공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

다음 실험의 전반적인 목표는 항원 제시 세포가 CD 28 수용체를 통해 T 세포를 공동 자극하는 것을 차단하는 항체 존재 하에, 수혜자의 동종 항원으로 ex vivo 자극을 주어 수혜자 동종 특이적 공여자 T 세포를 활성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두 명의 서로 다른 건강한 공여자로부터 PBMC를 분리합니다. 그다음, CD 28 자극을 차단하기 위해 B 7.1 및 B 7.2 리간드에 대한 단클론 항체를 처리한 상태에서 HLA가 불일치하는 PBMC 집단들을 배양함으로써 대량 동종 활성화 공동 배양을 설정합니다.

그 다음, 동종 활성화(allo energization)의 효능을 1차 및 2차 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reactions, MLR)으로 측정합니다. 마지막으로, 제3자 및 CMV 특이적 반응을 결정하여 동종 활성화의 동종 특이성을 측정합니다. 그 결과, 공여자 T 세포가 이후의 동종 항원 자극에 대해 저반응성(hypo responsive) 상태가 되지만, 동종 비반응성 공여자 T 세포는 손상되지 않고 기능이 유지됨을 확인할 수 있습니다.

우리는 HLA 불일치 조혈모세포 이식 중 및 이식 후 동종 활성화 공여자 T 세포를 주입하는 이전 및 현재 진행 중인 파일럿 임상 시험에 이 전략을 성공적으로 적용하였으며, 조작되지 않은 HLA 불일치 이식 수혜자의 과거 대조군과 비교하여 면역 재구성이 개선되고 감염 횟수가 줄어들며 급성 및 만성 이식편대숙주병의 중증도가 낮아지는 것을 관찰하였습니다. 동종 아노다이제이션 전략의 주요 장점은 이 기술이 병원체 특이적 또는 종양 관련 항원 특이적 T 세포 반응을 감소시키지 않고 공여자 T 세포 풀에서 CD4 조절 T 세포를 제거하지 않으므로 오프타겟 효과가 최소화된다는 점입니다. 이 절차를 시연할 분은 저희 실험실의 스태프 사이언티스트인 Christine Vin입니다. 첫 번째 단계는 건강한 자원자 공여자 두 명으로부터 혈액을 채취하는 것입니다.

한 공여자의 세포는 반응 세포로, 다른 공여자의 세포는 자극 세포로 사용합니다. 다음으로, fial pac을 이용한 밀도 구배 원심분리를 통해 혈액에서 PBMC를 분리합니다. trian blue로 소량의 세포를 염색하고, hemo cytometer reus를 사용하여 생존 PBMC 수를 측정합니다.

각 공여자의 PBMC를 10 mL의 완전 배양 배지에 1 mL당 100만 개의 생존 세포 농도로 분주하여 별도의 15 mL 원뿔형 튜브에 담습니다. 벌크 동종 활성화 공배양(bulk allo energizing co-culture)을 설정하기 위해, 공여자의 PBMC 튜브 하나는 자극 세포(stimulators)로, 다른 하나는 반응 세포(responders)로 지정합니다.

지정된 stimulator 15 milliliter 튜브에 anti B 7.1 및 anti B 7.2 항체 100 micrograms를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어준 후 30분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 stimulator PBMC를 조사하고, 이를 가스 투과성 캡이 있는 T 25 50 cubic centimeter 세포 배양 플라스크에 넣습니다.

플라스크에 bulk allo coal 배양액이라고 표시합니다. 다음으로, 다른 공여자로부터 얻은 responder PBMC 10 milliliters(1 million/milliliter, 완전 배지 기준)를 플라스크에 추가합니다. 여기에 antib 7.1 및 Antib 7.2 항체를 각각 100 micrograms씩 더 추가하고 가볍게 혼합한 뒤, 플라스크를 세운 상태로 인큐베이터에 넣고 72시간 동안 배양합니다.

다음으로, 차단 항체를 사용하지 않는 벌크 대조군 공배양을 위해 자극제 PBMC 1,000만 개를 추가로 조사한 후, 이를 T 25 50 cubic centimeter 세포 배양 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 bulk control coal culture라고 표시합니다. 벌크 동종 활성화 공배양에 사용한 것과 동일한 반응자 PBMC 10 milliliters(최종 농도 1 million per milliliter, 완전 배지 함유)를 플라스크에 첨가하고 가볍게 섞은 후, 플라스크를 세워 인큐베이터에 72시간 동안 보관합니다.

