Name: 레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 UV 레이저를 이용한 케이지드 플루오레신 언케이징으로 제브라피시 배아의 특정 세포 계통을 라벨링하는 방법입니다. 면역형광 현미경으로 세포 운명을 추적하여 발생 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 갇힌 플루오레신 만들기에 대한 도움을 댄 칼린 감사하고 싶습니다. 또한 우리는 다음과 자금 출처 감사의 말씀을 전합니다 : JAC에 발달 생물학 교육 그랜트를 위해 밴더빌트 대학 메디컬 스쿨 프로그램을, 그리고 NIH HD054534to JTG.

1. 갇힌 플루오레신 Dextran의 합성 <ol><li> 3.5 밖으로 측정 - aminodextran 4 MG과 CMNB - 갇힌 플루오레신 SE 1 MG를 포함 Invitrogen - 공급 적용된 튜브에 추가합니다. 우리 손에이 비율은 dextran 당 ~ 2.5 염료 분자의 평균 로딩을 제공합니다. </li><li> 튜브에 0.1 M 나 2 B 4 O 7 (나트륨 borate) 버퍼 500 μL를 추가합니다. </li><li> aminodextran와 갇힌 플루오레신를 해산하기 위해 30 초 동안 모자 와동. </li><li> vortexing 믹서에서 하룻밤 반응하자. </li><li> Zeba의 스핀 칼럼의 맨 아래에 폐쇄를 트위스트 후 뚜껑을 느슨하게. 느낌 - 팁 펜으로 열에서 점이 표시합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 넣어 칼럼. </li><li> 회전자의 중심을 향하게 점 2 분 1,000 XG에 원심 분리기. 바로 압축 후 열을 사용합니다. </li><li> 새로운 15 ML 원뿔 튜브 압축 열의를 배치합니다. </li><li> 풀 반응 혼합물과 압축 열 수지 침대 센터로 전송할 수 있습니다. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 회전자의 중심을 향하게 점 2 분 1,000 XG에 원심 분리기. 스핀 후 eluent과 칼럼의 맨 위에는 약 색상 노란색 같은 그늘 것입니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 노란색 eluent (~ 350 μL)를 전송합니다. </li><li> speedvac에서 건조하는 Lyophilize. 호일로 speedvac 표지. </li><li> 1% W / V.의 최종 농도로 물에 옅은 노란색 거품의 다시 중단 결과 ~ 2-3 MG </li><li> 호일 덮인 튜브에서 -20 ° C에서이 솔루션을 저장합니다. 그것은 나누어지는을 반복 냉동 해동을 방지하기 위해 dextran 솔루션 것이 좋습니다. </li></ol> 2. Zebrafish의 태아으로 갇힌 플루오레신 Dextran의 분사 <ol><li> 0.2M KCl에 갇힌 플루오레신 dextran 1시 5분 또는 1시 10분의 1 % W / V 주식을 희석. </li><li> 0.5을 주사 - 압력 주입기를 사용하여 세포 하나의 단계 배아의 노른자에 갇힌 플루오레신 솔루션 1.0nL. 