Name: 세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 배우세요 CD8+ T 세포에 의한 췌장 베타 세포 사멸을 평가하는 두 가지 시험관 내 방법을. 크로뮴 51 방출 분석과 실시간 라이브 세포 이미징 기법을 통해 제1형 당뇨병의 자가면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다. </li><li> 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 2. 효과기 CD8 + T autoreactive 세포의 수집 및 활성화 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a]와 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]는 잭슨 연구실 (바 하버, ME)에서 구입했다 저희 마우스 시설에서 자란. 와 NOD - AI4a의 matings에서 F1 잡종 자손 NOD - AI4b [NOD - AI4a / B] 시대의 3~5주에서 당뇨병을 개발합니다. 모든 생쥐는 무균 시설에서 보관되어 및 관련 기관의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> CO 2를 사용하여 3~4주 오래된 NOD - AI4a / B 쥐를 안락사. </li><li> 생쥐의 spleens를 수집합니다. Euthanized 생쥐는 에탄올 스프레이로 준비하고 수술 후드 아래에 열립니다. Spleens은 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼에 넣어 있습니다. </li><li> 7 ML 유리 균질 화기를 사용하여 비장 세포를 수집합니다. 두 세 spleens 각각 차가운 HBSS 5 ML 넣고 7 ML 유리 균질 화기로 균질하고 있습니다. Homogenate 4에서 5 분 동안 1200rpm에서 수집 및 centrifuged 있습니다 ° C Sorvall RT7 + 원심 분리기를 사용하여. 세포 펠렛을 수집하고 있습니다. </li><li> hypotonic 솔루션 치료를 사용하여 적혈구를 제거합니다. 우박이 5 분 얼음 솔루션 / 비장 5 ML hypotonic로 처리되며, 다음 HBSS의 동일한 음량을 추가하여 무력화. 위에서, 원심 분리하여 세포를 수집, 50 ML HBSS에 resuspend. 셀 스트레이너를 통해 정지 세포를 통과하고 TrypanBlue의 얼룩과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. </li><li> 세포를 활성화합니다. RPMI1640에서 0.1 μm의 AI4 mimotope (아미노산 서열 YFIENYLEL) 25 U / ML IL - 2와 3 일간의 문화를 사용하여 5x10 6 / ML 및 활성화에 Resuspend 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 3. 51 피크 자료 분석은 CML를 검토 <ol><li> 라벨 대상 세포 : 3 시간 μCi / 음과 문화 1 세포를 대상으로, 문화 매체로 3 번 씻어 51 피크를 추가합니다. </li><li> 최종 볼륨이 각각 잘에 추가 있도록 단계 2.5에서 언급한로 RPMI 1640 배지에 효과기 세포를 일시 중지하면 200 μl 있습니다. </li><li> 비율 : 표시 대상 세포의 최종 세척 후, (T E)를 대상으로 원하는 이펙터에서 대상 셀 문화 활성화 효과기 세포를 추가합니다. 0.4:1, 1시 1분, 2시 1분, 5시 1분, 10시 1분, 20시 1분과 50:1에서 T 비율 : 우리는 일반적으로 E를 사용합니다. </li><li> 자연 용해 제어 역할을 타겟 세포 6 웰스 신선한 수정 RPMI 1640 매체 (단계 2.5 참조) 추가합니다. </li><li> 16시간 공동 문화 효과기 및 대상 세포. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브에 뜨는 수집 </li><li> 100μl 2% SDS를 추가하고 부드럽게 여러 번 pipetting하여 세포를 Lyse. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브의 다른 집합에 세포 lysate를 수집합니다. </li><li> 깨끗한 H 2 O로 한 우물을 세척하고 세포 lysate 튜브에 세척을 추가합니다. </li><li> 감마 카운터를 사용하여 supernatants 및 세포 lysates 카운트. </li><li> 다음과 같이 구체적인 용해를 계산 : <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="방정식 1"></li></ol> 4. 라이브 셀 이미징에 대한 세포의 스테 이닝 가장 일반적으로 사용되는 mitochondrial 막 잠재적인 염료 중 TMRM는 최소한 mitochondrial 독성을 전시하고 있습니다. 따라서 3 이러한 라이브 셀 이미징 연구 TMRM을 선택합니다. <ol><li> -20 ° C.