Name: ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 E. coli에서 ToxR 리포터를 이용한 단일 통과형 막횡단 도메인의 올리고머화 성향 분석 방법입니다. 이 기법은 자연스러운 인지질 이중막 환경에서 막 단백질 상호작용을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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우리는 국립 보건원을 (1R21CA138373 감사하고이 작품의 재정 지원을위한 암 (SU2C)에 일어나. HY은을 위해 시드니 킴멀 재단에서 암 연구, 킴멀 학술 상을 미국의 협회에서 2009 Elion 수상에 감사합니다 암 연구 (SKF - 08-101) 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 학부 조기 채용 수상 (NSF0954819).

1. 복제 고려 사항 <ol><li> NheI과 BamHI 제한 사이트와 5' - phosphorylated 둘러싸인 관심 TMD를 대표하는 상업 준비 oligonucleotides는 pTox7 (직접 BamHI 제한 사이트 14 차례의 기본 쌍 삽입하여 연구실에서 수정) (그림 3) 순차적으로 소화에 출혈도 잡았 수 있습니다 BamHI과 NheI와 함께. 예제 oligonucleotide는 다음과 같습니다 : 5'ctagcTMDSEQUENCEg3 ' 3 'gTMDSEQUENCEcctag5' </li></ol> TMD 순서는 12-24 잔류물 (짧은 시퀀스는 아마도 벡터 인코딩 소수성의 잔류물로 길쭉한합니다)해야합니다. 순차 잔여 삽입 및 ToxR에 TMD 상대의 회전에 수반하는 잔류 삭제 결과가. 15,16가 마지막으로 arabinose 농도가 0.001와 0.01 % 사이에서 다양 있어야 할 곳에 인터페이스를 조사하기 위해, TMD 디자인 네 가지 변종이 만들어되어야합니다 (W / V) 다른 TMD 시퀀스 사이의 β - galactosidase 신호의 최대 차이가 관찰되는 농도를 확인하기 위해, 다양한 표현 수준을 테스트하는 것은 다른 동질성이 가장 구분할 수있는 아래의 조건을 확인하는 것이 좋습니다. arabinose와 항생제 이외에도, 0.4 MM의 IPTG는 여러 TMDS 간의 동질성의 차이를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. ToxR 측정은 최소한 사통으로 작성된 수행해야합니다. 전체 절차는 서로 다른 플라스미드 변환 최소한 세 번 반복해야합니다. 2. 세균성 문화의 성장 <ol><li> 부드럽게 15 ML 문화 튜브에 얼음과 송금에 FHK12 유능한 세포를 (200 μl) 해동. 플라스미드 DNA (200 NG)를 추가하고 30 분 얼음에 세포를 품어. </li><li> 42 90 s에 대한 부화하여 열 충격 세포 ° 2 분 얼음 부화 다음 C. </li><li> SOC 미디어 (800 μl) 추가하고 37 샘플을 품어 ° C 하나 H.위한 (300 RPM) 잡고 </li><li> 세중의 15 ML 문화 튜브의 변형 혼합물 50 μl와 chloramphenicol (30 μg / ML)와 arabinose (0.0025 % W / V) 5 ML의 LB 미디어의 예방. 37 샘플을 품어 ° C를 20 H.위한 (300 RPM) 잡고 (또는 문화의 5 μl은 96 - 웰 플레이트에 중간 100 μl를 예방하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플의 큰 숫자를 처리 할 때이 방법은 유용합니다, 오류가 약간 높을 수 있지만. 이어질 것이 증발을 방지하기 위해 오류 매체와 가장 바깥쪽 우물을 채우기지만, 샘플을 사용하지 않는합니다. 마지막) 뚜껑과 parafilm와 접시 사이에 공동을 두 번 포장. </li></ol> 3. β - galactosidase 활동의 측정 <ol><li> 앞서 열을 가하다 판 - 리더 28 ° C. </li><li> 상단 (수성) 계층만을 차지해야하고, 대형 피펫 팁있는 저수지로 Z - 버퍼를 전송합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 신선한 Z-buffer/chloroform 100 μl을 전송합니다. 사통으로 작성된 접시의 우물에 각 문화의 5 μl을 전송합니다. 빈 될 것입니다 푸르 웰스의 문화를 생략하십시오. </li><li> 세포 밀도를 결정하기 위해 접시의 OD를 측정 595. </li><li> 접시의 모든 우물을 Z-buffer/SDS 50 μl를 추가합니다. 세포를 lyze 10 분 접시 - Reader에서 접시를 흔들어. 셀 suspensions이 용해 후 명확한지, 그리고 필요한 경우 흔들림이 단계를 반복 있는지 확인하십시오. 불완전 용해는 Z-buffer/chloroform가 신선한 아니었 제안합니다. </li><li> 갓 모든 우물을 Z-buffer/ONPG 준비 50 μl를 추가, 20 분 매 30의 플레이트 리더와 측정 OD 405에 접시를 반환합니다. </li><li> 다음 방정식을 (를 비워 뺄 기억)를 사용하여 β - galactosidase 활동을 계산합니다. OD 405 / 분의 비율은 선형 모델 적합을 사용하여 1.0 OD 405 범위 0.0의 모든 데이터 요소를 사용하여 계산해야합니다. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="방정식 1"> 다른 일에 기록된 때 밀러 단위 때로는 다릅니다. 