일단 주입, 배아의 클러치는 ° C가 아닌 특정 uncaging을 줄이기 위해 28.5의 어둠 속에 보관해야합니다. </li><li> 수동으로 배아에서 chorions를 제거합니다. </li><li> 4퍼센트 tricaine에서 배아를 마취. </li><li> 배아는 다음 달걀 물로 덮여, 35mmx10mm 배양 접시에있는 0.8 % 아가로 오스에 마운트됩니다. </li><li> 적어도 15 분 동안 50 ° C 열 블록에 녹아 아가로 오스를 평형. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 물을 최소한 한 배아를 그리기와 아가로 오스 참고로 그것을 릴리스 :. 그것은 피하기 위해 튜브로 배아를 퍼팅하기 전에 약 30 초 동안 손에 아가로 오스의 튜브를 냉각하는 것이 중요합니다 배아를 죽이는. </li><li> 약 50μL 아가로 오스의와 함께, 튜브의 배아를 피펫하고 페트리 접시의 중앙에 내용을 꺼냅니다. </li><li> 신속 동양 최대 직면 uncaged하는 세포와 플라스틱 스레드를 사용하여 배아를 참고. 시원한 신속 때문에 배아를 orienting와 서두르지와 아가로 오스. 아가로 오스는 단단한 된 후 조작하면 태아도 손상될 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 고체화 (이 몇 분 소요) 및 4% tricaine와 0.003 %의 PTU를 포함하는 계란 물을 전체 요리 삼분의이을 채울 수 있습니다. </li></ol> 3. 플루오레신 Dextran의 레이저 Uncaging <ol><li> uncaging에 사용되는 현미경 40X 물 침지 목적을 가지고 있어야합니다. </li><li> 우리는 365 나노미터 색소 세포와 70 % / 30 % 분할 이색성 거울 Photonics 인스 트루먼 트의 레이저를 사용합니다. </li><li> 이전 uncaging로, 레이저는 객관적이고 적절한 능력을 감쇠와 parfocal하셔야합니다. </li><li> 레이저 초점을하려면 목표 아래 미러 유리 슬라이드를 삽입하고 슬라이드에 흠집을 볼 때까지 목표를 중점을두고 있습니다. </li><li> 레이저가 단일 펄스와 함께 거울을 명확하게 눈에 띄는 흠집을 생산 수있을 때까지 레이저 감쇠기를 조정합니다. </li><li> 목표의 초점을 조정합니다 아래. 목적 초점 밖으로 때 레이저 흠집을 생산할 수있다면, 레이저 초점을 조정 ¼ 아래 켜거나. 레이저는 목적이 초점을 맞춘 경우에만 거울을 흠집 수있을 때까지 반복합니다. </li><li> 장소 uncaged하는 지역의 목적과 집중에 따라 배아를 탑재. </li><li> 새장에서 내놓다하려면, 관심의 세포에 초점을 후 2-3 Hz에서에서 그것을 10-20 번 펄스. </li><li> 포셉와 멀리 아가로 오스를 필링 계란 물에 퍼팅 0.003 %의 PTU를 포함하여 uncaging 후, 무료로 배아. 그들은 고정 때까지 배아가 빛을 꽉 상자에서 개발하자. </li></ol> 4. 항체 라벨링 및 Uncaged 플루오레신 Dextran의 감지 <ol><li> AB 정착액의 배아 수정 4 실온 (RT) 또는 야간 (O / N)에서 2-4시간 ° C.