 주요 혈관과 인접해 있어 주의하지 않으면 놓칠 수 있습니다. 따라서 액와 림프절의 경우, 주변 결합 조직을 잡아 혈관으로부터 천천히 분리해 냅니다. 자, 됐습니다.여기에 겨드랑이 림프절이 있습니다. 바로 여기에 위치해 있죠. 길쭉하고 납작한 형태의 림프절입니다.그리고 노드 자체에 손상을 주지 않기 위해 노드 측면에 남아 있는 결합 조직을 약간 잡고 있습니다. 림프 노드의 수분을 유지하기 위해 이미징을 진행할 것입니다. 기관 내 이미징을 수행하기 전에, 서혜부, 액와 및 경부 림프 노드를 각각 추적할 수 있도록 개별 챔버의 CO2 독립 배지에 배치합니다.림프절 전처리가 잘 되었는지 확인하는 방법은 절제 후 바닥으로 가라앉는지 보는 것입니다. 이는 림프절 내에 지방이 거의 없음을 의미합니다. 이제 표층 경부 림프절인 경부 림프절을 제거하겠습니다.그리고 저는 겨드랑이 림프절을 제거했을 때의 상태에서 다시 핀으로 고정하여 경부 조직이 좀 더 잘 드러나게 함으로써 이 과정을 시작합니다. 경부 림프절은 생쥐의 턱 근육 근처, 정확히는 측면을 따라 위치해 있습니다.이것들은 여러분이 아플 때 느낄 수 있는 바로 그 림프절입니다. 감기에 걸렸을 때 의사가 확인하기 위해 만져보는 바로 그 부위입니다. 저는 보통 이 작업을 수행할 때, 포셉으로 측면을 훑으면서 조직 아래에 손가락을 넣어 조직을 앞으로 살짝 당겨주는 방식을 선호합니다.튀어나온 림프절이 있어야 합니다. 아, 여기 있네요. 조직 위쪽에 있습니다.여기 있습니다. 표재 경부 림프절이 보입니다. 타액선을 함께 제거하지 않도록 주의해야 합니다.타액선에서는 T세포를 찾을 수 없습니다. 반면, 이 특정 림프절에는 CFSE로 표지된 CD4 양성 T세포가 포함되어 있습니다. 이제 조직 내에서 이러한 T세포가 이동하는 모습을 담은 in situ 영상을 보여드리겠습니다.이제 림프절을 파손되지 않는 플라스틱 커버슬립에 접착하여 인시튜(insitu) 이미징 스테이지 바닥에 고정하겠습니다. 이렇게 하면 T-세포를 이미징하는 동안 조직이 움직이거나 밀려나는 현상을 방지할 수 있습니다. 여기 파손되지 않는 플라스틱 커버슬립이 준비되어 있습니다.가장 먼저 할 일은 림프절에 맞는 적절한 크기로 하나를 자르는 것입니다. 가위를 사용하여 여기에 작은 정사각형 모양으로 자릅니다. 이제 여기에 접착제를 바르겠습니다.소량의 접착제입니다. 절단한 슬라이드 조각 주변에 펴 바릅니다. 그런 다음 킴와이프스(kim wipe)를 사용하여 접착제의 일부를 닦아냅니다.이것은 림프절을 덮어줄 접착제입니다. 영상 촬영을 방해하지 않도록 매우 얇게 도포해야 합니다. 이제 용액에서 림프절을 꺼내겠습니다.이제 배지에서 첫 번째 림프절을 꺼내는 것으로 시작하겠습니다. 이 과정에서 주의를 기울여야 합니다. 림프절의 피질이 손상되지 않도록 해야 합니다.임파선 조직의 모서리 부분만 잡고, 먼저 모서리 부분을 슬라이드에 살짝 접촉시킨 다음 임파선을 슬라이드 방향으로 당겨 고정함으로써 슬라이드에 접착시키겠습니다. 이때 임파선 가장자리에 남아 있던 아주 적은 양의 지방 성분을 이용하였습니다. 따라서 임파선의 피질 부위는 손상시키지 않고 작업하고 있습니다.그런 다음 림프절을 꺼내어, 접착제를 경화시키기 위해 림프절을 꺼냈던 동일한 웰에 담급니다. 림프절을 뒤집어 접착제가 포함된 배지에 부드럽게 담급니다. 경화된 exo glue를 약간 제거합니다.완료되었습니다. 이제 이광자 이미징을 위한 림프절 준비가 끝났습니다. 이것이 바로 in situ 이광자 이미징을 위해 림프절을 준비하는 방법입니다.이제 현미경으로 옮겨 설정을 마친 후, 입양 전이시킨 T 세포의 고해상도 이미지를 촬영해 보겠습니다. 여기 서혜부 림프절 내부에서 이동하고 있는 CFSE 표지 T 세포들이 보입니다. 이 영상은 약 500배 배속된 상태이며, 세포들이 매우 활발하게 움직이는 것을 확인할 수 있습니다.20 x 수침 대물렌즈를 사용하여 약 20 x 배율로 확대했습니다. 이는 T세포의 이동만을 보여주는 예시입니다. 주변 세포들을 염색하는 과정은 수행하지 않았습니다.일반적으로 더 발전된 2광자 실험에서는 염색된 수지상 세포, 염색된 B 세포 및 T 세포가 염색된 NK 세포와 상호작용하는 모습을 관찰할 수 있습니다. 림프절 내부에서 볼 수 있을 것으로 예상되는 거의 모든 세포 유형을 라벨링하여 이미징할 수 있습니다. 이것으로 저희 연구소의 림프절 이미징 프로토콜을 마치겠습니다.