그러므로, GPA와 같은 참조 구조는 각 시험에서 측정해야합니다. 그 값은 ToxR 값의 정상화를 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 4. 단백질 표현을위한 컨트롤 <ol><li> 서양은 구조 사이에도 단백질 발현을 확인하기 위해 모래 바닥 수행합니다. microcentrifuge에 세중의 문화와 원심 분리기 50 μl (2000 RPM, 4 분)을 결합합니다. pipetting하여 표면에 뜨는를 제거하고 2 X 샘플 로딩 버퍼에 잔류 펠렛을 resuspend. </li><li> 표준 8 % 겔에서 7.5 μl를로드 1 시간당 5 분 125 V에서 electrophoreses를 수행합니다. 전송 후, 안티 MBP HRP - 복합 항체와 부화 및 시각화, 키메라 단백질은 때로는 48 KDA 주위에 본 몇 가지 열화 제품과 약 70 KDA에서 관찰됩니다. 내생 MBP도 (그림 5 참조) 45 KDA에서 관찰됩니다. </li></ol>5. 적절한 막 삽입에 대한 제어 말토오스 결합 단백질에 부족한 세포 라인은 키메라 TMD 구조의 적절한 막 삽입을 평가하는 데 사용됩니다. 유일한 탄소 소스로 말토오스 최소한의 미디어에 성장하는 경우에만 세포가 제대로 periplasm에있는 말토오스 결합 단백질과 막 - 필수 표현 제품을 표현이 성장 할 수 있습니다. <ol><li> PD28 세포를합니다 (FHK12 세포에 대한 설명) 변환 및 LB 매체 2 ML의 예방. 37 세포를 성장 ° C를 하루 (300 RPM) 잡고. </li><li> 펠렛은 3,500 rpm으로 원심 분리하여 세포를, 10 분, 4 ° C와 큰 팁 또는 부드러운 vortexing와 부드러운 pipetting하여 PBS (2 ML)에 resuspension로 씻으십시오. 펠렛 전지 (위)를, 두 번째 시간을 PBS로 세척 펠릿 그리고 마지막으로 PBS (1 ML)에 resuspend. </li><li> 37 세중의와 부화 5 ML 최소한의 미디어를 예방 resuspended 세포의 25 μl를 사용 ° C를 (300 RPM) 잡고. 15-25 H, 접시 - 판독기를 사용하여 96 - 웰 플레이트와 읽기에 각 시료 200 μl를 전송로 약 2 시간마다 사이 OD 595 수치를 가져가라. </li></ol> 6. 대표 결과 : 그림 4에 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향을 분석 ToxR transcriptional 기자 분석의 사용 예. 이전부터 우리가 transmembrane 도메인의 oligomerization를 조사 multispanning 멤브레인 - 필수 단백질 잠재 막 단백질 - 1 ToxR 등 다양한 기술에 의해 (LMP - 1) 14 Transmembrane 도메인 오 (TM5)가 oligomerize에 강한 성향을 전시 표시되었다.; 이것은 긍정적인 제어 비교 높은 밀러 유닛, GPA, 잘 설립 dimerizing 순서에 의해 입증됩니다. TM5, D150A에 해로운 돌연변이 oligomerize에 순서의 능력을 감소시킵니다. LMP - 1 TM1 크게 oligomerize하지 않으며 단지 빈 아닌 변화 FHK12 세포의 신호 위에 매우 낮은 밀러 단위 신호를 전시하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 카툰은 ToxR 기자 분석을 묘사한. Transmembrane 도메인 (TMD)는 ToxR와 LacZ의 전사 활성화의 dimerization에 oligomerization 결과를 구동. LacZ 유전자의 제품은, β - galactosidase는 oligomerize에 대한 TMD의 성향의 측정으로 계량하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 빛을 흡수 종 O - nitrophenolate (ONP)의 생산에 β - galactosidase 결과에 의해 ONPG의 가수 분해 절단. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. pToxR7의 플라스미드지도. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 대표 ToxR transcriptional 기자 분석은 잠재된 막 단백질 - 1 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향을 분석. transmembrane 도메인 1 (TM1)는 단지 약한 상호 작용을 전시 반면 Transmembrane 도메인 5 (TM5)은 강하게 oligomerizes. TM5에서 돌연변이의 D150A 상당히 oligomerize하기 위해 능력을 감소시킵니다. GPA는 강한 dimerization에 대한 긍정적인 제어 순서로 포함되어 있습니다. 빈은 untransformed FHK12 세포를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 단백질 발현을위한 서양 얼룩. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. periplasm에 올바른 막 삽입에 대한 제어 PD28 complementation 분석. 대조군은 말토오스 결합 단백질에 결함 구조를 나타냅니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