다음 단계는 대량 공동 배양과 동일한 날에 동종 활성화 공여자 T세포 풀의 기능을 측정하는 것입니다. 측정할 세 가지 시점 각각에 대해 96-웰 플레이트 바닥에 1 U를 라벨링하여 primary MLR을 준비하십시오. 그런 다음, 대량 대조군 및 동종 활성화 공동 배양액 각각에서 5 mL를 15 mL 튜브에 따르십시오.

다음으로, 각 튜브의 세포 현탁액 200 µL를 세 개의 플레이트 각각에 있는 3중 well에 분주합니다. 벌크 대조군 저온 배양 세포가 들어있는 well에는 '공자극 차단 없음' 또는 'no CSB'라고 표시하고, 벌크 동종 활성화 저온 배양 세포가 들어있는 well에는 'CSB'라고 표시합니다. 그다음, 음성 대조군으로서 각 플레이트의 6개 well에 완전 배지 200 µL를 추가합니다.

마지막으로, 증발을 줄이기 위해 모든 빈 웰에 PBS 200 µL를 추가하고, 대량 공동 배양 설정을 마친 후 72시간 동안 플레이트를 인큐베이터에 보관합니다. 측정할 세 가지 시점 각각에 대해 UBO 96-웰 플레이트 하나씩을 'secondary MLR'로 라벨링합니다. secondary MLR을 위한 반응 세포를 준비하려면, 대조군 및 allo energizing 공동 배양액 각각에서 5 mL를 15 mL 튜브로 옮긴 후, 실온에서 2000 RPM으로 5~10분 동안 원심 분리합니다. 그다음 상청액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 펠릿을 풀어준 뒤, 각 튜브에 완전 배지 10 mL를 추가하여 세포를 두 번 더 세척하고, 두 번째 세척 후 다시 세포를 원심 분리합니다.

완전 배지 1 mL에 세포를 재현탁합니다. 트라이판 블루(trypan blue) 염색을 통해 생존 세포 수를 측정하고, 세포 농도를 mL당 100만 개의 생존 반응 세포로 조정합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 3중 웰(triplicate wells)에 피펫팅합니다.

이 웰들을 first party 또는 FP alloy stimulation으로 라벨링하십시오. 그런 다음 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 다른 3개 웰에 피펫팅하고, 이 웰들을 allo를 위한 first party stimulator PBMC를 공급하는 데 사용된 동일한 공여자의 CD 3/28 stimulation PBMC로 라벨링하십시오. secondary MLR의 stimulator 세포로는 Energized 및 control co cultures가 사용됩니다. first party 공여자의 PBMC 10 million을 1 million/mL 농도로 현탁하고 방사선을 조사하여 추가하십시오.

각 2차 MLR 플레이트의 fp allo restimulation으로 표시된 웰에 조사된 자극 세포 100 µL를 첨가합니다. 양성 대조군의 경우, 각 2차 MLR 플레이트의 CD 3 28 stimulation으로 표시된 웰에 CD3 및 CD28 단클론 항체를 각각 1 µL씩 첨가하고 완전 배지 98 µL를 추가합니다. 또한, 음성 대조군으로 사용하기 위해 각 플레이트의 빈 웰 6개에 완전 배지 200 µL를 첨가하고, 증발을 줄이기 위해 모든 나머지 빈 웰에 PBS 200 µL를 첨가합니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 다음 단계는 새로운 건강한 기증자인 제3자 기증자로부터 분리한 allo PBMC의 특이성을 측정하는 것이며, 이를 2차 MLR에서 allo 과정의 특이성을 테스트하는 데 사용합니다. 제3자 PBMC를 mL당 100만 개의 세포 농도로 부유시키고 조사하여, 3개의 96웰 플레이트에 2차 MLR 특이성 실험을 위해 3일, 5일, 7일 차로 라벨링합니다.

특이성을 측정하기 위한 2차 MLR에 대비하여 반응 세포를 준비하려면, 벌크 대조군 및 동종 활성화 공동 배양액에서 각각 5 mL를 15 mL 튜브로 옮기고 2000 RPM에서 5~10분 동안 원심 분리합니다. 그다음 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 펠릿을 풀어준 뒤, 각 튜브에 완전 배지 10 mL를 추가하고 다시 원심 분리하는 과정을 통해 세포를 두 번 세척합니다. 세척이 끝나면 세포를 완전 배지 1 mL에 재현탁합니다.

