세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

제1형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포가 자가반응성 T세포에 의해 파괴되는 자가면역질환입니다. 관련된 메커니즘을 이해하면 이 질병에 대한 효과적인 치료법을 개발할 수 있는 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에서는 췌장 베타 세포의 특정 cd 8 양성 T 세포 매개 파괴를 in vitro에서 관찰하는 두 가지 방법, 즉 크롬 51 기반 세포 매개 림프 세포 독성 또는 CML 분석과 두 가지 방법 모두에 대한 시각적 CML 분석이 입증됩니다.

CD 8개의 양성 T effector 세포는 먼저 마우스 비장이 A CML 분석을 수행할 수 있도록 준비되며, 니트 1 또는 니트 4개의 타겟 베타 세포는 크롬 51로 표지되고 effector 세포와 공동 배양됩니다. 표적 베타 세포가 죽으면 크롬 51이 방출됩니다. 그런 다음 상층액과 세포 용해물을 수집하고 감마 계수기를 사용하여 세포 사멸 정도를 나타내는 방사능 수준을 측정하여 시각적 CML 분석을 수행합니다.니트 1 및 니트 4 타겟 베타 세포는 미토콘드리아 전위 염료 TM RM 효과기로 표지됩니다. 세포는 피코 그린으로 표지됩니다.

세포를 결합하고 살아있는 세포 이미징을 수행하여 미토콘드리아 막 전위의 소실로 표시되는 세포 사멸률을 조사합니다. 크롬 방출 분석과 같은 기존 분석에 비해 이 분석의 주요 장점은 베타 세포 사멸을 실시간으로 관찰할 수 있다는 것입니다. 추가적인 이점으로는 베타 세포의 CD 8 T 세포 매개 사멸이 접촉 의존적인지 여부를 결정할 수 있는 기능과 형광 지표를 사용하여 베타 세포 사멸 경로를 매핑하기 위해 이 분석을 확장할 수 있다는 점이 있습니다.

이 방법은 세포독성 T 세포가 역할을 하는 모든 질병의 발병기전에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 미토콘드리아 기능이 베타 세포 생존과 생리학 모두에 필수적이기 때문에 치료 및 진단으로 확장될 수 있습니다. Jing Chen과 저는 이 절차를 시연할 것입니다.

본 시연에 사용된 표적 세포는 마우스 베타 세포주, knit one 및 knit four이며, CD 3 플러스 인간 림프구 세포주에서 저크는 마우스 베타 세포를 인식하고 죽이지 않으며 사용된 유효 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 다음은 생후 3-4주 된 Nod AI의 비장에서 얻은 8개의 양성 T 세포인 Autoreactive CD, AI와 4개의 알파 베타 F1 마우스가 세포를 얻기 위해 비장을 5ml의 얼음처럼 차가운 HBSS를 포함하는 7ml 유리 다운 균질기에 넣는 것으로 시작하고, downs 균질화기를 사용하여 비장을 균질화한 다음 세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮기고 스핀 후 5분 동안 250Gs에서 원심분리합니다. Snat를 버리고 적혈구를 제거한 다음 비장 당 5 밀리리터의 저장성 용액에 펠릿을 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 5분간 배양합니다.

배양 후 10ml의 얼음처럼 차가운 HBSS 원심분리기로 세포 펠릿을 두 번 세척합니다. 각 세척 사이의 세포 현탁액은 10ml의 얼음처럼 차가운 HBSS에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 혈구 분석기를 사용하여 세포 수가 결정된 후 세포를 계수합니다.

그런 다음 다시 원심분리기를 사용하여 세포를 재현탁시키고 T 75 플라스크에서 밀리리터당 6개의 세포에 5 곱하기 10의 밀도로 6개의 세포에 RPMI 1640을 보충했습니다. 마지막으로, 세포를 활성화하기 위해 최종 농도가 0.1마이크로몰 및 밀리리터당 25단위인 플라스크에 AI 4개의 근시와 IL 2를 추가하고 각각 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 3일 동안 플라스크를 배양합니다. 활성화된 세포는 이제 ACROMIUM 51 기반 CML 분석 또는 시각적 CML 분석에 사용할 수 있습니다.