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로...

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

이 비디오는 쥐의 뒷다리에서 슬와골 배출 림프절을 채취하는 해부 기술을 보여줍니다. 림프절은 선천성 면역과 적응 면역을 연결하는 데 중요한 역할을 하며, 보존된 조직 구조와 세포 생존력을 가진 온전한 림프절을 채취하면 국소 및 전신 면역 반응을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

생체 외 이미징을 위해 쥐 슬와골 배출 림프절을 채취하는 해부 방법

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

프로토콜은 뇌척수액(CSF) 및 척추 경막수액을 수집하는 림프관 및 림프절(LNs)의 3차원 및 세포 분해성 이미지를 얻기 위해 조직 클리어링과 가벼운 시트 형광 현미경 검사법(LSFM)을 결합하여 제시된다.

iDISCO+ 및 라이트 시트 형광 현미경 검사를 사용하여 척추 림프관 및 배수의 3 차원 이미징

이 논문은 경추 림프관과 림프류의 수축성을 생 체 내에서 연구하는 혁신적인 방법을 제시하며, 경추 림프관(cLV)의 다양한 생리적 기능을 시험하고, 뇌 배출 및 정리의 림프 조절 메커니즘 조절을 위한 치료 전략을 연구합니다.

생체 내 생 체 내 자궁경부 림프관 수축성과 생쥐 림프관 수축성 및 림프 흐름 영상을 재현 가능한 장비

여기서는 여러 신경학적 질환에서 중요한 역할을 하는 마우스 수막 림프관(MLVs)을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 추적자 배수의 기능적 평가와 등쪽 MLVs 네트워크의 상세한 형태학적 특성화를 모두 가능하게 하는 통합 방법을 제공하는 것입니다.

수막 림프관 평가를 위한 통합 프로토콜: 흉부 주사, 림프절 영상, 수막 박리, 전면 착색

학습하세요 마우스 주변 림프절 해부 및 2광자 이미징 기법을 통해 CD4+ T 세포 이동성을 관찰하는 방법을. 형광 표지된 T 세포의 수용체 전이와 림프절 분리 과정을 포함하며 면역 반응 연구에 활용됩니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

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