Name: Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 배우세요 난소 난포를 3차원 피브린-알지네이트 네트워크에 캡슐화하여 생체 외 배양하는 방법입니다. 이 기술은 세포 간 상호작용을 유지하며 난포 성숙과 난자 발달을 지원합니다.

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이 작품은 NIH (U54HD41857 및 PL1EB008542, Oncofertility 컨소시엄 로드맵 부여 이내 P30 Biomaterials 코어)에 의해 재정 지원되었다.

1. 소낭 절연 동물 실험은 노스웨스턴 대학에서 지침과 규정을 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 규정된 실험실 동물의 관리 및 사용과 설립 기관 동물 사용 및 관리 프로토콜에 따라 수행되었다. 최적의 결과를 들어, 모든 해부는 세균 오염을 최소화하기 위해 37 °의 온도 제어를위한 C 가열 단계, 그리고 깨끗한 벤치에, CO 2의 주위 수준에서 산도 컨트롤에 대한 L15 미디어 실시하고 있습니다. 해부 미디어 (DM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 L15 매체와 준비가되어 있습니다. 유지 보수 미디어 (MM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 αMEM 매체와 준비가되어 있습니다. <ol><li> 0.1 % Collagenase와 0.1 % DNase를 포함 1-2 ML의 MM 가진 새로운 35mm 페트리 접시에 16일 오래된 마우스 갓 해부 난소를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO 2 배양기 안에서 15 분 동안 품어. </li><li> 부화 후 collagenase를 제거한 다음 새로운 DM과​​ 35mm 페트리 접시에 전송하는 DM 몇 가지 세척 단계를 수행합니다. 부드럽게 일회용 주사기에 연결된이 28 8분의 5 게이지 바늘을 사용하여 전체 난소에서 (또는 절삭) 모공 거리 flicking하여 난소에서 모공 분리. 뿌리의 무결성을 손상하지 않고 가능한 한 많은 기질로 제거합니다. 난소 당 20-40 보조 모공 (130~150mm)을 해부하다. 이러한 모공은 보통 체세포로부터 2-3 레이어를했습니다. </li><li> 60mm IVF (체외 수정을)를 페트리 접시 및 외륜 3 ML의 MM 잘 중앙 1 ML의 MM을 추가합니다. 간단히 린스로 IVF 요리의 외륜에 피펫과 함께 그대로 모공을 전송하고, 다음 선택 (1.4 참조) 중앙에 잘 그들을 전송합니다. 인큐베이터에서 IVF 요리를 저장합니다. </li><li> 모든 모공이 수집된 후 선택 단계는 5 배속 배율과 해부 현미경으로 수행됩니다. 건강한 머리카락은 다음과 형태학의 특성을 가지고 : <ul><li> 2-3 체세포 레이어 </li><li> 130~150mm </li><li> oocyte와 체세포 사이에 분리도 </li><li> 온전하고 라운드 oocytes 캡슐화위한 IVF 요리의 중심지로 건강한 모공을 전송합니다. </li></ul></li></ol> 2. 뿌리의 캡슐화, 방법 1 - "드롭 방법" <ol><li> 중간에 잘 IVF 요리의 40 MM CaCl 2 TBS에서 50 IU / ML 트롬빈 1 ML을 추가합니다. 해동 얼음에 피브리노겐 주식 (TBS에서 50 MG / ML)를 유지. 바로 사용하기 전에 실온에 섬유소를 가져와. </li><li> 혼합 1X PBS, 0.5 % PBS 솔루션 알지네이트요 50 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 2시 1분 1초 비율 MG / ML의 피브리노겐 솔루션 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 거품을 도입하지 마십시오. 부드럽게 와동과 스핀 다운. 이 솔루션은 약간 뿌연 나타나고 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다. </li><li> 플레이스 피브리노겐 / IVF 요리의 외륜의 알지네이트요 솔루션의 두 방울 : 캡슐화 및 세탁 10 μL 비말을위한 90 μL 소적. 증발을 감소하려면, 해부 현미경에서 가열 단계를 끄십시오. 200 μm의의 micropipette 팁, 그리고 신속하게 믹스를 사용하여 문화 미디어 (&lt;5 μL)의 최소 금액과 함께 10 μL 비말로 전송 10-15 모공. 최소한 첫 번째 드롭에서 솔루션의 금액 (&lt;5 μL)와 혼합과 90 μL 비말로 머리카락을 모두 전송합니다. </li><li> 동시에 한 뿌리와 IVF 요리에 트롬빈 / CA 2 + 용액에 10 μL 피펫 팁, 그리고 릴리스를 사용하는 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션의 5 μL를 대기음. 모든 모공이 캡슐 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 크로스 링크 트롬빈 / CA 2 + 솔루션 5-7분위한 비즈. 구슬은 섬유소의 젤로 어두운 될 것입니다. 먼저 어두운 비즈로 시작, 페트리 접시 포함 MM에 비즈를 전송합니다. 남은 트롬빈을 씻어하는 15-30분 기계가 보육을 위해 요리를 품다. </li><li> 즉시 100 대과 성장 미디어 μL 및 이미지를 포함하는 96 잘 문화 판에 구슬을 전송합니다. 