Name: 유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 마우스 폐에 비수술적 기관내 투여법을 이용한 면역세포 분석 방법을. 유동세포계측법으로 폐와 림프절의 면역세포 이동을 연구하여 호흡기 면역 반응 메커니즘을 규명합니다.

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1. 과정을하기 전에 준비를 다음과 같은 항목을 수집 <ol><li> 절차를 수행하는 동안 마우스를 묶을 수있는 목조 플랫폼 구축을위한) 그림 1A에있는 이미지 참조) 및 1B하시기 바랍니다. </li><li> HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypeIV 또는 2.5 MG / ML Collagenase D - 림프절에 대한 소화 믹스 </li><li> 폐에 대한 소화 믹스 - HBSS가 + 1 MG / ML Collagenase </li><li> LDLNs을 시각화하기 위해 intraperitoneal 주사 PBS에서 라텍스 구슬 (1시 20분)를 희석 </li></ol> 참고 : LDLNs 찾아 작은 열심히하고 있습니다. 그들을 찾는 방법에 대한 자세한 내용은 마우스로 빨간색 형광 라텍스 구슬이 IP 희석 1시 20분의 200μl 주입. 복막이 LDLNs 8 빼낸. 24 hpi은 위에 설명된대로 마우스의 흉강을 폭로. LDLNs은 복막 캐비티에서 탈진 비즈에서 분홍색 표시됩니다. <ol start="5"><li> 적혈구 세포 (RBC) 용해 완충액 - 0.15M NH 4 Club 호텔, 10mM KHCO 3, 1L DH 2 0에서 0.1 mm까지 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 7.2-7.4로 산도를 조정하고 실온에서 저장합니다. </li><li> 70μm 100μm 또는 셀 스트레이너 </li><li> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 = 8.0의 주식 솔루션 </li><li> CaCl 2, MgCl 2없이 HBSS </li><li> 가위와 무딘 종단 포셉 </li><li> 후두경 </li><li> 각도에 Gavage 바늘 (22 게이지) 벤트 (그림 2) </li><li> 스티로폼 보드와 마우스를 확산을위한 핀 </li><li> 톱 팬 밸런스 </li><li> 아닐린 블루 솔루션 - H 2 O에 10mg/ml </li></ol> 참고 : 우리가 사출 기술의 시연을 위해이 솔루션을 사용합니다. 2. 마우스 마취제의 준비 및 관리 <ol><li> 최종 농도가 각각 2mg/ml하고 10mg/ml 수 있도록 멸균 PBS에 Xylazine과 300ml의 혼합물을 준비합니다. </li><li> 최고의 팬 균형에 마우스를 달다. </li><li> 각각의 마우스에 필요한 복용량을 계산합니다. Xylazine (2-4 MG / kg)와 케타민을 (70-80 MG / kg) 체중에서 선량은 준비된 혼합물의 적절한 볼륨을 사용하고 intaperitoneally을 주입. 각 마우스 스트레인은 ​​마취의 최적화가 필요할 수 있습니다. 너무 마취를 받고 쥐들이 inoculum가 폐로 얻은 후에 치명적일 수있는 감소 호흡 속도가있을 수 있습니다. </li><li> 3~5분 후, 마취의 영향에 대한 마우스를 관찰합니다. 마우스가 완전히 anesthetized 있는지 확인하려면 다음 표지판 확인 : <ol><li> 호흡 속도는 느리게한다. </li><li> 목 집었 때 마우스는 팔을 스트레칭 안됩니다. </li><li> 뒷다리 팔다리가 자극되는 답변이되지 않습니다. 이러한 기준이 충족되지 않으면, 몇 분 동안 기다린 후 다음 단계로 진행하기 전에 다시 확인합니다. </li></ol></li></ol> 3. Intratracheal 주사 <ol><li> 50μl 생리에 innoculum을 준비합니다. innoculum와 살균 벤트 gavage 니들 장착되어 1ml 주사기를 입력합니다. 주사기는 유체의 모든 폐로 얻은 것을 보장하기 위해 innoculum 뒤에 100μl 공기 주머니로로드해야합니다. </li><li> 철사에 미치는 incisors에 의해 매달려 직각 나무 플랫폼에 마우스를 놓고 부드럽게 리본의 조각 장소에서 그것을 제지. </li><li> 왼손으로 후두경 켜고 (당신이 바로 손으로하는 경우)와 무딘 종료된 포셉 한 켤레를 잡아. 부드럽게 입을 열 돌을 후두경의 끝에와 포셉을 사용합니다. </li><li> 포셉로 혀를 뽑아서 측면에 들어요. 입 뒤쪽으로 후두경 블레이드를 안내입니다. 당신이기도의 개통을 볼 때까지 90 ° 각도로 천천히 아래로 눌러 후두경 보관하십시오. 장소에 후두경 잡아. 입에서 혀 당기는 않으며 조직 손상이 발생하지 않도록 이것은 부드럽게 이루어져야 할 때주의해야합니다. </li><li> 바늘에 굽어 전면 incisors에 의해 때까지 다른 손으로, 오른쪽 손으로 벤트 gavage 바늘로 장착되어 innoculum 들어있는 1ml 주사기를 가지고기도에 바늘을 삽입합니다. innoculum를 제공하기 위해 골고루 플런저를 밀어. innoculum 거품이 안됩니다. 