에 DMSO와 저장소에 40 MM 주식 TMRM 솔루션을 준비 [25 NM] NIT - 1 세포 배양 1 모든 보충제와 페놀 레드없는 DMEM에 신선한 작업 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 37 30 분 TMRM 25 NM과 목표 NIT - 1 세포를 얼룩 ° C. </li><li> 염료 4 평형 분포를 유지하기 위해 TMRM 5 nm의를 포함하는 새로운 미디어로 미디어를 교체합니다. </li><li> hematocytometer를 사용하여 활성화 효과기 AI4 T 세포를 계산합니다. </li><li> 1 μl / ML Picogreen 위해 함께 활성화 효과기 T 세포 AI4 스테인5 상온에서 분 페놀 레드없는 문화 중간 3 회와 함께 씻으십시오. </li></ol> 5. 라이브 셀 이미징을 사용하여 평가 T 림프구 - 중재 베타 세포를 파괴 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경의 무대에 스테인드 NIT 세포와 chambered의 coverglass를 탑재합니다. dremmel 및 가스 etheline 산화와 chambered 유리를 소독과 탭을 제거합니다. 무대는 온도 37 ° C 제어 및 5% 수분과 CO 2.이 살아있는 세포 이미징 챔버를 갖추고 있습니다 </li><li> 활성화 추가 및 다른 전자에서 지정 방으로 스테인드 T 세포 : T 비율. </li><li> 제어 방으로 스테인드 Jurkat 세포의 같은 번호를 추가했습니다. </li></ol> 6. 라이브 셀 이미지를 얻기 현미경 우리가 반복 실험의 시간이 코스를 통해 자동으로 동일한 또는 다른 회의소와는 다른 위치에서 이미지를 얻기위한 허용 전동 무대를 갖추고 있습니다. <ol><li> 63x 오일 객관적인 렌즈를 사용하여, 위치 300 프레임의 총 매 3 분 간격으로 이미지를 가져가라. </li><li> 방출 565-619 NM 위해 여기 파장 543 nm의 길이 및 필터 집합을 사용하여 TMRM의 염색법을 감지 </li><li> 자극 488 NM 및 방출 500-630 nm의에 대한 필터 설정을 사용하여 Picogreen의 얼룩을 감지합니다. 비디오 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다. </li></ol> 7. 게시를 위해 비디오 변환 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 AVI 포맷으로 압축되지 않은 동영상 파일을 만듭니다. </li><li> 출판 형식으로 비디오를 변환하려면, 소프트웨어 패키지 피지 (로 동영상을 가져올 <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / 엘제이 /</a> LOCI (에서 Bioformats 플러그인 사용) 배포 <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> 녹색과 빨간색 신호와 프레임 속도는 애니메이션 옵션 메뉴를 사용하여 두 프레임 / 초로 설정되었습니다 균형을 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. </li><li> 압축되지 않은 AVI 파일로 512 X 512 픽셀과 수출하기 위해 동영상을 자르기. </li><li> 소프트웨어 퀵타임 7 (애플 컴퓨터, 쿠퍼 티노, CA)에서이 AVI 파일을 열고 압축 및 1200 KBS / 초에서 열린 비디오 파일 형식 H264/MPEG-4으로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <ol><li> 51 피크 CML 분석의 대표적인 결과. 대상 비율 (X 축) 증가 : 그림 1은 %의 구체적인 용해 (Y 축)는 효과기 증가 CML 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 대상 세포 immunodeficient NOD으로부터 격리 기본 아일 레츠 아르 Rag1 - / -. 생쥐 51 피크로 표시. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 Splenocytes는 분리 단계 위의 2에서 설명한대로 활성화됩니다. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 위의 단계에서 설명한대로 3.11 %의 구체적인 용해가 계산됩니다. </li><li> T 세포 - 매개 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 손실의 두 대표 (긍정적이고 부정적인) 결과가 표시됩니다. 세포가 묻은하고 반응은 4 단계, 5 이상 6 설명한대로 기록, 비디오 파일은 7 단계에서와 같이 만들어집니다. 비디오 1 : 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드되었습니다. 50:1의 비율 T : 활성화, CD8 + T autoreactive는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)를 E에서 이러한 NIT - 1 세포와 공동 교양되었습니다. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재력은 400 분 동안 점차 소산 기간,하지만 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 인치 비디오 2 : 제어 실험으로 NIT - 1 세포 TMRM 및 E에 Picogreen 스테인드 Jurkat 세포 공동 교양 물들일되었습니다 50:1의 비율 T. Jurkat 세포는 MHC 일치되는 인간의 T 세포 라인입니다. NIT - 1 세포가 공동 잠복기 400 분 전체 기간에 걸쳐 mitochondrial 막 잠재력을 유지. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서, 살인 유도하지 않습니다. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1 CML의 대표 결과가 immunodeficient NOD.Rag1 - / 격리 대상 세포 기본 아일 레츠로 사용 -. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 마우스 및 splenocytes. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 퍼센트 특정 용해는 효과기 증가 : 대상 비율이 증가합니다. 비디오 1. 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드했습니다. 활성 autoreactive CD8 + T는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)이 NIT - 1 E의 전지와 함께 공동 교양되었습니다 50:1의 비율 T. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재 dissipa테드는 점차 400 분 기간 동안,하지만 녹색 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">비디오를 볼하려면 여기를 클릭하십시오</a> . 비디오 1 Picogreen 스테인드 인간의 T 세포 라인 Jurkat 공동 양식에 설명된대로 동영상 2. NIT - 1 세포가 같은 얼룩되었습니다. NIT - 1 세포는 mitochondrial 막 잠재력 400분 기간을 생각을 유지할 수 있었다. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서 살인을 유발하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 ​​때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변화에 집중했다. Mitochondrial 막 잠재적인 소실은 apoptosis 8 이어지는 mitochondrial 기능 변경하는 동안 일찍 되돌릴 단계입니다. 공촛점 현미경 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 autoreactive T lymphocytes와 상호 작용하는 동안 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 소실을 시각화 수 있었다. 이 실험 설정은 T1D의 개발 기간 동안 베타 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine 메틸 에스테르 (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> 아미노산 서열 : YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060 - CL </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td><td> 11,140 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 쌍둥이 자리 </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드없는 DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 인큐베이터 </td><td> 써모 피셔 </td><td> HeraCell 150i </td><td> 세포 배양을위한 무균 보관 </td></tr><tr><td> 생물 안전 캐비닛 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 견적 1440 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 문화 튜브, 6x50 mm 라임 유리 </td><td> 어부 </td><td> 14-958 - </td><td></td></tr><tr><td> 감마 카운터 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> 마법사 1470 자동 감마 카운터 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> LSM 510 메타 공촛점 </td><td> 전동 무대와 라이브 셀 챔버와 함께 </td></tr><tr><td> 피펫 (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 튜브 (앰버) </td><td> 어부 </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Sorvall 레전드 RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD - AI4α / β F1 마우스 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF 동물 시설에서 자란 </td></tr></tbody></table>