성장 미디어 (GM)이 재조합 FSH 10 mIU / ML, BSA 3 MG / ML로 보충 αMEM 미디어와 함께 준비 1 MG / 소 fetuin 5 인슐린 μg / ML, 5 μg / 트랜스페린의 ML의 ML, 5 NG / 셀레늄의 ML. </li></ol> 3. 뿌리의 캡슐화, 방법 2 - "Parafilm 방법" <ol><li> 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 1:1 비율로 0.5 % 알지네이트요 솔루션 50 MG / ML의 피브리노겐 솔루션을 혼합하여 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. </li><li> 3mm 스페이서와 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 피브리노겐 / 알지네이트요 혼합물의 피펫 7.5 μL 방울. minima 각 드롭에 한 뿌리를 전송미디어 내 금액입니다. </li><li> 각 드롭 트롬빈 / CA 2 + 솔루션의 7.5 μL를 추가합니다. 젤 거의 즉시 양식 때문에 혼합이 불필요합니다. </li><li> 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드로 젤 커버, 100mm 페트리 접시에 거꾸로 슬라이드를 넣고 5 분 동안 인큐베이터에 전송할 수 있습니다. </li><li> MM을 포함하는 페트리 접시에 비즈를 전송하고, 다음뿐만 아니라 이전에 설명한 문화에. 비즈가 함께 붙어 있으면, 어떤은 비즈 사이의 상호 연결로 인해, 그들은 부드럽게 포셉로 구분하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 뿌리의 이미징 및 미디어 변경 <ol><li> 매 2 일, 교양 모공은 가벼운 현미경과 뿌리 직경이 소프트웨어 프로그램 ImageJ로 측정을 사용하여 몇 군데 있습니다. </li><li> 매 2 일, 성장 미디어 (50 μL)의 절반은 신선한 사전 equilibrated 성장 미디어로 대체됩니다. </li></ol> 5. 3D 매트릭스로부터 체외의 Oocyte의 성숙에 뿌리 복구 (IVM) <ol><li> 문화 8 일 후에, hydrogels 분명 섬유소 구성 요소의 저하를 완료로 인해 나타납니다, 그리고 모공은 300-400 μm의의 직경을 확장합니다. 나머지 알지네이트요은 알지네이트요 - lyase, 특히 알지네이트요를 저하와 동물 세포에 영향을주지 않는 식물 유래 효소에 의해 저하됩니다. </li><li> 구슬이 들어있는 우물에서 성장 미디어를 제거하고 10 IU / αMEM의 ML 알지네이트요의 lyase 100 ML를 추가합니다. 25~30분위한 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. </li><li> 뭉툭한 끝 끝으로 해산 비즈에서 머리카락을 제거합니다. DM을 포함 IVF 요리의 외륜 먼저 전송하고 잘 센터에도 씻어 DM 포함. </li><li> 세척 후, 바깥쪽으로 모공을 전송하고, 성숙 미디어를 포함하는 IVF 요리의 다음 내부 고리. 체외의 성숙 미디어에서 (IVM) αMEM 10 % FCS, hCG 1.5 IU / ML로 구성되어 있으며, 5 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)의 </li><li> 15~16시간에 대한 CO 2 배양기로 전송합니다. 큐뮬러스 세포 확장을위한 모공 검사합니다. , oocyte에서 적운 세포를 제거 최종 농도 hyaluronidase 솔루션을 추가 0.1 MG / ML 후 2-3 분 동안 인큐베이터에서 부화시오. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 oocyte에서 전단 큐뮬러스 세포에 75mm의 micropipette 팁을 사용합니다. 가벼운 또는 해부 현미경 oocyte의 성숙 단계를 확인합니다. 가능한 단계는, 적어도 대부분의 성숙으로, 다음과 같습니다 <ul><li> 퇴화한. oocyte는 두 개 이상의 조각으로 조각화되어 있습니다. </li><li> 새싹 소포 (GV) 단계. oocyte는 oocyte (GV)의 핵의 지속적인 존재가 분명 hCG 노출에 대한 응답으로 감수 분열이 재개되지 않았다. </li><li> 새싹 소포 분석 (GVBD). 핵 막에는 oocyte 결석은 아니지만 북극 ​​바디 선물이 없습니다. 따라서 oocyte는 감수 분열 - 난 아직이다. </li><li> Metaphase - II 체포 oocyte (미이). oocyte는 감수 분열을 재개하고, 지금은 metaphase - II에 체포됩니다. 극지 몸은 가벼운 또는 해부 현미경에서 볼 수 있습니다. 나중에 실험에서 수정된 않는 oocyte는 미이에서 유지됩니다. </li></ul></li></ol> 6. 대표 결과 : 우리는 (그림 1) 체외 문화에 대한 FA - IPN의 난소 모공의 소설 캡슐 방법을 설명했다. 난소의 모공은 체세포의 여러 레이어로 둘러싸인 oocyte로 이루어져 있습니다. 여러 세포 구획 간의 통신은 건강한 뿌리 개발 및 oocyte의 성숙을 위해 필수적입니다. 뿌리 9,11,12의 구조를 유지하면서 3D 히드로겔에서 뿌리의 캡슐은 대과 확장을 지원합니다. 