에 대한 (4 % paraformaldehyde, 0.3mM CaCl 2, 8 % 자당을 1X 인산은 살린, 산도 7.3를 버퍼) 모든 라벨 단계에 대한 가벼운 꽉 상자나 포일 싼 튜브의 배아 보관하십시오. </li><li> 정착액을 제거하고 100 % MeOH로 교체, RT에서 10 분 정도두고, MeOH와 repla를 제거신선한 100 % MeOH로 CE. </li><li> 적어도 30 분 -20 ° C에서 MeOH에 보관주의 :. epitopes가 저하하기 시작하기 전에 당신이 최대 두 주 동안 MeOH에 저장할 수 있습니다. </li><li> 75% MeOH/1X 인산의 RT에서 오분 세척과 배아를 Rehydrate은 0.1 % 트윈 20 (1X PBSTw)와 생리 버퍼 후 50% MeOH/50 %의 1XPBTw 다음 25% MeOH/75 % 1X PBSTw. </li><li> 1XPBSTw 5 분 세 번 씻으십시오. </li><li> 배아는&gt; 24 시간 전거있다면, 10 μg / 1XPBSTw에 ML proteinase K와 배아를 permiabilize. Permiabilization 시간은 무대에 따라 달라집니다. 배아는 24 48시간 후 수정 (HPF) 사이하는 경우 proteinase K에 5 분 정도면 충분합니다. 더 많은 시간이 오래된 애벌레에 대한 경우 필요할 수 있습니다. RT 20 분 AB 정착액에 다시 수정 </li><li> RT에서 1XPBSTw 5 분 다섯 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 1-2시간에 대한 (1XPBS, 0.1 %의 트리톤 x100 10 % 양 혈청 10 % 소 혈청 횐자위, 1 % 디메틸 sulfoxide) 블록 솔루션에 품어. </li><li> 솔루션을 차단의 기본 항체 (안티 플루오레신 플러스 셀 타입의 특정 마커에 대한 항체)를 희석. </li><li> 4 품어 배아 O / N ° 일차 항체를 포함하는 솔루션에 C. </li><li> 1XPhosphate에 20 분 네 번 씻으면 RT에서 0.1 %의 트리톤 x100 (PBSTx)와 살린 버퍼. </li><li> 솔루션을 차단에 찬란 - 레이블 차 항체 (대개 1:300) 희석. </li><li> 4 품어 O / N ° 보조 항체를 포함하는 솔루션에 C. </li><li> RT에서 1XPBSTx에 20 분 네 번 씻으십시오. </li><li> RT에 적어도 두 시간 50 % glycerol/50 %의 1XPBS에 맑은 배아는 다음 글리세롤 / PBS 혼합물을 제거하고 100 % 글리세롤을 추가하고 4 O / N 서하자 ° C.를 </li></ol> 5. 대표 결과 : immunolabeling 후 (Figure.1) uncaged 있던 세포에 얼룩의 풍부한 공간이 있어야합니다. 그것은 플루오레신의 자연 uncaging로 인해&gt; 48시간 이전 zebrafish에서 잡음 비율로 비교적 높은 신호를 볼 수 드문되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. zebrafish 뇌의 복합 리니지 라벨. 24 HPF, foxd3로 표시 앞쪽에 뇌의 anlage의 일부, :. GFP 표현이, UV 레이저 펄스를 사용하여 uncaged했습니다)이 48hpf함으로써, 세포의 왼쪽 단면 클러스터 parapineal라고 불리는 (빨간색 동그라미) uncaged에서 등장했습니다 도메인 (화이트 서클). B)는 Uncaged 플루오레신 신호 parapineal (빨간색 동그라미의 강화)과 뇌의 기관 (흰색 동그라미).입니다