가능한 빨리기도의 바늘을 빼낸다. 마우스는 질식 및기도가 너무 오래 차단되면 죽을 것이다. innoculum가 폐 속에 흡입 수 있도록 몇 초 동안 수직으로 마우스를 잡고. </li><li> 플랫폼의 마우스를 꺼내와 난방 램프 근처에 놓으십시오. 오랜 기간 동안 직접적인 열을 아래에 마우스를 두지 마십시오. 마우스 절차 (복구 시간이 종자에 따라 달라질 수 있음) 후 30 분 이내에 완전히 깨어 있어야합니다. 마우스가이 시간 동안 열심히 관찰되어야하며 너무 뜨겁거나 너무 차가운 얻을 수해서는 안됩니다, 이것은 또한 죽음에 선도적인 호흡 곤란에 쥐를 넣어 수 있습니다. </li></ol> 4. 유동세포계측법을위한 수확 및 가공 폐 배수 림프절 및 폐<ol><li> AVMA의 안락사 가이드라인 당 등 원하는 방법을 사용하여 마우스를 희생. 이것은 개별적인 수확 결과에 따라 다를 수 있습니다. pentobarbital 나트륨 않는 치명의 관리는 적절한 안락사 프로 시저의 예입니다. 우리는 CO 2에 의해 안락사의 부정적인 폐 효과를 보지 못했어요. </li><li> 해부 보드에 팔, 다리를 핀. 가위로 복부 쪽의 중간을 따라 절개를합니다. 부드럽게 피부를 끌어와 가슴 벽 근육을 노출. </li><li> 복부 장기 노출 가슴 벽 근육을 통해 incisions하십시오. </li><li> 포셉 주사의 횡경막과 흉골의 끝을 잡고. 흉곽의 양쪽을 따라 횡경막을 잘라요. </li><li> 해부 보드 표면에 평행하게 가위가 양쪽에있는 dorso - 복부 라인을 따라 흉강을 통해 절단과 함께. </li><li> 약간 최대 갈빗대 리프트. 심장의 오른쪽에, 그냥 thymus 아래 두 개의 림프절을 찾습니다. 약간 큰 셋째 림프절은 기관에 직각으로 실행하는 작은 동맥 혈관 아래에 위치하고 있습니다. 하베스트 림프절 림프절의 소화 믹스 1 ML에. </li><li> 림프절을 수확 후 포셉 한 쌍의으로 마음을 잡고 다른과 폐를 잡아. 6 잘 판에 얼음 차가운 PBS의 3ml에 수확 폐. </li><li> , 폐 엽 (叶)을 별도의 PBS를 기음과 집게와 가위를 사용하여 작은 조각으로 엽 (叶)을 들어온다. 폐에 대한 소화 믹스의 3ml를 추가합니다. 이 단계 동안 얼음에 6 판 잘 보관하십시오. </li><li> 37 30 분 25-30 분 및 폐를 위해 림프절을 품어 ° C. 얼음 반응과 장소를 중지 소화 혼합물의 각 10mM의 최종 농도 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. </li><li> 3ml 주사기를 사용하여, 18GA 바늘을 통해 3 번 폐 부분을 전달합니다. 1ml 주사기의 플런저의 백 엔드를 사용하여 70 100μm 셀 strainers 통해 폐와 LNs의 매쉬는 조각. 칼슘이없는 HBSS의 10ml와 세포 strainers 와시 +와 MG 2 +. 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> RBC의 용해 버퍼 5 ML에서 펠렛을 Resuspend 및 실내 온도에서 3 분 알을 품다. 칼슘이없는 HBSS의 10ml 추가 +와 MG 2 + 용해를 끄지 수 있습니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기. 각각 10ml와 5ml에 폐 및 LDLN 단세포 suspensions을 가져 오십시오. trypan 파랑 제외하여 hemacytometer를 사용하여 라이브 세포를 계산합니다. 세포는 이제 유동세포계측법을 위해 얼룩이 준비가 된 것입니다. 폐 1 엽은 유동세포계측법 충분한 수 있습니다. 기타 엽 (叶)은 이러한 조직학에 대한 크린 시토킨 또는 조직에 대한 homogenates 같은 마우스 내의 다른 실험적인 질문에 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 즉시에게 주사를 다음과 폐 LDCs와 폐포 macrophages은 폐의 폐포 공간에서 항원을 획득. 그림 3은 CD11c + (LDCs 및 폐포 macrophages에 대한 표현)의 비율이 찬란 표시 바실러스 anthracis 포자 양성 반응 세포가 30 분 이후 그 주사를 보여줍니다. 이때 폐 단일 세포 현탁액에서 CD45 + CD11c + 세포의 ~ 15.9 %가 바실러스 anthracis 포자 (그림 3, 하단 패널)을 숨겨. 폐에서 CD11c + 세포의 자세한 특성 들어, 김 및 Braciale 4 참조하십시오. 찬란 분류 구슬은 일상적 LDLNs 9 미립자 항원의 거래를 평가하는 데 사용됩니다. 폐에에서 LDLNs이 전송을 평가하기 위해, 형광 라텍스 구슬은 LPS와 LDLNs 24 hpi에서 분석했다 그것을 주입했다. LDLNs에서 CD11c 안녕 세포의 약 4 % 24hpi (그림 4)에서 형광 구슬을 숨겨. 이러한 대표적인 실험이 프로토콜은 효율적으로 LDLNs에 폐 후 트래픽이 그들을 흡입 항원 미립자를 얻기위한 세포를 추적하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. )는 사출 동안 쥐를 억제를위한 나무 플랫폼. 