모공이 개발로 그들의 볼륨이 기하 급수적으로 확장되고 캡슐 biomaterial은 억제 압축력의 발전없이 확장을 허용한다. FA - IPN은 섬유소는 뿌리에 의해 활성화되고 알지네이트요는 (그림 2) 13 생물 학적 불활성이다 plasmin에 의해 분해됩니다 proteolytically이 천연 소재의 내장 네트워크입니다. 뿌리 성장하는 동안, 섬유소 저하는 뿌리 근처에 로컬 시작, 그리고 섬유소가 히드로겔에서 해결이 될 때까지 계속됩니다. 문화 시대에 걸쳐 그대로 남아 아닌 분해 알지네이트요 구성 요소, 히드로겔의 3D 구조를 지원합니다. 모공은 개발의 보조 무대 (150-180 μm의 직경)에 고립과 FA - IPN의 젤의 개발의 antral 단계에서 400 μm의 확대했다. hCG 자극과 함께, 교양 모공이 큐뮬러스 셀 확장을 받아야 수 있으며, oocytes는 수정을 위해 metaphase II에 감수 분열과 발전을 재개할 수 있습니다. 이러한 결과는 캡슐화 방법 및 캡슐 소재가 체외 (그림 3)의 뿌리 문화와 성공적인 성숙을 허용하는 것이 좋습니다. encapsul 주위 섬유소 저하ated 모공은 문화의 첫날에 시작 일 6 완료됩니다. Aprotinin, 가용성 plasmin 억제제는 섬유소 저하를 변경하고 캡슐 소재 (그림 4)에서 기계 그라디언트를 확장하는 데 사용할 수 있습니다. 모공이 0.01 TIU / ML aprotinin과 교양 경우, 섬유소는 첫 번째 4 일간 저하 느립니다. 그럼에도 불구하고, 모공은 여전히​​ antral 단계 개발하고 oocytes는 aprotinin이 aprotinin의 removed.A 높은 농도 (0.1 TIU / ML) 후 metaphase II에 감수 분열을 재개하는 능력이 남아 크게 섬유소 저하를 억제, 매트릭스 강성은​​ 대과 확장 및 체세포를 방지 매트릭스에 침공을 준수합니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 대과 개발의 흐름도. 난소 대과는 oocyte 개발을 지원 체세포 하나 이상의 레이어로 둘러싸인 중앙에 위치한 oocyte로 구성되어 있습니다. 모공이 preovulatory antral 무대 차에서 개발할 때, oocyte를 둘러싼 체세포는 때 체세포가 인접, 분아 따위에 의해 번식과 차별, 그리고 oocyte의 크기가 증가합니다. 체외의 성숙에 (IVM) 뿌리 문화의 최종 단계입니다 oocyte는 적운 세포를 칭했다, hCG 자극 후 확장하고 oocyte는 감수 분열을 다시 시작하고 metaphase II (미이) 단계로 진행. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="그림 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2A"> 그림 2A. 체외에서 3D 뿌리 문화에 대한 알긴산과 섬유소 - 알지네이트요가. () 알긴산은 부드러운 겔화 및 메쉬의 크기, 제어 강성 및 생물 학적 자동 력이 없음으로 생화학 특성으로 인해 체외의 뿌리 문화에 적합한 자연 biomaterial입니다. 알긴산은 α​​ - L - guluronic 수 소산​​ (G)와 β - D - mannuronic 수 소산​​ (M)의 선형 다당류의 공중 합체입니다. 반복 G의 단량체와 영역, "G - 블록"칭했다, 이가의 칼슘 이온의 존재에 히드로겔를 형성하기 위해 상호 연결되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="그림 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2B"> 그림 2B. (BI)는 작은 캡슐 모공은 문화의 시작 알지네이트요의 낮은 압축력 경험을 할 수 있습니다. 그러나 뿌리는 비드의 갑작스런 볼륨을 확장으로 대과 확장의 반대 방향 (B - II)에 큰 압축력 결과 이​​는 증가하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="그림 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2C"> 그림 2C. 각각의 고분자 사슬 전에 상호 링크로 섬유소 - 알지네이트요 솔루션 완전히 얽혀 버린 있습니다. FA - IPN의 두 구성 요소는 그들이 트롬빈과 칼슘의 혼합물에 노출 있으므로 즉시 상호 링크를 시작합니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="그림 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3A"> 그림 3A. FA - IPN. 중고등 머리카락의 뿌리 절연 및 캡슐에 대한 흐름도는 16 일 옛 마우스 (AI)에서 격리됩니다. 생식기는 (A - II)를 해부하고 있으며, 절연 모공은 유지 보수 매체 (A - 3)와 함께 접시에 전송됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="그림 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3B"> 그림 3B 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 드롭 방식 (B : I - IV).. 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션의 두 방울, rinsing 드롭 (10 μL)와 캡슐 드롭 (90 μL)이 요리 (BI)에 pipetted 수 있습니다. 앞으로 3-5 모공은 rinsing 드롭 (B - II)으로 전송됩니다. rinsing 및 미디어 제거 후 모공이 캡슐 드롭 (B - 3)으로 전송됩니다. 