트라이판 블루 염색을 사용하여 세포 수를 측정하고, 세포 농도를 ml당 100만 개의 생존 반응 세포로 조절한 다음, 각 튜브에서 100 µL의 세포 현탁액을 취해 각 플레이트의 3개 웰에 분주합니다. 해당 웰에 TP 또는 제3자 동종 자극(third party allo stimulation)이라고 표시합니다. 그다음 TP 동종 자극으로 표시된 웰에 방사선 조사된 TP 자극 세포 100 µL를 첨가합니다.

병원체에 대한 동종 반응의 특이성을 추가로 테스트하기 위해, 이전에 CMV에 대해 증식 반응이 확인된 공여자의 PBMC를 활성화시킨 후 반응을 측정합니다. 96웰 플레이트(secondary M-L-R-C-M-V 3일, 5일 및 7일 차)를 준비하고, 벌크 대조군 및 동종 활성화 공배양액에서 각각 5 mL를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 세포를 세척 및 계수하고 완전 배지에서 1 million/mL 농도로 재현탁합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 3개 웰에 분주하고, 이 웰들을 CMV stimulation으로 표시합니다.

그런 다음 CMV 자극으로 표시된 웰에 100 µL의 완전 배지에 희석된 0.1 µL의 CMV 용해물을 첨가합니다. 이어서 음성 대조군으로서 각 플레이트의 6개 웰에 200 µL의 완전 배지를 첨가합니다. 마지막으로, 증발을 줄이기 위해 모든 빈 웰에 200 µL의 PBS를 첨가하고 플레이트를 배양기에 넣어 1차 및 2차 MLR에서 증식을 측정합니다.

플레이트를 수확하기 16시간 전에 음성 대조군 및 세포가 포함된 웰에 1 µCi의 tritiated thymidine을 첨가하십시오. TomTec harvester 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 각 플레이트당 하나의 필터 매트에 thymidine을 수집하십시오. 필터 매트를 1시간 동안 건조하십시오.

그 후 각각의 개별 샘플 백에 넣습니다. 각 백에 5 mL의 신틸레이션 액을 첨가하고 밀봉합니다. HLA 불일치 자극 세포(stimulator)와 반응 세포(responder) PBMC를 사용하여, Wallach 마이크로 베타 신틸레이션 카운터 또는 이와 유사한 장비로 필터 매트를 판독함으로써 실험 마지막 16시간 동안의 tri-thymidine 통합량을 측정합니다.

이 그림을 통해 공동 자극 차단(co-stimulatory blockade)이 1차 MLR에 존재할 때, 5일째 응답자 PBMC의 평균 동종 증식(allo proliferation)이 공동 자극 차단이 없는 대조군 1차 MLR에서 관찰된 수치의 약 30%로 감소함을 알 수 있습니다. 이는 5일째 1차 동종 증식의 평균 억제율이 약 70%에 해당함을 의미합니다. 이 그림에서 확인할 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 5일째에 allo energized PBMC의 2차 MLR 1차 당사자 allo 증식은 일반적으로 대조군 PBMC에서 관찰되는 증식의 10~15% 수준입니다. 이는 평균 85~90%의 증식 억제와 동일하며, allo energized PBMC가 1차 당사자 allo 자극물에 대해 저반응성(hypo responsive)임을 입증합니다. 이 그림에서 알 수 있듯이, 숙련된 경우 allo energized 공여자 말초혈액 단핵세포에 대한 벌크 공동 배양은 2~3시간 내에 설정할 수 있습니다.

이 접근법은 임상적 사용을 위해 쉽게 표준화될 수 있으며, 동종 반응성은 감소시키면서 병원체 특이적 면역력은 유지하는 공여자 T 세포를 생성할 수 있습니다. 이러한 세포는 동종 조혈모세포 이식 상황에서 입양 전이되어, 과도한 이식편대숙주병 없이 면역 재구성을 개선하는 데 사용될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.

이는 세포의 생존력을 유지하고 비특이적 활성화 또는 항원 제시 세포의 소실을 방지하는 데 도움이 됩니다. 자극 세포나 반응 세포로 냉동 보존된 PBMC를 사용하는 경우, 생존 세포의 회수율을 지속적으로 높게 유지할 수 있도록 검증된 냉동 세포 해동 프로토콜을 사용해야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 공여자 말초혈액 단핵구 세포를 동종 면역화(allo-anize)하는 방법과 이 절차의 효능 및 특이성을 평가하는 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 전략은 동종 반응이 감소된 인간 공여자 T 세포를 생성하는 데 활용될 수 있으며, 이는 동종 조혈모세포 이식 후 면역 재구성을 개선하기 위해 임상적으로 사용될 수 있습니다.