유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림
May 2nd, 2011
우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목적은 개배지 바늘을 사용하여 생쥐의 폐에 물질을 비수술적으로 여전히 테스트하고 이후에 폐와 폐 배출 림프절을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 조명이 있는 후두경과 구부러진 개절 바늘을 마취된 쥐의 기관에 삽입함으로써 수행됩니다. 그런 다음 테스트 재료는 후두경과 위장 바늘을 통해 동물의 폐에 주입됩니다.
다음으로, 폐와 배출되는 림프절을 적출합니다. 마지막으로, 폐와 림프절은 단세포 현탁액으로 처리됩니다. 궁극적으로 이 방법은 테스트 재료와 폐 면역 세포의 연관성 및 세포가 폐를 배출하는 림프절로의 이동에 대한 유세포 분석을 용이하게 합니다.
비강 내 및 에어로졸 노출과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비강 관련 림프 조직을 우회하여 테스트 물질을 폐로 직접 전달할 수 있다는 것입니다. 또한 기관 설치의 수술 랫드에 비해 수행이 간단합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Richie의 연구실의 박사후 연구원인 Elizabeth Enti와 렌즈 연구실의 대학원생인 Manji입니다.
마우스를 마취 한 후 50 마이크로 리터의 식염수에 접종물을 준비합니다. 멸균 구부러진 개절 바늘이 장착된 1ml 주사기에 접종물을 채웁니다. 접종물 뒤에 100마이크로리터의 공기 주머니가 있는 주사기를 장전하여 모든 액체가 폐에 설치되었는지 확인합니다.
와이어의 앞니에 매달려 있는 각진 나무 플랫폼에 마우스를 놓고 리본 조각으로 제자리에 부드럽게 고정합니다. 그런 다음 한 손으로 후두경을 켜고 다른 손으로 뭉툭한 집게를 잡습니다. 후두경 끝과 집게를 사용하여 집게로 입을 부드럽게 들어 올립니다.
혀를 당겨 옆으로 잡습니다. 후두경 날을 입 뒤쪽으로 안내합니다. 기관 입구가 보일 때까지 후두경을 90도 각도로 매우 부드럽게 누르고 있습니다.
한 손으로 후두경을 제자리에 잡고 다른 손으로는 접종물이 들어있는 구부러진 개배지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 잡습니다. 바늘의 구부러짐이 앞니 옆에 올 때까지 바늘을 기관에 삽입합니다. 플런저를 고르게 밀어 거품 없이 접종물을 전달합니다.
가능한 한 빨리 바늘을 기관 밖으로 빼냅니다. 접종물이 폐로 흡입될 수 있도록 몇 초 동안 마우스를 똑바로 잡습니다. 마우스를 난방 램프 근처에 놓고 깨어나게 합니다.
안락사 후 마우스의 팔과 다리를 해부 보드에 고정합니다. 복부 쪽의 중앙을 따라 가위로 절개합니다. 피부를 부드럽게 당겨 복막을 드러냅니다.
복막을 절개하여 복부 장기를 노출시킵니다. 집게로 흉골 끝을 잡고 가위로 횡격막에 구멍을 뚫습니다. 해부 보드 표면과 평행한 가위로 흉곽 측면을 따라 다이어프램을 자릅니다.
양쪽의 배쪽 배쪽 라인을 따라 흉강을 약간 자릅니다. 심장 오른쪽에 있는 흉곽을 들어 올립니다. 흉선 바로 아래에서 두 개의 림프절을 찾습니다.
약간 더 큰 세 번째 림프절은 기관에 수직으로 뻗어 있는 작은 동맥 혈관 아래에 있습니다. 림프절을 1ml의 림프절 소화액으로 채취하고 섞어 얼음 위에 놓습니다. 림프절을 적출한 후 폐를 6개의 웰 플레이트로 채취합니다.
6개의 웰 플레이트를 얼음 위에 놓고 PBS를 흡인하고 집게와 가위를 사용하여 엽을 작은 조각으로 자릅니다. 26 게이지 바늘로 각 림프절을 잡고 두 번째 26 게이지 바늘로 림프절을 분리하십시오. 모든 세포의 방출을 보장하려면 폐에 3ml의 소화 혼합물을 추가하고 림프절에 1ml를 추가합니다.
림프절을 25-30분 동안 배양하고 폐를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후, 각 소화 혼합물에 최종 농도 10밀리몰에 EDTA를 첨가하여 반응을 멈춘 다음 얼음 위에 놓습니다. 3밀리리터 주사기를 사용하여 18게이지 바늘에 폐 조각을 통과시킵니다. 70-100미크론 세포 여과기를 통해 폐와 림프절 조각을 세 번 으깬다.
1ml 주사기 플런저의 뒤쪽 끝을 사용하여 칼슘 및 마그네슘 원심분리기가 없는 HBSS 10ml로 세포 여과기를 세척합니다. 세포는 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 500배에서 샘플링합니다. Reese's는 펠릿을 5ml의 적혈구 용해로 구부리고 완충액을 주입한 다음 3분 동안 배양합니다.