각각의 뿌리는 10 μL 피펫 팁 5 μL 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 aspirated 후 트롬빈 / 칼슘 솔루션 (B - IV)에 퇴학입니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="그림 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3C"> 그림 3C. 5 분 구슬 crosslinks. 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 parafilm 방법 (C : I - III). 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 (7.5 μL)는 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 pipetted이며 (CI, II) rinsing 후 모공은 각 드롭에 개별적으로 전송됩니다. 트롬빈 용액 (7.5 μL)가 각 드롭 (C - 3)에 추가됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="그림 3d-e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3D - E"> 그림 3D - E. 방울 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드 덮여 있으며 FA - IPN은 5 분 동안 인큐베이터에서 가교입니다. (D) 캡슐 모공은 96 - 웰 플레이트 성장 미디어에 전송됩니다. (E) FA - IPN (흰색 화살표)에 캡슐 대과의 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 성장 folli에 의해 섬유소 저하끌레. 모공은 뿌리 주위 클리어 서클에 의해 입증되는 문화 기간 동안 FA - IPN의 섬유소 구성 요소를 저하. 뿌리의 3D 아키텍처는 남아있는 알지네이트요에 의해 지원됩니다. 하루에 0 (D0) 섬유소는 여전히 그대로이며, 뿌리 주위 매트릭스가 흐린이며 문화의 일일 (D1) 뿌리 주변의 맑은 반지가 나타납니다 (흰색 화살표)과 섬유소 저하 프런트는 반경 하루에 확장을 계속하고 후 2 (D2)와 문화의 일 4 (D4). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 뿌리 성장의 이미지. 일 0에 FA - IPN의 대표 이미지 ofsecondary 뿌리의 성장 (A), 4 (B), 6 (C) 문화 8 (D). 팔일 후에 antral 모공은 체외에서 성숙되었고, 결과 미이 스테이지 oocytes는 (E, 북극 시체가 검정색 화살표로 표시됩니다) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 섬유소 저하는 aprotinin에 의해 저해되었다. 일 2, 4, 10, 12 모공 성장은 첫 번째 행에 표시됩니다. Aprotinin 농도에서 0.01는 TIU / ML (두 번째 행)와 0.1 TIU / ML은 일 0, 2, 4 문화 미디어에 추가되었습니다. 단 aprotinin 제거 후 0.01 TIU / ML aprotinin 저하 섬유소와 문화를 뿌리 및 antral 단계에 도달했습니다. 0.1에서 교양 모공이 TIU / ML aprotinin은 FA - IPN에서 성장하지 않았다. <table border="1"><tbody><tr><td> 약어 </td><td> 전체 이름 </td></tr><tr><td> CO 2 인큐베이터 </td><td> 37 5% CO 2 ° C 배양기 </td></tr><tr><td> COC </td><td> 큐뮬러스 oocyte 복합 </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 차원 3 </td></tr><tr><td> DM </td><td> 해부 미디어 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 표피 성장 인자 </td></tr><tr><td> FA - IPN </td><td> 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 태아 소 혈청 </td></tr><tr><td> GM </td><td> 성장 미디어 </td></tr><tr><td> GV </td><td> 새싹 소포 </td></tr><tr><td> hCG </td><td> 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 </td></tr><tr><td> ITS </td><td> 인슐린 트랜스페린 셀레늄 보충 </td></tr><tr><td> IVF 요리 </td><td> 잘 센터 체외 수정을 접시에 60mm </td></tr><tr><td> MM </td><td> 유지 보수 매체 </td></tr><tr><td> 미이 스테이지 oocyte </td><td> Metaphase II 스테이지 oocyte </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> 재조합 Follicular 자극 호르몬 </td></tr><tr><td> TBS </td><td> 트리스는 호수 버퍼 </td></tr><tr><td> TIU </td><td> 트립신 억제 단위 </td></tr></tbody></table> 표 1. 약어

