ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

다음 실험의 전반적인 목표는 자연막 환경에서 단백질, 막관통 도메인 또는 T MD의 인대화 성향을 조사하는 것입니다. 이는 대장균에 대한 관심 있는 막관통 도메인을 말토스 결합 단백질이 있는 키메라 단백질로 발현하여 주위 플라스m 및 독소에 국소화함으로써 달성됩니다. 전사 리포터로서의 R, 막관통 도메인 유도 인대화는 독소 R의 이합체화와 LXi 전사의 활성화를 초래합니다 두 번째 단계로 세포를 용해하고 ONPG로 처리하며, ONPG는 베타 갈락토에 의해 광흡수 종 O 니트로 폴레이트 또는 ONP로 가수분해됩니다.

다음으로 ONP 수준은 405나노미터에서 빛의 흡광도를 측정하여 정량화됩니다. 막관통 영역의 수준을 결정하기 위해 인대화 결과는 tox R 리포터 분석을 기반으로 막관통 도메인의 인대화 성향을 나타냅니다. SDS 페이지 또는 형광과 같은 기존 생물물리학적 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 막관통 도메인의 거동이 세제와 같은 막 모방 시스템이 아닌 대장균에서 발현에 의해 천연 인지질 이중층에서 연구된다는 것입니다.

이 방법은 막관통 나선 연관(transmembrane Helix Association)과 관련된 주요 구조적 특징의 해명과 같은 막 단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 프로토콜이 시작되기 전에 필요한 키메라 단백질을 발현하는 7개의 플라스미드가 상업적으로 합성된 올리고뉴클레오티드에서 준비되며, 이는 NHE 1 및 BMH 1 옆에 있는 관심 TDS를 나타냅니다. 플라스미드를 준비한 후 제한 부위: fhk 12 유능 세포를 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다. 해동된 후 세포를 각 혈장 DNA 200나노그램의 15ml 배양 튜브에 넣고 별도의 튜브로 옮기고 얼음 위에서 30분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 섭씨 42도에서 90초 동안 세포를 열 충격을 가한 다음 800마이크로리터의 SOC 배지에서 2분 동안 얼음 위에서 배양하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 샘플을 배양한 후 1시간 동안 진탕하여 클로람페니콜 및 아오스를 함유한 LB 배지 5밀리리터에 15밀리리터 배양 튜브를 사용하여 각 샘플에 대해 3회씩 형질전환 혼합물 50마이크로리터를 접종합니다. 마지막으로 섭씨 37도에서 20시간 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다. TDS 베타 갈락토 타제 활성의 모든 인대를 측정하기 위해 측정됩니다.

먼저 플레이트 리더를 섭씨 28도로 예열합니다. Z 버퍼 스톡을 사용하여 서면 프로토콜에 설명된 대로 새로운 Z 버퍼 용액을 준비합니다. Z 버퍼 클로로포름을 튜브에서 저장소로 옮기고 Z 버퍼 클로로포름의 상부 수성층만 파이프로 연결하도록 합니다.

플레이트를 격자가 그려진 종이 위에 올려 100마이크로리터의 Z 버퍼 클로로포름을 96웰 플레이트의 각 웰로 정확하게 옮긴 다음 각 배양액 5마이크로리터를 쿼드로 정확하게 옮깁니다. 중복: 공백 역할을 할 4개의 우물에서 배양을 생략합니다. 플레이트의 OD 5 95를 측정하여 세포 밀도를 측정합니다.

플레이트의 모든 웰에 50마이크로리터의 Z 버퍼 SDS를 추가합니다. 그런 다음 플레이트 리더의 플레이트를 10분 동안 흔들어 ONPG용 ZPA 50마이크로리터에서 세포 용해 후 세포를 모든 웰로 가열합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 다시 넣고 4분 동안 30초마다 OD 0 5를 20초 간격으로 측정합니다.

beta lacto sase 활성의 수준을 블랭크로 정규화하는 Miller 단위의 계산을 통해 결정합니다. 웨스턴 블로팅(western blotting)은 구성물 간의 등가 단백질 발현을 확인하기 위해 수행됩니다. 먼저, 50마이크로리터의 3중 배양액을 결합한 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 원심분리합니다.

피펫팅과 소생술로 상층액을 제거합니다. 잔류 펠릿을 2개의 샘플 로딩 버퍼에 현탁하고, 표준 8% 겔에 각 샘플 7.5마이크로리터를 로드하고, 이송 후 1시간 5분 동안 125볼트에서 전기영동을 수행합니다. 키메라 단백질을 시각화하기 위해 항 M-V-P-H-R-P 접합 항체로 멤브레인을 배양하면 약 70 킬로달톤에서 관찰되며 일부 분해 산물은 때때로 약 48 킬로달톤에서 관찰됩니다.

내인성 MVP는 또한 45킬로달톤에서 관찰됩니다. 키메라 TMD 구조체의 적절한 멤브레인 삽입을 평가하기 위해, 맥아당 결합 단백질 결핍 PD 28 세포주는 맥아당이 유일한 탄소원인 최소 배지에서 성장할 때 사용되며, 말토스 결합 단백질이 peri plasm에 올바르게 위치한 멤브레인 통합 발현 산물을 발현하는 세포만 성장할 수 있습니다. fhk 12 세포에 대해 기술된 바와 같이 PD 28 세포를 형질전환시키고 2밀리리터의 LB 배지를 접종합니다.

배양 후 밤새 300RPM으로 흔들면서 섭씨 37도에서 세포를 성장시킵니다. 원심분리로 세포를 펠렛화하고 Resus 현탁액으로 2ml의 PBS로 세척하고 큰 팁으로 부드러운 피펫팅을 합니다. 펠릿화 후, 세포는 다시 PBS로 두 번째로 세척한 다음 1ml의 PBS에서 최종 원심분리 및 재현탁액을 수행합니다.

25마이크로리터의 재현탁 세포를 사용하여 5ml의 최소 배지를 접종합니다. 섭씨 37도의 세포를 15시간 동안 흔들면서 배양합니다. 각 샘플 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트 리더를 사용하여 OD 5 9 5 판독값을 취합니다.

25시간까지 2시간마다 이 과정을 반복합니다. multis spanning membrane integral protein latent membrane protein one에서 개별 transmembrane domain의 모든 인대화 성향을 tox R transcriptional reporter assay를 사용하여 분석했습니다. Transmembrane domain 5는 높은 Miller 단위에서 입증된 바와 같이 liga 상승에 대한 강한 경향을 나타내며, 이는 positive control GPAA의 잘 정립된 이합체 서열과 유사합니다.

transmembrane domain five D one 50 A의 유해한 돌연변이는 모든 liga 상승 LMP one에 대한 서열의 능력을 감소시키고, TM one은 모든 liga 상승을 현저하게 하지 않으며 non transformed FHK 12 cells인 blank 신호 바로 위에 매우 낮은 Miller unit 신호를 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 transmembrane helix가 자연막 환경에서 더 높은 차원의 복합체를 형성할 수 있는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 큰 오류를 피하고 기포가 유입되지 않도록 96웰 플레이트에 매우 조심스럽게 피펫팅하는 것이 중요합니다.