ToxR transcriptional 기자 분석은 oligomerize 수있는 잠재력을 지닌 transmembrane 시퀀스를 식별하는 손쉬운 방법입니다. 상호 작용은 세균 내부 멤브레인 내에서 발생하기 때문에,이 분석은 멤브레인 - 모방 환경에서 공부하는 시스템의 유효성과 관련된 문제를 circumvents. 하나의 플라스미드에 여러 개의 TMDS의 복제가 쉽게 병렬로 할 수 있으며, 전체 분석이 96 - 웰 플레이트 형식으로 진행 될 수 감안할 때,이 분석은 단백질 시퀀스 다수의 높은 처리량 분석에 사용할 수 있습니다. 17 번 상호 작용이 발견되었습니다, 주요 기능 잔류물은 관련된 구조적 기능의 매핑을 허용, mutational 분석에 의해 심문 수 있습니다. 대부분의 경우, transmembrane 단백질의 crystallographic 분석 함수의 분자 기초를 확립하기 위해 ToxR 분석과 같은 다른 도구를 필요로하는, 문제가있다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> BamHI 제한 효소 </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen 효소는 다른 공급 업체보다 더 효율적으로 발견되었습니다 </td></tr><tr><td> NheI 제한 효소 </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen 효소는 다른 공급 업체보다 더 효율적으로 발견되었습니다 </td></tr><tr><td> 15 ML 문화 튜브 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 14-956 - 1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC 미디어 </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> 적절한 볼륨까지 만들어 autoclaving 소독. </td></tr><tr><td> LB 미디어 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L7275 </td><td> 적절한 볼륨까지 만들어 autoclaving 소독. </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> CO 3 78 </td><td> 에탄올 30 MG / ML의 주식 솔루션은 냉동고에 저장 </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10,839 </td><td> 물에 2.5 %의 주식 솔루션 (W / V)는 냉동고에 저장 </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt 화학 </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 63,138 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecylsulfate (SDS) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - Nitrophenyl β - D - galactopyranoside (ONPG) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 73,660 </td><td></td></tr><tr><td> Z - 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 16.1 g 나 2 HPO 4 5.5g 아니 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 1리터, 산도 7.0까지 확인 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ML β - 메르 캅 토 에탄올, 2 ML 클로로포름은 Z - 버퍼 20 ML까지합니다. 800 rpm으로 1 분 1 분, 원심 분리기에 대한 소용돌이. 각 접시 신선합니다. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 MG SDS는 10 ML Z - 버퍼에 용해 </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 10 ML Z - 버퍼 40 MG ONPG. 각 접시 신선한 확인 </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 MBP 단클론 항체 (HRP 복합) </td><td> 코 </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> 말토오스와 거의 미디어 </td><td></td><td></td><td> 1 X M9 소금, 0.4 %의 말토오스, 1 MG / ML 티아민, 2 MM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 플랫 바텀 플레이트 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> 플레이트 - 리더 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> DTX880 다중 검출기 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> 배양기를 흔들어 </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