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
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<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

FA - IPN의 표시 난소 대과의 캡슐 방법은 체외에서 3D 환경에서 뿌리 문화를 수 있습니다. FA - IPN은 초기 기계적 특성이 섬유소와 알지네이트요 모두의 조합에 의해 결정하는 동적 셀 응답 매트릭스입니다. 문화 동안 캡슐 대과은 전적으로 문화의 끝에 남은 알지네이트요에 의해 공헌하는 점차 감소 젤 강성 결과 IPN의 한 구성 요소, 섬유소를 저하 프로 테아제을 활성화한다. FA - IPN로 얻은 동적 기계적 특성은 개발 모공의 자연 환경과 일치하도록 제안하고 혼자 알지네이트요 비교 oocyte meiotic 성숙의 속도 향상에 기여하고 있습니다. FA - IPN은 독립적인 메커니즘에 의해 교차 연결 시스템의 각 구성 요소와 온화하고 빠른 겔화을 보여줍니다. 우리는 겔 형성의 속도가 피브리노겐 및 트롬빈의 농도에 의해 통제 수있는 다른 5 설명되어있다. 열화 속도는 섬유소의 proteolysis의 aprotinin 억제에 의해 조정...

<table><tbody><tr><td>페투인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Roche 그룹</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>상피세포 성장인자</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>재조합 여포자극호르몬(rFSH)</td><td>국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 絨毛膜 성선 자극 호르몬 (hCG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>내부 전사 간격 서열 (Internal Transcribed Spacer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Life Technologies의 GIBCO</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>Life Technologies의 GIBCO</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>트리스 완충염 용액 (Tris-Buffered Saline)</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel 피브린 키트</td><td>Baxter International Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>알긴산나트륨</td><td>FMC 바이오폴리머</td><td>LF200DL</td><td>분자량 418kDa</td></tr></tbody></table>

proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

난소 대과는 섹스 호르몬을 secretes 난소의 기능 단위이며, oocyte의 성숙을 지원합니다. 체외의 대과 기술의 기본적인 생물을 조사하기 위해 모델 대과 개발하는 도구를 제공하고, 추가로 다산을 보존하는 기술로 발전되고있다 클리닉 1-4. 우리의 체외 배양 시스템은, 세포 세포의 상호 작용 및 paracrine 신호 것을 직접 고치 개발 5 3D follicular 구조를 유지하여 기본 난소 환경을 모방하기 위해 hydrogels을 사용합니다. 이전 모공이 성공적으로 알지네이트요, 칼슘 이온 6-8로 겔화를 겪습 불활성 조류 파생 다당류에 교양되었습니다. 0.25 % W / V의 농도에서 형성된 알긴산의 hydrogels는 뿌리 문화에 가장 허용되었고, 최고의 개발 역량 9 유지. 알긴산의 hydrogels 따라서, 뿌리의 성장 10 영향을 줄 수 있습니다 뿌리 압축력에 뿌리 직경 결과에 증가 분해되지 않습니다. 우리는 이후 섬유소와 알지네이트요의 혼합물을 동시에 gelled있는 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크 (FA - IPN)을 기반으로하는 문화 시스템을 개발했습니다. 두 구성 요소가 처음 매트릭스 강성에 기여하기 때문에이 조합은 역동적인 기계 환경을 제공하지만, 성장 뿌리에 의해 분비 프로 테아제 지원을 제공하기 위해서만 알지네이트요를 떠나 매트릭스의 섬유소를 저하. IPN으로 알지네이트요 내용은 혼자 5 알지네이트요 가능하지 않습니다 0.25 %, 아래 줄일 수있다. 따라서 뿌리가 확장되면, 그것은 감​​소 고체 내용으로 인해 감소 압축 힘을 경험하게 될 것입니다. 여기에, 우리는 캡슐화 방법 및 FA - IPN 이내에 난소의 모공에 대한의 체외 배양 시스템을 설명합니다. 동적 기계적 환경은 작은 모공이 단단한 피질에 거주하고 크기가 11 증가로 더 허용 모수로 이동하는 자연 난소 환경을 모방한 것이었 지요. 분해 구성 요소는 인간의 머리카락은 정상적으로 생체내에서 받아야 해당 볼륨에있는보다 큰 10 6 배 증가를 지원하기 위해 임상 번역에 특히 중요있을 수 있습니다.

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

난포는 성호르몬을 분비하고 난모세포의 성숙을 지원하는 난소의 기능적 단위입니다. 체외 난포 배양 기술은 ...