나무 블록은 각도로 절단되어 금속 막대는 앞에서 볼 그림 1A 장착되어 있었다)과 측면보기 그림 1B. 전선의 작은 조각은 마우스의 전면 incisors를 고정하는 금속 막대 주위에 상처가되었다. 리본의 조각이 절차를 수행하는 동안 장소에 그것을 유지하기 위해 마우스 주위 넥타이 플랫폼에 붙어 있 었지. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 그 주사 바늘 Gavage. gavage 주사 바늘 (오른쪽)는 분사를 위해 ~ 135 ° (왼쪽)의 각도로 구부했다. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 바실러스 anthracis을 표현하는 그것 주입 GFP (스턴 - p6GFP), 5hrs 게시물 도전을 항구 폐의 모든 CD11c + 세포의 비율입니다. AJ의 마우스는 1X로 도전했다10 8 GFP - 바실러스 anthracis 포자 및 폐가 5hrs 게시물 감염에서 분석했다. 도트 플롯은 CD11c의 비율이 표시 + 바실러스 anthracis 양성 반응이 폐 세포를. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 림프절에게 I. t 사출 다음과 같은 24 시간을 배출 폐에서 형광 구슬의 탐지 (노랑 / 녹색). AJ 마우스는 IT와 LDLNs가 24hpi 분석했다 10μg LPS (오른쪽 패널)과 PBS (왼쪽 패널) 또는 5x10 9 Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) 중 하나를 제공했다. 대표 도트 플롯은 항구 형광 구슬은 빈 채널 역모를 꾸몄다 LDLNs에서 CD11c 안녕 세포의 비율을 보여줍니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 폐에서 LDLNs에 바실러스 anthracis 포자의 인신 매매를 공부하기 위해이 프로토콜을 이용합니다. 유사한 어플 리케이션의 경우, 폐에 전달 입자의 개수는 신중하게 주입 자료가 유동세포계측법하여 LDLNs에서 검색된 수 있도록 선택하여야한다. 우리는 또한 성공적으로 세포 찬란 표시된 항체를 사용하여 특정 폐 세포 집단의 라벨링의 입양 전송을 위해이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 정기적으로 직접 폐로 10에 bleomycin (폐 섬유증의 화학적 유도)과 크린 시토킨를 관리하는 데 사용됩니다. 이 방법은 폐에에 테스트 자료의 일관성있는 전달을 허용하지만, 광범위한 교육 및 검증 (폐에 염료를 instilling하여 달성)이 필요합니다. 중요한 상호 작용과 면역 반응이 시작 될 수있는 상부 호흡기를 제외하기 때문에이 방법은 흡입의 다른 노선과 같은 생리 관련이 없을 수 있습니다. 그러나 해석은 머리와 목 지역 림프절로와 호흡...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 70μm 셀 stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아닐린 블루 </td><td> 어부 </td><td> A967 - 25 </td><td></td></tr><tr><td> 동물 먹이 바늘 </td><td> 포퍼 앤드 손즈 병원 </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase TypeIV </td><td> 워싱턴 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> 로체 </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc의 </td><td> 17,152 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼슘과 마그네슘 염화물없이 HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,170 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 HCL (100mg/ml) </td><td> Hospira 부동산 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 후두경 블레이드 </td><td> PennCentury, Inc의 </td><td> 모델 LS - 1 </td><td> 을 참조하십시오 <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> 경량 광섬유 후두경 </td><td> WelchAllyn </td><td> 80,814 </td><td></td></tr><tr><td> 레드 형광 비즈 (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> IP 주사 </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> 로이드 레버 토리스 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 intratracheal 떨어뜨림