toxr 분석에 의해 결정 transmembrane 도메인 oligomerization의 성향

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

disproven되어 이후 단백질 transmembrane 도메인의 oversimplified 전망은 단순히 인지질의 bilayers의 앵커 오래되었습니다. 많은 경우에 막 - 스패닝 단백질 행동의 고도로 복잡한 메커니즘을 발전시켜 왔습니다. 막 단백질들의 구조와 기능을 조절 할 수있는 1-3 편도는 구조 transmembrane의 oligomers를 형성, 소수성의 나선의 직접적이고 구체적인 접촉하는 것입니다. 4,5 대부분 최근이 작업은 우선적으로 수용액 및 드라이브 단백질 협회. 6,7는 그럼에도 불구하고, 단백질의 transmembrane 도메인에서 분자 인식 연구가 계속 중 그 뒤에 lags하는 다른 분자간 부대 비교 멤브레인 환경에서 발견된 아미노산의 분포에 초점을했습니다 수용성 지역. 주요 장애물은 남아있다 : 놀라운 특이성과 transmembrane의 oligomerization 얻을 수있는 친화력에도 불구하고, 그들의 협회 8 직접 측정은 도전입니다. 통합 멤브레인 단백질 기능 연구에 적용된 전통 방법론은 시험에서 시퀀스의 고유 불용성에 의해 방해하실 수 있습니다. transmembrane 도메인을 나타내는 합성 펩티드를 공부에서 얻은 통찰력 Biophysical 유용한 구조적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나 세제 micellar이나 세포 세포막을 모방하는 이러한 연구에 사용되는 리포좀 시스템의 생물 학적 관련은 종종 의문이며 펩티드는 이러한 조건 하에서 원시와 같은 구조를 채택하고 그들의 기능 동작은 진정한 네이티브 막 내에서 동작의 모드를 반영하지 ? 천연 인지질의 bilayers의 transmembrane 시퀀스의 상호 작용을 연구하기 위해 Langosch 실험실 ToxR transcriptional 기자 assays을 개발했습니다. 관심사 9 transmembrane 도메인이 periplasm 및 ToxR에 위치 말토오스 결합 단백질과 키메라 단백질로 표현되는 보고서를 제공하는 oligomerization의 수준 (그림 1). 지난 10 년, 여러 다른 그룹 (예 : Engelman, DeGrado, 샤이)는 더욱 최적화하고 ToxR 기자 분석을 적용. 10-13 다양한 ToxR의 assays는 세포 점막에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하는 황금 표준이되었습니다. 우리는 여기에 주로 Langosch에 의해 개발된 프로토콜을 따르는 우리 연구실에서 수행 전형적인 실험 작업을 보여줍니다. 이것은 일반적으로 적용되는 방법은 E.에 transmembrane 도메인 자체 협회의 분석에 유용합니다 β - galactosidase 생산이 TMD oligomerization의 성향을 평가하는 데 사용됩니다 대장균. TMD 유도 dimerization시, ToxR은 β - galactosidase에 대한 LacZ 유전자의 최대 규제를 일으키는 CTX업자에 바인딩합니다. colorimetric 판독이 lyzed 세포 ONPG를 추가하여 얻을 수 있습니다. 빛을 흡수 종 O - nitrophenolate (ONP) (그림 2)의 생산에 β - galactosidase 결과에 의해 ONPG의 가수 분해 절단.