본 프로토콜은 인비트로(in vitro) 배양을 위해 피브린 알지네이트 상호 침투 네트워크(interpenetrating network) 내에 난포를 캡슐화하는 새로운 방법을 설명합니다. 2차 난포는 여러 층의 체세포에 둘러싸인 중앙의 난자로 구성되며, 이 체세포들은 난자의 발달을 지원합니다. 3차원 환경에서의 난포 캡슐화 및 배양은 여러 세포 구획 간의 소통을 지원하고 난포의 구형 구조를 유지하면서 난포의 확장을 가능하게 합니다. 본 프로토콜의 첫 번째 단계에서는 드롭법(drop method)을 위해 16일 된 생쥐 난소에서 2차 난포를 분리합니다.여포를 헹군 후 캡슐화 용액으로 옮깁니다. 피브리노겐 알긴산 용액 피펫을 사용하여 각 여포를 흡입한 다음 트롬빈 칼슘 용액에 분주하고, 파라폼 방법을 위해 비드가 가교되도록 둡니다. 개별 여포를 파라폼이 코팅된 유리 슬라이드 위의 피브리노겐 알긴산 용액 방울로 옮기고, 트롬빈 용액을 첨가하여 F-A-I-P-N 가교를 유도합니다.그 다음 캡슐화된 난포를 성장 배지로 옮기고, FA IPN 내의 캡슐화된 난포를 촬영합니다. 이 시스템은 미성숙 난포가 난자를 생성하며 성장하고 발달할 수 있도록 구조적 지지력과 생물학적 반응성을 결합하였으므로, 세포 확장을 제한하지 않으면서 세포 간 접촉을 유지해야 하는 세포 응집체 배양에 적용될 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Lonnie Shea이며, Three Wood Drip과의 협력을 통해 난소 난포의 체외 성숙을 위한 배양 시스템을 개발했습니다.이 배양 연구는 생명공학과 생식생물학 간의 진정한 협력을 잘 보여줍니다. 오늘은 이 배양 시스템을 실제로 개발한 분들이 해당 방법을 소개해 드릴 예정입니다. 먼저, 생체 재료 시스템을 개발한 생명공학 박사후 연구원 Ariel Checkoff 님이 발표하겠습니다.다음은 난소 조직 취급 절차를 개발한 산부인과 교실의 생식 생물학자 민수 씨입니다. 이제 두 사람이 함께 난소 조직의 실제 캡슐화 및 배양 방법에 대해 발표하겠습니다. 평면 플라스틱 표면에서의 표준 배양과 같은 기존 방법 대비 설명된 기술의 주요 장점은, 피브린-알긴산 시스템이 난포의 3차원적 구조를 지원하는 동시에 빠르게 확장하는 난포에 기계적으로 역동적인 환경을 제공한다는 점입니다.현재의 장치 내 역동적인 기계적 미세환경은 이 기술이 마우스 모델에서 잠재적인 임상 응용으로 전환될 때 추가적인 이점을 제공하는데, 이는 최적의 결과를 얻기 위해 인간의 난포가 성숙하고 수정 가능한 난자를 생성하려면 훨씬 더 광범위한 성장이 필요하기 때문입니다. pH 조절을 위해 L 15 기반 배지에서, 온도 조절을 위해 37 °C 가열 스테이지 위에서, 그리고 박테리아 오염을 최소화하기 위해 클린 벤치에서 모든 해부 과정을 수행하십시오. 갓 해부한 난소를 0.1% collagenase와 0.1% DNase가 포함된 유지 배지 1~2 mL가 들어 있는 새로운 35 mm 페트리 접시에 옮기고, 이산화탄소 배양기에서 15분 동안 배양하십시오.콜라게나아제를 제거하기 위해 샘플을 DM으로 세척한 후, 난소에서 난포를 분리하기 위해 신선한 DM이 담긴 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 인슐린 주사기에 장착된 28 또는 30 게이지 바늘을 사용하여 난소 전체에서 난포를 부드럽게 튕겨내어 분리합니다. 난포의 무결성을 손상시키지 않으면서 가능한 한 많은 기질 세포를 제거하십시오.난소당 직경 130~150 µm의 2차 난포를 20~40개 분리해 냅니다. 이러한 난포들은 보통 2~3층의 과립막 세포층을 가지고 있습니다. 이제 IVF 디쉬의 중앙 웰에 mm 1 mL를, 바깥쪽 링에 mm 3 mL를 추가합니다.파이펫을 사용하여 손상되지 않은 난포를 IVF 디쉬의 바깥쪽 링으로 옮깁니다. 이 IVF 디쉬를 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터 내에 보관하십시오. 모든 난포의 수집이 완료되면.5~8배 확대의 실체 현미경 하에서 샘플을 관찰하여, 2~3층의 과립세포층이 있고 난모세포와 과립세포 사이에 분리가 없으며 난모세포가 원형이고 온전한 상태인 건강한 형태의 130~150 µm 크기 여포를 선택합니다. 건강한 여포를 캡슐화를 위해 다른 IVF 디쉬의 중앙으로 옮깁니다. 여포 캡슐화를 위한 드롭법(drop method)의 경우, 50 IU/mL 농도의 트롬빈 용액 1 mL를 IVF 디쉬의 중앙 웰에 추가하고, 피브리노겐 스톡 용액을 해동하여 얼음 위에 보관합니다.그리고 캡슐화 직전에 피브리노겐을 실온 상태로 준비하십시오. 사용 직전에 준비하십시오. 1배 농도의 PBS 0.5% 알긴산염과 50 mg/mL의 피브리노겐을 혼합하여 피브리노겐 알긴산염 용액을 조제하십시오.1.7 mL 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 피브리노겐을 2:1:1 비율로 넣습니다. 약간 뿌연 용액을 가볍게 볼텍싱하고 원심분리하여 증발을 줄입니다. 해부 현미경의 가열 스테이지를 끄고 IVF 접시의 외부 링 모서리에 배치합니다.캡슐화를 위해 90 µL의 피브리노겐 알지네이트 용액을 준비하고, 세척 단계를 위해 10 µL의 두 번째 방울을 준비합니다. 10~15개의 난포를 최소량의 배양액과 함께 10 µL 방울로 옮기고, 최소량의 용액으로 빠르게 혼합한 후, 모든 난포를 90 µL 방울로 옮겨 혼합합니다. 