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

이러한 폐포 macrophages 및 폐 돌기 세포 (LDCs)로 Phagocytic 세포가 지속적으로 폐에서 폐포 공간에서 항원을 샘플. LDCs는 특히 폐 배수 림프절 (LDLNs)들이 immunogens 1,2의 다양한 적절한 면역 반응을 시작 T 세포 흡입 항원을 제시 어디에.로 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다 생쥐의 폐, 공기 항원 사이의 상호 작용 모델하려면, 항원은 intratracheally 5 에어로졸 6 등 intranasally 1,3,4 관리하실 수 있습니다. 각 경로로 배달 고유 기술 기술과 실험을 설계하기 전에 고려해야 할 제한 사항을 포함한다. 예를 들어, 비강 및 aerosolized 노출은 폐와 상부 호흡기의 넓이 모두에 항원을 제공합니다. 따라서 항원 가능성이 결과의 해석을 복잡, 비강 관련 림프 조직 (NALT) 7에 액세스할 수 있습니다. 또한, 삼키는, 재채기와 마우스의 호흡 속도는 전달 복용에 불일치가 발생할 수 있습니다. 상부 호흡 트랙트의 참여가 어떤 연구를 위해 선호하는 수 있지만, 그것은 특히 폐에서 시작된 이벤트에 초점을 실험을 복잡하게하실 수 있습니다. 그것은 폐에에 직접 테스트 자료를 제공하고 NALT를 무시으로이 설정에서, intratracheal (IT) 경로가 바람직합니다. 많은 그것 주입 프로토콜은 구강이나 폐에에 액세스할 수있는 기관의 수술 노출을 통해 기관 중 시각 삽관법를 포함. 여기에, 우리는 기지에 대한 간단한, 일관성, 비 수술 방법을 설명합니다. 기관의 개통은 후두경를 사용하여 시각이며 구부러진 gavage 바늘은 다음 innoculum를 제공하는 기관에 직접 삽입됩니다. 우리는 또한 수확 및 유동세포계측법에 의해 항원 인신 매매의 분석 LDLNs 및 폐의 처리를위한 절차를 설명합니다.

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

폐포 대식세포 및 폐 수지상 세포(LDC)와 같은 식세포들은 폐의 폐포 공간으로부터 지속적으로 항원을 샘플링합니다. LDC는...