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
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<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

설명한 바와 같이,이 프로토콜은 microinjection, 현미경, 그리고 immunofluorescence의 일반적으로 사용되는 기법을 기반 zebrafish에서 상대적으로 빠른 가계 라벨 방법을 제공합니다. 우리는 레이저화된 방식으로 플루오레신을 개방하다 가장 효율적이고 비용 효과적인 방법으로 uncaging 것으로 나타났습니다. 이 방법은 4 DPF 늦게 같은 실험 끝점과 혈통의 라벨을 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포가 분열로 세포 당 갇힌 - 플루오레신 농도 결국 감지 수준 이상 줄어 듭니다. 또한, zebrafish의 애벌레 11 플루오레신의 자발적인 아닌 특정 uncaging보고 있었다. uncaged 플루오레신 이러한, 검출은 대부분 초기 애벌레 단계에 효과 (48-72 HPF) 또는 이전 버전이기 때문입니다. 우리 선호 uncaging 방법은 펄스 질소 레이저를 사용하는 것입니다. 이들은 일반적으로 세포 ablations 실험에 사용되며...

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A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-caged fluorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextran, 10kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 탈염 스핀 컬럼</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-fluorescein 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>35mmx10mm 페트리 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>40x 수침 렌즈가 장착된 정립 복합 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint 수동 레이저 조사 시스템</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 실</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>압력 주입기</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

레이저 uncagable 플루오레신 dextran과 zebrafish 세포의 리니지 라벨

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

발달 생물학의 중심 문제는 그들이 undifferentiated 엽 성의 전구 물질로부터 발생하는 등 척추 동물에있는 무수한 세포 유형의 출처를 알아낼 것입니다. 연구원은 DiI 상표 1 및 모델 시스템의 개발의 나중 단계에서 확인할 세포 운명을 추적 효소의 압력 주입이 같은 혈통 라벨의 다양한 방법을 고용했습니다. zebrafish (Danio rerio)의 첫 번째 운명의지도는 배아의 이산 지역에서 하나의 세포로 같은 rhodamine dextran과 같은 형광 염료의 주입에 의해 iontophoretic 조립 시간 동안 3-5 라벨 세포의 운명을 추적했다. 효과적인 반면,이 방법은 기술적으로 요구하고 일반적으로 zebrafish 실험실에서 찾을 수 없습니다 전문 장비가 필요합니다. 최근, 이러한 자외선에 노출되면 irreversibly 빨간색 형광 초록색에서 전환 에오스와 가에데로 photoconvertable 형광 단백질은, zebrafish 6-8 증가 사용을 볼 수 있습니다. zebrafish 배아와 transgenesis의 상대적 용이성의 광학 선명도는 혈통의 라벨에 대해 이러한 특히 매력적인 도구를 만들었습니다 그리고 생체내 7 세포의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 그들의 유틸리티에도 불구하고,이 단백질은 염료 중재 혈통의 라벨 방법 몇 가지 단점을 비교합니다. 가장 중요한 우리는 이러한 단백질 photoconversion 동안 높은 3 - D 해상도를 얻기에서 발견 어려움이다. 이 빛 가운데, 아마도 zebrafish의 혈통 라벨에 대해 해상도와 사용 용이성에있어 최고의 조합 갇힌 플루오레신 dextran의 사용, 칭 그룹에 바인딩된 형광 염료를 만드는 마스크는 형광 9. 염료 다음은 형광 또는 면역의 시각화를 허용, 레이저 또는 수은 램프에서 자외선을 사용하여 특정 셀 내의 (담금질 그룹에서 발표) &quot;uncaged&quot;가 될 수 있습니다. iontophoretic 방법과는 달리, 우리에 갇힌 플루오레신은 표준 사출 apparatuses로 주입 수 있으며 핀홀 10 갖춘 epifluorescence 현미경으로 uncaged. 또한, 플루오레신에 대한 항체는 uncaged 양식을 감지하고, 에피토프는 고정 잘 남아 11. 마지막으로, 우리에 갇힌 플루오레신는 두 개의 광자 현미경은 12,13 고용 특히 경우, 매우 높은 3 - D 해상도 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 갇힌 플루오레신 및 레이저 uncaging에 의해 혈통 라벨의 방법을 설명합니다. Subsequenctly, uncaged 플루오레신는 항체로 분류하여 같은 GFP와 같은 다른 epitopes와 동시에 검색됩니다.

이 프로토콜은 uncaged 플루오레신에서 신호를 증폭하기 위해 immunolabeling 전체 산 뒤에 갇힌 플루오레신의 UV - uncaging를 사용하여 셀 zebrafish의 배아의 작은 그룹의 운명을 라벨 및 추적하는 방법을 delineates.

레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

발생 생물학의 핵심 과제는 분화되지 않은 상태에서 유래하여 척추동물에 존재하는 무수히 많은 세포 유형의 기원을 추론하는 것입니다...