10 µL 팁을 사용하여 5 µL의 피브리노겐 알지네이트 용액 내에 난포 하나를 흡입한 다음, IVF 디쉬 중앙의 트롬빈 용액에 난포와 함께 피브리노겐 알지네이트 용액을 배출합니다. 모든 난포가 캡슐화될 때까지 이 단계를 반복합니다.비드들을 thrombin calcium solution 내에서 5~7분 동안 방치하여 겔을 가교시킵니다. fibrin이 형성됨에 따라 비드의 색이 더 어둡게 변합니다. 색이 더 어두운 비드부터 시작하여 비드들을 유지 배지로 옮깁니다.먼저 37°C에서 15분에서 30분 동안 배양한 후, 남은 thrombin을 씻어냅니다. 마지막으로, 비드를 배양 플레이트로 옮기고 이미징합니다. 0.5% alginate와 50 mg/mL를 혼합하여 fibrinogen alginate 용액을 즉시 준비합니다.1.7 mL 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 1:1 비율의 피브리노겐을 넣고, 피브리노겐 알긴산 혼합액 7.5 µL를 파라핀 코팅된 유리 슬라이드 위에 떨어뜨립니다. 이때 3 mm 스페이서를 사용하며, 최소량의 배지와 함께 각 방울에 모낭을 하나씩 옮깁니다.겔이 거의 즉각적으로 형성되므로, 난포에 닿거나 섞이지 않도록 각 방울에 thrombin 용액 7.5 µL를 첨가합니다. 두 번째 para film 코팅 유리를 사용하여 겔을 덮습니다. 이를 슬라이드하여 100 mm 디시에 뒤집어 넣고 인큐베이터에서 5분 동안 둡니다.필요한 경우 핀셋을 사용하여 점착성 비드를 유지 배지로 옮긴 후, 2일마다 배양 웰로 이동시킵니다. 광학 현미경을 사용하여 배양된 난포의 이미지를 촬영하고 Image J로 난포의 직경을 측정합니다. 또한 2일마다 성장 배지의 절반을 신선한 평형 성장 배지로 교체합니다. 8일간의 배양 후에는 피브린 성분이 완전히 분해되어 하이드로젤이 투명하게 보여야 하며, 난포는 직경 400 microns 이상의 최종 크기에 도달할 수 있습니다. 성장 배지를 제거하고 100 microliters의 10 international units per milliliter를 첨가합니다.알긴산염을 분해하기 위해 alpha mem 내의 Alginate lia를 처리합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 25분에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 뭉툭한 팁(blunt end tip)을 사용하여 부분적으로 용해된 비드에서 난포를 분리합니다.알긴산 결합물을 씻어내기 위해 해부 배지가 담긴 IVF 디쉬의 바깥쪽 링으로 난포를 옮긴 후, 다시 안쪽 링으로 옮깁니다. 이제 HCG와 EGF가 포함된 성숙 배지가 담긴 IVF 디쉬의 바깥쪽 링을 거쳐 안쪽 링으로 난포성 난포를 옮기고, 이산화탄소 배양기에서 15~16시간 동안 배양합니다. 배양물을 관찰하여 난구 세포의 확장을 확인한 후 난구 세포를 제거합니다.IDE 용액을 최종 농도 0.1 mg/mL가 되도록 첨가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 2~3분 동안 배양합니다. 마우스 피펫을 사용하여 난구를 제거해 난자를 분리한 후, 현미경 하에서 성숙 단계를 최종적으로 판별합니다.알긴산은 부드러운 성질과 그물망 크기, 조절 가능한 강성, 생물학적 불활성과 같은 생화학적 특성 덕분에 인비트로(in vitro) 난포 배양에 적합한 천연 바이오 소재입니다. 캡슐화된 소형 난포는 배양 초기에 알긴산 내에서 낮은 압축력을 경험합니다. 그러나 난포가 확장됨에 따라 비드의 변위 부피가 증가하며, 이는 난포 확장 반대 방향으로 더 큰 압축력을 유발하게 됩니다.가교 결합 전의 피브릴린 알긴산 용액에서는 개별 고분자 사슬들이 완전히 얽혀 있습니다. F-A-I-P-N의 두 성분은 트롬빈과 칼슘 혼합물에 노출되는 즉시 가교 결합을 시작합니다. 배양 기간 동안 난포는 F-A-I-P-N의 피브린 성분을 분해하며, 이는 난포 주변의 투명한 원형 영역을 통해 확인됩니다. 난포의 3D 구조는 남아있는 알긴산에 의해 지지됩니다.이 이미지들은 0, 4, 6일차에 걸쳐 F-A-I-P-N에서 이차 난포의 성장 과정을 보여주며, 결과적으로 극체가 있는 M2 단계의 X를 나타냅니다. aprotinin은 피브린 분해를 늦추기 위해 배양액에 첨가할 수 있는 프로테아제 억제제입니다. 처음 4일 동안 배양액에 0.01 TIU/mL의 aprotinin을 첨가하면, 난포는 매트릭스를 분해할 수 없습니다. 그리고 aprotinin을 제거한 후, 난포는 다시 성장을 시작하여 항포 단계에 도달합니다.그러나 초기 배양 시 고농도의 aprotinin을 사용한 난포에서는 성장이 억제되었습니다. 본 연구에서 우리는 3차원 피브린 알지네이트 네트워크 내에서 난포 캡슐화 및 인비트로(in vitro) 배양을 다양화하는 새로운 기술을 시연하였습니다. 이 시스템은 배양 과정 동안 난포 구조를 온전하게 유지할 뿐만 아니라, 성공적인 인비트로 난포 발생을 지원하여 M 2단계 O 부위라는 결과를 도출합니다.이 기술은 난포의 작동 원리를 규명하는 데 중요하며, 보다 일반적으로 젊은 암 환자들에게 가임력 보존 옵션을 제공할 가능성이 있습니다. 이 배양 시스템은 세포 집단의 배양이나 세포가 구조체로 조직화되는 과정의 배양에 활용될 수 있습니다. 이러한 3D 배양 시스템은 조직 성장을 분자 수준에서 분석하는 데 귀중한 도구가 될 것입니다.