세포 독성 t lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제. 효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된 Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다. 400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

제1형 당뇨병(T1D)은 T 세포 매개 자가면역 질환입니다. 발병 과정 동안, 인슐린...함에 따라 환자들은 점진적으로 인슐린 결핍 상태가 됩니다.

제1형 당뇨병은 자가 반응성 T 세포에 의해 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포가 파괴되는 자가면역 질환입니다. 관련 기전을 이해하는 것은 이 질환의 효과적인 치료법을 개발하기 위한 통찰력을 제공할 것입니다. 본 영상에서는 in vitro에서 특정 cd8 양성 T 세포가 매개하는 췌장 베타 세포의 파괴를 관찰하는 두 가지 방법인 chromium 51 기반의 세포 매개 림프구 세포독성 또는 CML 분석법과 시각적 CML 분석법을 시연합니다.CML 분석을 수행하기 위해 먼저 마우스 비장에서 CD8 양성 T 작동 세포를 준비합니다. Knit 1 또는 Knit 4 표적 베타 세포를 chromium 51로 라벨링하고 작동 세포와 함께 공동 배양합니다. 표적 베타 세포가 사멸하면 chromium 51이 방출됩니다. 이후 상층액과 세포 용해물을 수집하고, 감마 카운터를 사용하여 세포 사멸 정도를 나타내는 방사성 수치를 측정합니다. 시각적 CML 분석을 수행하기 위해 Knit 1 및 Knit 4 표적 베타 세포는 미토콘드리아 막 전위 염색약인 TM RM으로 라벨링하며, 작동 세포는 pico green으로 라벨링합니다.세포들을 혼합하고 살아있는 세포 이미징을 수행하여 미토콘드리아 막 전위의 소실로 나타나는 세포 사멸 속도를 조사합니다. 크롬 방출 분석과 같은 기존 분석법에 비해 이 분석법의 주요 장점은 베타 세포의 사멸을 실시간으로 관찰할 수 있다는 점입니다. 추가적인 장점으로는 CD8 T 세포 매개 베타 세포 사멸이 접촉 의존적인지 여부를 결정할 수 있다는 점과, 형광 지표를 사용하여 베타 세포 사멸 경로를 매핑하도록 이 분석법을 확장할 수 있다는 점이 있습니다.이 방법은 세포독성 T 세포가 관여하는 모든 질병의 병태생리에 관한 핵심적인 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 베타 세포의 생존과 생리적 작용 모두에 필수적이므로, 이 기술의 영향력은 치료 및 잠재적으로 진단 영역까지 확장됩니다. Jing Chen과 제가 이 절차를 시연하겠습니다.본 시연에 사용된 표적 세포는 마우스 베타 세포주인 knit one과 knit four이며, 마우스 베타 세포를 인식하거나 사멸시키지 않는 Jurkat CD3+ 인간 림프구 세포주를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 여기에 사용된 작동 세포(effector cells)는 3~4주령의 NOD AI4 αβ F1 마우스의 비장에서 얻은 자가 반응성 CD8+ T 세포입니다. 세포를

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

분리된 면역 조절제의 면역학적 기능을 평가합니다. 다음은 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석법을 통해 이중 특이성 T세포 인게이저(BTE)에 의해 유도된 세포 매개 세포독성을 평가하는 상세 방법을 설명합니다. 실험 중에 테스트할 조건을 결정하십시오(그림 1 참조). 시간대(시간에서 일 단위), 면역 조절제의 농도(pg/mL에서 µg/mL), 그리고 작동 세포 대비 표적 세포(E:T) 비율(예: 1:50에서 50:1 사이)을 다양하게 설정할 수 있습니다. 샘플은 항상 3반복으로 준비하십시오. BTE 단백질과 작동 세포가 없는 샘플, 단일 세포 유형(Tsp 및 Esp)의 자발적 LDH 방출 대조군, 판독 전 계면활성제를 첨가한 표적 세포 최대 용해 대조군(Tmax), 배지만 포함된 대조군, 그리고 Tmax를 위한 부피 대조군을 포함하십시오. 참고: 필요한 표적 세포 수와 배양 시간은 다를 수 있습니다. 최적의 파라미터를 식별하기 위해 작동 세포와 면역 조절제 없이 초기 테스트 런을...

바이러스 인코딩 이중특이성 T세포 각성제(Bispecific T-Cell Engager)의 면역 조절 활성 평가

이 비디오는 세포독성 T 림프구 또는 CTL 반응에서 면역 우성을 분석하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 주입된 형광 표적 세포는 면역원성 항원결정기에 해당하는 다양한 형광을 나타냅니다. 비장 후 수집 및 분류를 통해 고강도 형광 세포가 감소하는 것으로 나타나 CTL 반응에서 면역 우세를 확인할 수 있습니다.

세포독성 T 림프구 반응에서 면역우성을 평가하기 위한 분석

이 비디오는 β-글루칸을 사용하여 반응성 산소 종인 과산화물 라디칼 생성을 위해 미세아교세포를 활성화하는 체외 분석을 보여줍니다. 뇌암세포에서 생성된 반응성 산화물질은 종양세포 증식을 능동적으로 억제하고 세포의 사멸을 유도합니다.

뇌종양 세포에 대한 면역요법 전략으로서의 Test β-Glucan을 분석하기 위한 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

배우세요 CD8+ T 세포에 의한 췌장 베타 세포 사멸을 평가하는 두 가지 시험관 내 방법을. 크로뮴 51 방출 분석과 실시간 라이브 세포 이미징 기법을 통해 제1형 당뇨병의 자가면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

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