솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스

이 절차는 수명, 번식 및 신진대사에 미치는 영향을 연구하기 위해 Sea Elegance의 표준 abased 플레이트에 대한 식이 제한을 수행합니다. 이것은 먼저 식품 공급원으로 사용될 박테리아의 농도를 정확하게 측정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 박테리아 배양액을 적절한 농도로 적절하게 희석하는 것입니다.

그런 다음 죽은 박테리아가 있는 기반 SDR 플레이트를 준비합니다. 마지막으로 연령이 동기화된 웜 개체군으로 SDR 실험을 설정합니다. 자손 생산 및 수명 측정 결과는 자손 생산이 지연되고 감소할 뿐만 아니라 평균 수명이 증가했음을 보여줄 수 있습니다.

AZA 매체의 Dian과 같은 60 가지 방법보다 이 기술의 주요 장점은 모든 실험이 대부분의 따뜻한 실험실에서 사용되는 표준 고체 AGA 기반 플레이에서 수행된다는 것입니다. 식이 제한 실험을 위해 우아함을 볼 수 있으며 식품 공급원으로 사용되는 각 박테리아 균주에 대해 별도의 보정 곡선을 설정합니다. lb 한천의 새로운 줄무늬에서 대장균 OP 50 박테리아의 단일 군체를 선택하고 섭씨 37도의 셰이커에서 하룻밤 동안 3ml의 액체 lb 육수 배양액을 접종합니다. 하룻밤 배양의 연속 2배 희석을 준비합니다.

그런 다음 분광 광도계로 600나노미터에서 각 희석액의 흡광도를 삼중으로 측정합니다. 각 박테리아 현탁액을 더 두껍게, 100 밀리미터 파운드 농업 플레이트에 각 희석액의 박테리아 현탁액 0.4 밀리리터를 균등하게 파종하고 섭씨 37도에서 18-24 시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 대한 밀리리터당 집락 형성 단위를 계산하기 위해 각 플레이트에서 자란 박테리아 집락의 수를 세십시오.

이제 OD 600을 박테리아 농도의 함수로 플롯하고 선형 회귀 분석을 수행하여 측정된 OD 600 값과 OP 50 박테리아 농도 간의 관계를 설정합니다. 이 방법의 경우, 밀리리터당 11번째 CFU의 1배인 박테리아 농도가 애드 리도 공급 조건에서는 사용되고, 최적의 DR 공급 조건으로는 밀리리터당 10에서 8번째 CFU의 1배인 박테리아 농도가 사용됩니다. 그러나 완전한 용량 의존적 관계를 확립하기 위해 4-6개의 서로 다른 박테리아 농도가 필요할 수 있습니다.

SDR과 그 대응을 위해. 섭씨 37도의 셰이커에서 6-8시간 동안 배양한 3ml의 액체 LB 육수에 대장균 OP 50 박테리아 단일 콜로니가 포함된 접종물을 준비합니다. OP 50 배양액을 LB 육수 500ml가 함유된 새 플라스크로 옮기고 필요한 경우 박테리아가 포화 상태에 도달할 수 있도록 밤새 성장시킵니다.

OD 600에서 흡광도를 측정하기 위해 OP 50 배양을 적절하게 희석할 준비를 합니다. 박테리아 농도를 측정하려면 1500Gs에서 20분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 박테리아를 밀리리터당 12번째 CFU의 10 곱하기 농도로 재현탁시킵니다.

이제 10mL 박테리아 배양물을 12번째 CFU의 10배부터 7번째 CFU의 10배까지 6가지 농도로 배양합니다. 2ml의 박테리아 배양액을 60mm 응고된 N GM 플레이트의 중앙으로 향하게 합니다. 피펫 팁으로 플레이트 표면을 만지지 마십시오. 표면의 흠집으로 인해 벌레가 공기에 파묻힐 수 있습니다.

플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 그런 다음 밀리리터 탄산 소인 당 100 밀리그램의 10 마이크로 리터와 밀리리터 당 50 밀리그램의 마이신 10 마이크로 리터를 박테리아의 나머지 성장에 각 플레이트에 마이신을 적용하십시오. 항생제로 죽인 박테리아의 농도가 다른 접시는 나중에 최대 한 달 동안 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관하십시오.

충분한 플레이트를 준비하고 보관하는 것이 중요하며, 가급적이면 전체 공장에 대해 동일한 배치를 사용하는 것이 좋습니다. 박테리아의 생존 능력을 확인하기 위해 적어도 하루에서 이틀 전에 실험하십시오. SDR 플레이트에서 일부 박테리아를 긁어내고 탄산, 세인 및 항마이신과 함께 빈 N GM 플레이트에 펴 바릅니다.

플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 6-8시간 동안 놓고 박테리아 성장이 없는지 확인합니다. 수명 분석 및 자손 생산 프로파일링과 같은 대부분의 SDR 관련 연구에서는 연령 동기화된 지렁이 개체군을 준비하는 것이 필수적입니다. 백금 지렁이 피커를 사용하여 20-30명의 생식 활성 성체를 여러 개의 일반 NGM 플레이트로 옮깁니다.

OP 50과 함께. 실험에 필요한 난자의 수에 따라 더 많은 성체가 필요할 수 있습니다. 알을 낳을 수 있도록 접시를 섭씨 20도에서 4시간 동안 그대로 두십시오.

접시에서 성충을 제거하고 접시에 계란이 있는지 육안으로 검사합니다. 자손이 4일 1대 성체 단계로 발달할 수 있도록 섭씨 20도에서 플레이트를 계속 배양합니다. 일반적으로 섭씨 20도에서 N, 두 개의 야생형 벌레의 경우 3일이 걸립니다.

수명 해석용. 10-12일 동안 성충 한 마리를 SDR 플레이트에 옮겨 식이 제한을 시작합니다. 충분한 통계량을 얻으려면 각 SDR 조건에 대해 총 60-100개의 웜을 사용합니다.

모든 벌레가 죽을 때까지 2-3일마다 각 벌레의 생존 능력을 점수화합니다. 중요한 것은 굶주림을 피하기 위해 이틀에 한 번씩 지렁이를 새로운 SDR 플레이트로 옮기는 것입니다. 이 검량선은 OD 600과 관련된 OP 50 농도를 표시합니다.

선형 회귀 분석에 의해 생성된 방정식은 향후 OP 50 박테리아 농도의 모든 계산에 사용할 수 있습니다. 이 연구는 SDR에 대한 야생형 기생충의 정상 용량 의존적 반응과 비교하여 다양한 기생충 균주의 평균 수명에 대한 만성 SDR 치료의 효과를 분석합니다. SDR의 수명 효과는 DR 2 과발현에 의해 부분적으로 억제되는 반면, DAF 16 MU 86 돌연변이는 SDR 유도 수명 연장에 영향을 미치지 않습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 바다의 우아함에서 표준 AGA 기반 플레이에서 Dian을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.