단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, - galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

단백질 transmembrane 도메인을 단순히 인지질 이중층의 앵커로만 보는 과도하게 단순화된 관점은 오래전에 이미 틀렸음이 입증되었습니다. 많은 경우...

다음 실험의 전반적인 목적은 천연 막 환경에서 단백질, transmembrane domains 또는 TMD의 리간드화(ligamentization) 경향을 조사하는 것입니다. 이는 관심 있는 transmembrane domain을 e coli에서 periplasm으로 국소화하기 위한 maltose binding protein 및 전사 리포터인 tox R과 결합된 융합 단백질로 발현함으로써 달성됩니다. transmembrane domain에 의해 유도된 리간드화는 tox R의 이량체화를 유도하고 LXi 전사를 활성화합니다. 두 번째 단계로 세포를 용해하고 ONPG로 처리하며, 이는 beta galacto에 의해 빛을 흡수하는 종인 O nitro pholate 또는 ONP로 가수분해됩니다.다음으로, 405 nanometers에서 빛의 흡광도를 측정하여 ONP 수준을 정량화합니다. transmembrane domain의 수준을 결정하기 위해, 리간드화 결과는 tox R 리포터 어세이를 기반으로 transmembrane domain의 리간드화 성향을 나타냅니다. SDS page나 형광 분석과 같은 기존의 생물물리학적 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세제와 같은 막 모방 시스템이 아니라 e coli 내에서의 발현을 통해 천연 인지질 이중층에서 transmembrane domain의 거동을 연구할 수 있다는 점입니다.이 방법은 transmembrane Helix Association에 관여하는 주요 구조적 특징의 규명과 같이 막 단백질 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, NHE I 및 BamH I 제한 효소 부위로 둘러싸인 관심 TDS를 나타내는 상업적 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 필요한 chimeric protein을 발현하는 pET-28a 플라스미드를 준비합니다. 플라스미드가 준비되면 fhk 12 competent cells를 얼음 위에서 천천히 해동합니다. 해동이 완료되면 세포를 1.5 mL 배양 튜브로 옮기고, 각 튜브에 200 ng의 각 플라스미드 DNA를 넣은 후 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 세포를 42 °C에서 90초 동안 열 충격 처리하고, 800 µL의 SOC 배지를 넣은 상태로 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다. 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 흔들어 배양한 후, 15 mL 배양 튜브를 사용하여 샘플당 3회 반복으로 chloramphenicol과 aose가 포함된 5 mL의 LB 배지에 형질전환 혼합물 50 µL를 접종합니다. 마지막으로, 샘플을 37 °C에서 20시간 동안 흔들어 배양합니다. 모든 리가네이션을 측정하기 위해 TDS beta galactotase 활성을 결정합니다.먼저, 플레이트 리더를 28 °C로 예열합니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 Z 버퍼 스톡을 사용하여 신선한 Z 버퍼 용액을 준비합니다. Z 버퍼 클로로포름의 상층 수성층만 파이펫으로 취하여 튜브에서 리저버로 옮깁니다.정확한 피펫팅 전송을 위해 그리드가 그려진 종이 위에 96-웰 플레이트를 놓습니다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 Z buffer chloroform을 넣고, 이어서 각 배양액 5 µL를 4중(quad)으로 분주합니다. 공시료(blank)로 사용할 4개의 웰에서는 배양액을 제외합니다. 플레이트의 OD 595를 측정하여 세포 밀도를 결정합니다.플레이트의 모든 웰에 50 µL의 Z buffer SDS를 추가합니다. 그런 다음, 세포를 용해시키기 위해 플레이트 리더기에서 10분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 세포 용해 후, 모든 웰에 ONPG용 ZPA 50 µL를 추가합니다. 