a-method-for-ovarian-follicle-encapsulation-culture-proteolytically

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

그들의 입체적인 맥락에서 정상 세포의 문화 세포 변형 및 tumorigenesis에 필요한 초기 이벤트를 연구하는 다른 방법을 나타냅니다. 이 방법은 난소암 형성 초기에 이벤트를 연구 정상 난소와 oviductal 세포를 성장하는 데 사용됩니다.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

이 동영상은 3D 배양을 확립하기 위해 돼지 적운-난모세포 복합체(COC)를 피브린-알긴산 비드에 캡슐화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 체외 성숙 시스템은 정상적인 세포 간 통신을 유지하여 난모세포 성숙을 보장하고 생존력을 유지합니다.

돼지 COC의 3D 배양: 피브린-알긴산 고분자 하이드로겔 비드에서 적운 난모세포 복합체를 캡슐화하는 절차

이 비디오에서는 소수성 미생물반응기에서 돼지 난모세포를 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Liquid Marble Microbioreactor 시스템: 돼지 난모세포 캡슐화를 위한 3D 배양 프로토콜

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

이 프로토콜은 티라민 결합 히알루로난 하이드로겔을 사용하여 마우스 난소에서 전방의 여포를 캡슐화하고 배양하는 새로운 3차원(3-D) 배양 모델을 설명합니다. 또한 유리화(vitrification)에 의한 난소 여포 동결 보존에 대한 두 가지 접근 방식에 대해서도 자세히 설명합니다.

3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

우리는 시험관 내 배우자 형성을 보완하는 새로운 스캐폴드가 없는 아가로스 곰팡이에서 난소 난포를 배양하는 방법을 설명합니다.

스캐폴드 프리 마우스 난소 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드의 생산 및 사용

우리는 기질이 풍부한 난소 분획에서 마우스 난소 체세포를 분리하고, 스캐폴드 없는 접근법을 사용하여 마우스 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

난소 미세환경 탐구: 마우스 난소 체세포의 분리, 2D 배양 및 오가노이드 배양 방법

방법은 콜라겐 유형 I 및 기본 인간 섬유 아세포로 구성된 3 차원 매트릭스의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 이 조직 기질의 기본 기능을 모방하고 현미경의 여러 형태의 의무이기 때문 organotypic 젤은 침입 세포 마이그레이션을 평가하는 유용한 기판 역할을합니다.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

배우세요 난소 난포를 3차원 피브린-알지네이트 네트워크에 캡슐화하여 생체 외 배양하는 방법입니다. 이 기술은 세포 간 상호작용을 유지하며 난포 성숙과 난자 발달을 지원합니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

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