실온에서 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 10ml를 첨가하여 500배 중력에서 샘플을 5분 동안 용해 원심분리하여 담금질합니다. 폐와 폐를 배출하는 림프절, 단세포 현탁액을 각각 10ml와 5ml로 가져옵니다. 혈구 분석기에서 triam blue exclusion을 사용하여 세포 계수를 수행합니다.
이 두 그림에서 AJ 마우스는 8번째 basillas rassis 포자에 10 곱하기 도전하고 폐는 감염 후 30분에 유세포 분석으로 분석했습니다. 이 점도표는 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 패널은 바실러스 탄저균 포자에 대해 양성인 CD 45 양성 CD 11 C 양성 폐 세포의 비율을 보여줍니다.
이 그림에서는 AJ 마우스를 기관내로 주입한 다음 폐를 배출하는 림프절을 분석했습니다. 대표적인 점도표는 폐 배출 림프절에서 형광 구슬이 있는 CD 11 C 높이의 세포가 빈 채널에 대해 플롯된 비율을 보여줍니다. 왼쪽 패널은 PBS를 주입한 마우스의 결과를 보여주고, 오른쪽 패널은 10마이크로그램의 LPS를 가진 밝은 노란색 녹색 마이크로스피어인 9개의 플로라에 5배의 10을 주입한 마우스의 결과를 보여줍니다.
이 방법은 폐에서 어떤 사건이 구체적으로 시작되는지, 흡입된 항원이 폐에서 배출되는 림프절로 어떻게 전달되는지와 같은 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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개요
이 기사는 마취된 마우스의 기관을 통해 폐에 시험 물질을 전달하는 비외과적 방법을 설명합니다. 이 기술은 다양한 물질에 대한 노출을 허용하고 후속 폐 면역 세포 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 면역학
- 호흡기 생물학
배경
- 폐 면역 반응을 이해하는 것은 치료법 개발에 중요합니다.
- 기존 방법은 침습적인 절차를 포함할 수 있습니다.
- 이 기술은 더 안전하고 효율적인 테스트를 가능하게 합니다.
- 유세포 분석은 면역 세포 상호 작용을 분석하는 핵심 도구입니다.
연구 목적
- 시험 물질에 대한 폐 노출의 비외과적 방법을 개발합니다.
- 시험 물질과 폐 면역 세포의 연관성을 분석합니다.
- 폐 배수 림프절로의 면역 세포 이동을 연구합니다.
사용된 방법
- 발광 후두경과 굽은 주사 바늘을 기관에 삽입합니다.
- 후두경을 통해 시험 물질을 폐에 주입합니다.
- 폐와 배수 림프절을 추출합니다.
- 분석을 위해 조직을 단일 세포 현탁액으로 처리합니다.
주요 결과
- 다양한 시험 물질을 폐에 성공적으로 전달합니다.
- 폐 면역 세포의 유세포 분석을 용이하게 합니다.
- 림프절로의 면역 세포 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 폐 연구를 위한 비침습적 접근법을 시연합니다.
결론
- 이 방법은 폐 연구에 귀중한 도구를 제공합니다.
- 이는 폐에서 면역 반응에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 이 접근법은 개선된 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This non-surgical intratracheal instillation method enables precise delivery of test materials directly to the lungs, bypassing upper respiratory tract confounders. It supports mechanistic de-risking in immunology and respiratory drug discovery by enabling quantitative analysis of antigen trafficking and immune cell engagement. The approach enhances predictive confidence in target validation and preclinical model relevance for inhaled therapeutics and vaccines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating lung-specific immune responses from nasal-associated lymphoid tissue interference.
- Operational Value: Provides reproducible delivery of antigens or compounds to lungs for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in antigen presentation and T-cell activation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable flow cytometry readouts of test material association with lung immune cells and trafficking to draining lymph nodes.
- Operational Value: Standardizes tissue processing into single-cell suspensions for high-throughput immunophenotyping.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of immunomodulators or vaccine candidates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human lung antigen exposure and immune cell migration to lymph nodes for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causal relationships between lung exposure and immune activation, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on quantitative immune trafficking data from lungs to lymph nodes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical immunology studies, particularly for inhaled biologics and small molecules.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lung-specific immune initiation and pathway clarification of antigen-presenting cell activation.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantitative outputs for comparing test material immunogenicity.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements of cell-associated antigen and trafficking kinetics to inform comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects lung immune events to preclinical validation via lymph node trafficking, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lung exposure platform across immunology, infectious disease, and respiratory therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in lung immune responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of lung exposure and immune analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in immunology pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on lung-specific immune trafficking and target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, surgical preparation, and tissue dissection for consistent tracheal access.
- Dependent on laryngoscopy equipment, bent gavage needles, and sterile inoculation supplies for reliable delivery.
- Necessitates standardized tissue digestion and flow cytometry protocols across teams for reproducible immune profiling.
- Adaptation considerations include varying inoculum volumes and digestion times across mouse strains or disease models.
- Practical limitations include technical skill dependency for tracheal visualization and potential variability in inoculum distribution.