플레이트를 다시 플레이트 리더기에 넣고 20분 동안 30초 간격으로 OD 405를 측정합니다.공시료(blank)로 표준화한 Miller unit 계산을 통해 베타-락타마제(beta lactamase) 활성 수준을 결정합니다. 컨스트럭트 간의 단백질 발현이 동일한지 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 먼저, 3회 반복 배양액 50 µL를 혼합한 후 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 원심분리합니다.피펫팅으로 상층액을 제거하고 재현탁합니다. 잔류 펠렛을 2x 샘플 로딩 버퍼에 현탁하고, 표준 8% 젤에 각 샘플을 7.5 µL씩 로딩한 후 125 V에서 1시간 5분 동안 전기영동을 수행합니다. 전이 후, 멤브레인을 anti M-V-P-H-R-P 접합 항체와 함께 배양하여 키메라 단백질을 시각화합니다. 키메라 단백질은 약 70 kDa에서 관찰되며, 때로는 48 kDa 주변에서 일부 분해 산물이 관찰되기도 합니다.내인성 MVP는 45 kilodaltons에서도 관찰됩니다. 키메라 TMD 컨스트럭트의 적절한 막 삽입 여부를 평가하기 위해, 말토스 결합 단백질이 결핍된 PD 28 세포주를 사용합니다. 말토스를 유일한 탄소원으로 하는 최소 배지에서 배양할 때, 말토스 결합 단백질이 페리플라즘에 정확하게 위치한 막 통합 발현 생성물을 발현하는 세포만이 성장할 수 있습니다. fhk 12 세포와 동일한 방법으로 PD 28 세포를 형질전환하고 2 mL의 LB 배지에 접종하십시오.배양 후 37°C에서 300 RPM으로 진탕 배양하며 세포를 하룻밤 동안 성장시킵니다. 원심분리를 통해 세포를 침전시키고, 2 mL의 PBS로 재현탁한 후 큰 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 세척합니다. 침전 후, PBS로 세포를 두 번째로 세척하고, 마지막으로 원심분리를 수행한 다음 1 mL의 PBS에 재현탁합니다.재현탁한 세포 25 µL를 사용하여 5 mL의 최소 배지에 접종합니다. 세포를 37 °C에서 15시간 동안 진탕 배양합니다. 각 시료 200 µL를 96-웰 플레이트에 옮기고, 플레이트 리더를 사용하여 OD 595 값을 측정합니다.이 과정을 25시간까지 2시간마다 반복합니다. 다중 막 관통 막 내재성 단백질인 latent membrane protein one의 개별 막 관통 도메인들의 전체적인 리가라이제이션 성향을 tox R 전사 리포터 분석법을 사용하여 분석하였습니다. 막 관통 도메인 5는 양성 대조군인 잘 알려진 이량체화 서열 GPAA와 유사하게 높은 밀러 단위(Miller units)를 보여 강한 리가라이제이션 성향을 나타냅니다.막 관통 도메인 5의 D150A 유해 돌연변이는 해당 서열의 LMP1 결합 능력을 감소시킵니다. TM1은 유의미하게 결합하지 않으며, 형질전환되지 않은 FHK 12 세포인 공백(blank) 시료의 신호보다 약간 높은 매우 낮은 Miller unit 신호를 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 관심 있는 막 관통 헬릭스가 천연 막 환경에서 고차 복합체를 형성하는 능력이 있는지 판단하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 큰 오차를 방지하고 기포가 유입되지 않도록 96웰 플레이트에 매우 주의해서 피펫팅하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

다이나민 슈퍼패밀리 단백질의 기능은 GTP 가수분해와 결합된 구조적 변화에 의존합니다. 시스템은 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 dynamin-like GTPase atlastin의 구조적 역학을 모니터링하기 위해 smFRET(single-molecule FRET) 기술을 사용하여 설명됩니다.

Dynamin-like GTPase Atlastin의 구조적 역학을 관찰하기 위한 Single-molecule FRET 이미징

배우세요 E. coli에서 ToxR 리포터를 이용한 단일 통과형 막횡단 도메인의 올리고머화 성향 분석 방법입니다. 이 기법은 자연스러운 인지질 이중막 환경에서 막 단백질 상호작용을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

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