본 절차의 전반적인 목적은 가바지 바늘(gavage needle)을 사용하여 마우스의 폐에 시험 물질을 비수술적으로 주입하고, 이후 폐와 폐 배출 림프절을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 마취된 마우스의 기관에 조명 후두경과 구부러진 가바지 바늘을 삽입함으로써 수행됩니다. 그런 다음 후두경과 가바지 바늘을 통해 동물의 폐로 시험 물질을 주입합니다.다음으로 폐와 배출 림프절을 적출합니다. 마지막으로 폐와 림프절을 단일 세포 현탁액으로 처리합니다. 궁극적으로 이 방법은 시험 물질과 폐 면역 세포의 연관성 및 폐 배출 림프절로의 세포 이동에 대한 유세포 분석을 용이하게 합니다.비강 내 또는 에어로졸 노출과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 비강 관련 림프 조직을 거치지 않고 폐로 시험 물질을 직접 전달할 수 있다는 점입니다. 또한, 기관 내 제입술을 위한 쥐의 외과적 수술에 비해 수행 방법이 간단합니다. 본 절차의 시연은 Richie 연구실의 박사후 연구원인 Elizabeth Enti와 lens 연구실의 대학원생인 Manji가 진행하겠습니다.마우스를 마취시킨 후, 50 µL의 식염수에 접종물을 준비합니다. 멸균된 굽은 존대 바늘(bent gavage needle)이 장착된 1 mL 주사기에 접종물을 채웁니다. 모든 액체가 폐로 주입될 수 있도록 접종물 뒤에 100 µL의 공기층을 주사기에 넣습니다.마우스를 각도가 조절된 나무 플랫폼 위에 놓고, 전절치로 와이어에 매달리게 한 뒤 리본 끈으로 부드럽게 고정합니다. 다음으로 한 손으로 후두경을 켜고, 다른 손으로는 뭉툭한 끝을 가진 포셉을 잡습니다. 후두경의 끝부분과 포셉을 사용하여 입을 조심스럽게 벌립니다.혀를 밖으로 당겨 옆으로 고정합니다. 후두경 블레이드를 입 뒷부분을 향해 안내합니다. 기관의 입구가 보일 때까지 후두경을 90도 각도로 매우 부드럽게 눌러 유지합니다.한 손으로 후두경을 고정한 상태에서, 다른 손으로 접종액이 담긴 굽은 가바지 바늘(gavage needle)이 장착된 1 mL 주사기를 잡습니다. 바늘의 굽은 부분이 앞니 쪽에 올 때까지 바늘을 기관 내로 삽입합니다. 기포가 생기지 않도록 플런저를 일정하게 밀어 접종액을 주입합니다.가능한 한 빨리 기관에서 바늘을 뽑아냅니다. 마우스를 몇 초 동안 똑바로 세워 접종액이 폐로 흡입되도록 합니다. 마우스를 가열 램프 근처에 두고 깨어날 때까지 기다립니다.안락사 후 마우스의 팔과 다리를 해부판에 고정합니다. 가위를 사용하여 복부 중앙을 따라 절개합니다. 피부를 조심스럽게 당겨 복막을 노출시킵니다.복강 장기를 노출시키기 위해 복막에 절개창을 냅니다. 포셉으로 흉골의 끝부분을 잡고 가위로 횡격막을 뚫습니다. 가위를 해부판 표면과 평행하게 유지하며 늑골 케이지의 측면을 따라 횡격막을 절개합니다.흉강의 등쪽-배쪽 라인을 따라 양측을 약간 절개합니다. 심장 우측의 늑골을 들어 올립니다. 흉선 바로 아래에서 두 개의 림프절을 찾습니다.약간 더 큰 세 번째 림프절은 기관과 수직으로 주행하는 작은 동맥 혈관 아래에 위치합니다. 림프절을 1 mL의 림프절 소화액(lymph node digestion)에 수확하여 혼합한 후 얼음에 둡니다. 림프절을 수확한 후, 폐를 6-웰 플레이트에 수확합니다.6-웰 플레이트를 얼음 위에 둔 상태에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 핀셋과 가위를 사용하여 엽(lobe)을 작은 조각으로 자릅니다. 26 gauge 바늘로 각 림프절을 고정한 후, 두 번째 26 gauge 바늘로 이를 세밀하게 분리합니다. 모든 세포가 완전히 방출되도록 폐에는 3 mL의 소화 혼합액을, 림프절에는 1 mL를 첨가합니다.림프절은 25~30분, 폐는 37°C에서 30분 동안 배양한 후, 반응을 중단시키기 위해 각 소화 혼합물에 EDTA를 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하고 얼음 위에 둡니다. 3 mL 주사기를 사용하여 폐 조직 조각을 18 gauge 바늘로 통과시킵니다. 폐 조직 조각과 림프절을 70~100 micron 세포 체(cell strainer)로 3회 으깨어 통과시킵니다.1 mL 시린지 플런저의 뒷부분을 사용하여, 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 10 mL로 세포 스트레이너를 세척합니다. 세포 샘플을 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 적혈구 용해 버퍼 5 mL로 재현탁하고 3분 동안 배양합니다.실온에서 calcium과 magnesium이 없는 HBSS 10 milliliters를 첨가하여 용해를 중단시킨 후, 샘플을 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 폐와 폐 배출 림프절의 단일 세포 현탁액 부피를 각각 10 milliliters와 5 milliliters로 맞춥니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)와 trypan blue 배제법을 사용하여 세포 수를 측정합니다.이 두 그림에서 AJ 마우스에 1 × 10⁸개의 Bacillus anthracis 포자를 감염시켰으며, 감염 30분 후 유세포 분석법으로 폐를 분석하였습니다. 이 점 도표(dot plot)들은 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 패널들은 Bacillus anthracis 포자에 양성인 CD45 양성 CD11c 양성 폐 세포의 백분율을 나타냅니다.이 그림에서는 AJ 마우스에 기관 내 주사를 시행한 후 폐 배출 림프절을 분석하였습니다. 대표 도트 플롯은 형광 비즈를 포함하는 폐 배출 림프절 내 CD11c high 세포의 백분율을 빈 채널에 대해 도식화하여 보여줍니다. 왼쪽 패널은 PBS를 주사한 마우스의 결과이며, 오른쪽 패널은 10 µg의 LPS와 함께 5 × 10⁹개의 형광 노란색-녹색 마이크로스피어를 주사한 마우스의 결과입니다.이 방법은 폐에서 구체적으로 어떤 사건이 시작되는지, 그리고 흡입된 항원이 폐에서 배출 림프절로 어떻게 이동하는지와 같은 해당 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간 폐 질환의 상태를 본뜬 모델의 사용은 특정 질환의 병태 생리학 및 / 또는 병인을 연구 및 치료 적 개입을 개발에 중요하다. 여기에 직접 마우스의 폐에 외인성 물질을 제공 할 수있는 비 침습적 인 기관 내 삽관 방법이 제시된다.

