유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

본 절차의 전반적인 목적은 가바지 바늘(gavage needle)을 사용하여 마우스의 폐에 시험 물질을 비수술적으로 주입하고, 이후 폐와 폐 배출 림프절을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 마취된 마우스의 기관에 조명 후두경과 구부러진 가바지 바늘을 삽입함으로써 수행됩니다. 그런 다음 후두경과 가바지 바늘을 통해 동물의 폐로 시험 물질을 주입합니다.

다음으로 폐와 배출 림프절을 적출합니다. 마지막으로 폐와 림프절을 단일 세포 현탁액으로 처리합니다. 궁극적으로 이 방법은 시험 물질과 폐 면역 세포의 연관성 및 폐 배출 림프절로의 세포 이동에 대한 유세포 분석을 용이하게 합니다.

비강 내 또는 에어로졸 노출과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 비강 관련 림프 조직을 거치지 않고 폐로 시험 물질을 직접 전달할 수 있다는 점입니다. 또한, 기관 내 제입술을 위한 쥐의 외과적 수술에 비해 수행 방법이 간단합니다. 본 절차의 시연은 Richie 연구실의 박사후 연구원인 Elizabeth Enti와 lens 연구실의 대학원생인 Manji가 진행하겠습니다.

마우스를 마취시킨 후, 50 µL의 식염수에 접종물을 준비합니다. 멸균된 굽은 존대 바늘(bent gavage needle)이 장착된 1 mL 주사기에 접종물을 채웁니다. 모든 액체가 폐로 주입될 수 있도록 접종물 뒤에 100 µL의 공기층을 주사기에 넣습니다.

마우스를 각도가 조절된 나무 플랫폼 위에 놓고, 전절치로 와이어에 매달리게 한 뒤 리본 끈으로 부드럽게 고정합니다. 다음으로 한 손으로 후두경을 켜고, 다른 손으로는 뭉툭한 끝을 가진 포셉을 잡습니다. 후두경의 끝부분과 포셉을 사용하여 입을 조심스럽게 벌립니다.

혀를 밖으로 당겨 옆으로 고정합니다. 후두경 블레이드를 입 뒷부분을 향해 안내합니다. 기관의 입구가 보일 때까지 후두경을 90도 각도로 매우 부드럽게 눌러 유지합니다.

한 손으로 후두경을 고정한 상태에서, 다른 손으로 접종액이 담긴 굽은 가바지 바늘(gavage needle)이 장착된 1 mL 주사기를 잡습니다. 바늘의 굽은 부분이 앞니 쪽에 올 때까지 바늘을 기관 내로 삽입합니다. 기포가 생기지 않도록 플런저를 일정하게 밀어 접종액을 주입합니다.

가능한 한 빨리 기관에서 바늘을 뽑아냅니다. 마우스를 몇 초 동안 똑바로 세워 접종액이 폐로 흡입되도록 합니다. 마우스를 가열 램프 근처에 두고 깨어날 때까지 기다립니다.

안락사 후 마우스의 팔과 다리를 해부판에 고정합니다. 가위를 사용하여 복부 중앙을 따라 절개합니다. 피부를 조심스럽게 당겨 복막을 노출시킵니다.

복강 장기를 노출시키기 위해 복막에 절개창을 냅니다. 포셉으로 흉골의 끝부분을 잡고 가위로 횡격막을 뚫습니다. 가위를 해부판 표면과 평행하게 유지하며 늑골 케이지의 측면을 따라 횡격막을 절개합니다.

흉강의 등쪽-배쪽 라인을 따라 양측을 약간 절개합니다. 심장 우측의 늑골을 들어 올립니다. 흉선 바로 아래에서 두 개의 림프절을 찾습니다.

약간 더 큰 세 번째 림프절은 기관과 수직으로 주행하는 작은 동맥 혈관 아래에 위치합니다. 림프절을 1 mL의 림프절 소화액(lymph node digestion)에 수확하여 혼합한 후 얼음에 둡니다. 림프절을 수확한 후, 폐를 6-웰 플레이트에 수확합니다.

6-웰 플레이트를 얼음 위에 둔 상태에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 핀셋과 가위를 사용하여 엽(lobe)을 작은 조각으로 자릅니다. 26 gauge 바늘로 각 림프절을 고정한 후, 두 번째 26 gauge 바늘로 이를 세밀하게 분리합니다. 모든 세포가 완전히 방출되도록 폐에는 3 mL의 소화 혼합액을, 림프절에는 1 mL를 첨가합니다.

림프절은 25~30분, 폐는 37°C에서 30분 동안 배양한 후, 반응을 중단시키기 위해 각 소화 혼합물에 EDTA를 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하고 얼음 위에 둡니다. 3 mL 주사기를 사용하여 폐 조직 조각을 18 gauge 바늘로 통과시킵니다. 폐 조직 조각과 림프절을 70~100 micron 세포 체(cell strainer)로 3회 으깨어 통과시킵니다.

1 mL 시린지 플런저의 뒷부분을 사용하여, 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 10 mL로 세포 스트레이너를 세척합니다. 세포 샘플을 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 적혈구 용해 버퍼 5 mL로 재현탁하고 3분 동안 배양합니다.

실온에서 calcium과 magnesium이 없는 HBSS 10 milliliters를 첨가하여 용해를 중단시킨 후, 샘플을 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 폐와 폐 배출 림프절의 단일 세포 현탁액 부피를 각각 10 milliliters와 5 milliliters로 맞춥니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)와 trypan blue 배제법을 사용하여 세포 수를 측정합니다.

이 두 그림에서 AJ 마우스에 1 × 10⁸개의 Bacillus anthracis 포자를 감염시켰으며, 감염 30분 후 유세포 분석법으로 폐를 분석하였습니다. 이 점 도표(dot plot)들은 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 패널들은 Bacillus anthracis 포자에 양성인 CD45 양성 CD11c 양성 폐 세포의 백분율을 나타냅니다.

이 그림에서는 AJ 마우스에 기관 내 주사를 시행한 후 폐 배출 림프절을 분석하였습니다. 대표 도트 플롯은 형광 비즈를 포함하는 폐 배출 림프절 내 CD11c high 세포의 백분율을 빈 채널에 대해 도식화하여 보여줍니다. 왼쪽 패널은 PBS를 주사한 마우스의 결과이며, 오른쪽 패널은 10 µg의 LPS와 함께 5 × 10⁹개의 형광 노란색-녹색 마이크로스피어를 주사한 마우스의 결과입니다.

이 방법은 폐에서 구체적으로 어떤 사건이 시작되는지, 그리고 흡입된 항원이 폐에서 배출 림프절로 어떻게 이동하는지와 같은 해당 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.