이 실험 과정의 전체적인 목표는 제브라피쉬 배아 내 세포의 계보를 라벨링하는 것입니다. 이는 먼저 케이지드 플루오레세인(caged fluorescein)을 합성하여 제브라피쉬 배아에 주입함으로써 수행됩니다. 그 후, 라벨링할 세포에 접근할 수 있도록 배아를 아가로스에 고정합니다.다음으로, UV 레이저를 사용하여 배아의 선택된 세포 내에 있는 케이지드 플루오레세인(caged fluorescein)을 활성화합니다. 마지막으로, 배아가 원하는 단계까지 발달한 후 수확하여 표지된 세포를 특정 계통의 마커와 비교하여 검출합니다. 결과적으로, 광해제(photo uncaging)와 면역형광 현미경법을 통해 배아 내 선택된 세포의 운명을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.Cade의 광전환(photo conversion)과 같은 기존 기술에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 다색 면역형광법을 통해 다른 세포 결합 특이적 항체뿐만 아니라 언케이지드(uncaged) 플루오레세인까지 검출할 수 있다는 점입니다. 제브라피쉬 배아에 케이지드(caged) 플루오레세인 덱스트란을 주입하려면, 먼저 이를 합성하고 1% w/v 농도로 준비하십시오. 동봉된 서면 프로토콜에 따라 스톡 알리콧(stock aliquots)을 준비하십시오.다음으로, 0.2 M 염화칼륨(potassium chloride)으로 희석액을 1:5 또는 1:10 비율로 분주합니다. 그다음, 0.5~1 nL의 케이지드 플루오레세인(caged fluorescein) 용액을 1세포기 배아의 난황에 주입합니다. 압력 주입기를 사용하여 주입한 후, 원하는 발달 단계에서 비특이적 언케이지닝(uncaging)을 줄이기 위해 배아 무리를 28.5 °C의 암소에 보관해야 합니다.배아에서 초운(choon)을 수동으로 제거하고, 4% tricaine으로 배아를 마취하여 안정한 상태로 만듭니다. 50 °C 가열 블록에서 0.8% 녹인 agarose를 최소 15분 동안 평형 상태로 둡니다. 그런 다음 튜브를 손에 쥐고 약 30초 동안 식힙니다. 유리 피펫을 사용하여 배아를 옮기기 전에, 최소한의 물과 함께 배아 한 마리를 빨아들인 후 agarose에 넣습니다. 튜브에서 배아와 함께 약 50 µL의 agarose를 피펫으로 취해 35 mm x 10 mm 페트리 접시 중앙에 분주합니다.플라스틱 실을 사용하여, 언케이지(uncaged)할 세포가 위를 향하도록 배아의 방향을 빠르게 잡습니다. 아가로스(agarose)가 완전히 응고되어 디쉬를 채울 때까지 기다립니다. 4% trica와 0.003% PTU가 포함된 난자수로 2/3 정도 채운 후, 언케이지 공정을 시작할 때까지 배아를 빛이 차단된 상자에 보관하십시오.fluorescein dextran의 레이저 언케이지ング(uncaging)을 수행하려면 40 x 수침 대물렌즈가 장착된 복합 현미경을 사용하십시오. 언케이지ング 이전에 365 nanometer 염료 셀과 70%30% 분할 다이크로익 미러(dichroic mirror)가 포함된 photonics instruments 레이저를 사용합니다. 레이저는 대물렌즈와 동초점이 되어야 하며, 레이저를 집중시키기 위해 적절한 출력으로 감쇄시켜야 합니다.대물렌즈 아래에 거울 유리 슬라이드를 놓고, 슬라이드의 긁힘이 보일 때까지 대물렌즈의 초점을 맞춥니다. 단일 펄스로 거울에 뚜렷하게 보이는 긁힘이 생길 때까지 레이저 감쇠기를 조정하고, 대물렌즈의 초점을 위아래로 조정합니다. 대물렌즈의 초점이 맞지 않은 상태에서도 레이저로 긁힘을 만들 수 있다면, 레이저 초점을 1/4만큼 조정하십시오.다이얼을 올려 또는 내리십시오. 레이저가 거울을 긁을 수 있을 때까지 반복합니다. 대물렌즈의 초점이 맞았을 때만, 장착된 배아를 대물렌즈 아래에 놓고 언케이지ング할 영역에 초점을 맞추어 언케이지ング을 수행하십시오.관심 세포에 초점을 맞추고 2~3 Hz의 빈도로 10~20회 펄스를 가합니다. 언케이지징(uncaging) 후, 포셉으로 에어로젤을 벗겨내어 배아를 분리하고 0.003% PTU가 함유된 난자 용수(egg water)에 넣습니다. 배아를 항체 고정액에 넣고 상온에서 2~4시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 고정합니다.