비 침습적 기관 내 삽관 마우스 폐의 병리학 및 생리학을 연구하는

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

시약의 기관 내 삽관 매개 (IMIT) 점안 호흡기 질환뿐만 아니라 폐에 직접 치료 시약을 주액하는 방법을 연구 우수한, 비 침습적 방법이다. 이 임상 시험에 적합한 신속하고 재현성이 높은 방법이다.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

이 논문의 목적은 크게 폐암 또는 다른 병리와 설정 및 마우스 폐의 분석에 도움이 될 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 우리는 간단하고 확실하게 폐 instillations, 정착, 폐 용적 측정을 수행하는데 3 프로토콜을 제시한다.

마우스 폐 암 연구에 유용한 점안 및 고정 방법

이 문서에서는 삽관을 통해 마우스 기관에 직접 블레오 마이신 관리를위한 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 방법의 주요 장점은 마스터 높은 재현성 쉽고, 특수 장비 나 긴 회복 시간을 요구하지 않는다는 점이다.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

쥐에서 실험제의 INTracheal (IT) 투여는 종종 말단 폐에 비대칭 전달을 초래한다.  이 보고에서는, 우리는 살아있는 마우스에 있는 각 폐를 비 작동가능하게 캐뉼기 위하여 직접적인 기관내 (IB) 접근을 기술합니다.  이러한 접근법은 하나의 폐에 제제를 선택적으로 투여하기 위해 사용될 수 있거나 또는 두 폐에 대한 대칭에이전트 전달을 개선하기 위해 적응될 수 있다.

마우스 폐 내 선택적 에이전트 침착을 개선하기 위한 직접 기관내 투여

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

쥐 폐내 기관 이식(IPTT) 모델은 폐 이식 후 폐쇄성 기도 질환(OAD)을 연구하는 데 유용합니다. 높은 재현성으로 동종 이식 후 기도 소멸에서 폐 특이적 면역학적 및 혈관 형성 거동에 대한 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 IPTT 절차와 예상 결과에 대해 설명합니다.

쥐 폐내 기관 이식: 폐 이식 후 폐쇄성 기도 질환을 조사하기 위한 모델

학습하세요 마우스 폐에 비수술적 기관내 투여법을 이용한 면역세포 분석 방법을. 유동세포계측법으로 폐와 림프절의 면역세포 이동을 연구하여 호흡기 면역 반응 메커니즘을 규명합니다.

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