고정액을 제거하고 100% methanol로 교체합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 methanol을 제거하고 새로운 100% methanol로 교체합니다.배아를 -20°C의 메탄올에 최소 30분 동안 보관하십시오. 에피토프가 분해되기 시작하기 전까지 최대 2주 동안 메탄올에 보관할 수 있습니다. 실온에서 75% 메탄올 및 0.1% tween 20이 포함된 25% 1x phosphate buffered saline, 50% 메탄올 및 50% 1x PBS tween 20, 그리고 25% 메탄올 및 75% 1x PBS tween 20으로 각각 5분씩 세척하여 배아를 재수화한 후, 1x PBS tween 20으로 5분씩 3회 세척하십시오.배아의 연령이 24시간 이상인 경우, 10 µg/mL Proteinase K가 포함된 XPBS tween 20으로 투과화합니다. 투과화 시간은 배아의 단계에 따라 다르며, Proteinase K 처리 5분이면 충분합니다.배아가 수정 후 24~48시간 사이인 경우, 더 오래된 유충에게는 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 항체 고정액으로 실온에서 20분 동안 다시 고정합니다. 실온에서 1 XPBS tween 20으로 배아를 5분씩 5회 세척합니다.그 다음, 실온에서 1~2시간 동안 블로킹 용액에 배양합니다. 1차 항체를 블로킹 용액으로 희석합니다. 그 후, 1차 항체가 포함된 용액에서 배아를 4°C로 하룻밤 동안 배양하고, 다음 날 아침 배아를 1 XPBS tritton X 100으로 4회 세척합니다. 형광 표지 2차 항체를 블로킹 용액으로 희석합니다.2차 항체가 포함된 용액에서 배아를 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 1X PBS Triton X 100으로 4회 세척한 후, 50% glycerol 50% 1X PBS에서 실온으로 최소 2시간 동안 배아를 투명화합니다. 그 후 glycerol PBS 혼합액을 제거하고 100% glycerol을 첨가하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.대조군과 광해방(photo uncaged) 유충의 결과가 공초점 투영(confocal projections) 형태로 제시되어 있습니다. 대조군 배아에는 케이지드 플루오레세인(caged fluorescein)을 주입하였으나, 수정 후 48시간에 광해방 처리를 하지 않았습니다. 대조군 배아의 송과선 복합체에서 GFP 표지가 관찰됩니다.일부 점상의 배경 표지가 나타나지만, 표지된 fluorescein의 국소적인 축적은 검출되지 않습니다. 광해제(Photo uncaged) 배아에서는 GFP 표지 세포 중 일부에서 해제된 fluorescein의 뚜렷한 축적이 관찰됩니다. 이들은 24시간 전 광해제 공정을 통해 표적화된 세포의 후손들입니다(약간의 수정 거침).이 절차는 수정 후 48시간 이전의 제브라피시 배아에서 거의 모든 조직의 계보 표지를 하는 데 사용될 수 있습니다.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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FSL은 구조 : 생물 학적 마커의 범위와 셀 / Virion 표면을 수정하기위한 간단한 방법을 자신의 생존에 영향을주지 않고

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

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기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

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제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

학습하세요 UV 레이저를 이용한 케이지드 플루오레신 언케이징으로 제브라피시 배아의 특정 세포 계통을 라벨링하는 방법입니다. 면역형광 현미경으로 세포 운명을 추적하여 발생 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

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