여기서 세포 매개 림프 세포 독성 또는 CML 분석은 CD 8 매개 베타 세포 사멸의 지표로 표적 세포에서 크롬 51의 방출을 사용합니다. 크롬 51로 1 개의 표적 베타 세포를 편직하거나 4 개의 표적 베타 세포를 편직하려면 200 마이크로 리터의 보충 된 DM E E, EMM에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 5 % CO2로 배양하여 96 웰 플레이트의 웰 당 4 번째 세포에 5 배 10의 밀도로 파종하는 것으로 시작하십시오. 다음날 크롬 51을 희석하고 DMEM을 20마이크로리터당 1마이크로 퀴리 농도로 보충했습니다.

다음으로, 20마이크로리터의 희석된 크롬 51을 타겟 베타 세포를 포함하는 각 웰에 추가하여 웰당 1개의 마이크로 퀴리를 달성합니다. 플레이트를 5%CO2로 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 배양 후 3시간 동안 배양합니다. 배지를 흡인하고 신선한 배양 배지로 세포를 세 번 세척합니다.

다음으로, 각 웰에 추가되는 최종 부피가 200마이크로리터가 되도록 활성화된 CD 8개의 양성 효과기 세포에 배지를 추가합니다. 여기에서 원하는 E 대 T 비율로 타겟 베타 세포 배양에서 효과기를 결합하고, 20 대 1, 10 대 1, 5 대 1, 2 대 1, 1 대 1 및 0.25 대 1의 비율이 자연 용해 제어를 준비하는 데 사용됩니다. 타겟 베타 세포의 새로운 배지에서 6웰을 추가합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣고 16시간 동안 공동 배양 효과기 및 표적 세포를 놓습니다. 다음 날에는 다중 채널 피펫을 사용하여 상층액을 6배의 50mm 석회 유리관으로 옮깁니다. 그런 다음 2 % SDS의 100 마이크로 리터에서 세포를 플레이트에 lyce하고 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫합니다.

세포 용해물을 6배 50mm 석회 유리관으로 구성된 새로운 세트로 옮깁니다. 그런 다음 모든 세포 용해물이 100마이크로리터의 멸균수에서 각 웰 피펫에 위아래로 수집되도록 하고 세포 용해물 튜브에 추가하여 베타 세포 파괴 정도를 측정합니다. 계수가 수행된 후 감마 카운터를 사용하여 상등액 및 용해액의 방사능을 측정합니다.

이 방정식에 표시된 것처럼 실험 상층액의 계수 비율에서 자발적 용해 제어 상층액의 계수 백분율을 빼서 특정 용해를 측정합니다. T 세포 매개 베타 세포 사멸을 실시간으로 검사합니다. 미토콘드리아 막 전위는 표적 및 효과기 공동 배양의 라이브 셀 이미징에 의해 모니터링됩니다.

현미경 검사를 준비하기 위해 변형 및 멸균된 8개의 잘 챔버 처리된 커버 유리의 표적 베타 세포를 네 번째 세포 중 5배의 10개에서 참조하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이터에 넣고 세포가 48시간 동안 자랄 수 있도록 합니다. 실험 당일, 미토콘드리아 막 전위 염료 테트라에틸 루민 메틸 에스테르 TMRM을 25 나노몰에 첨가하고 페놀 레드 프리 보충제 DM EM을 30분 동안 배양합니다.

세포가 TMRM으로 염색되면 배지를 5나노몰 TM RM을 함유한 새로운 배지로 교체하여 염료의 평형 분포를 유지합니다. 다음으로, 활성화된 effector AI를 4개의 T 세포로 계수하거나 혈구 분석기를 사용하여 세포를 제어하고, 적절한 농도로 15ml 원추형 튜브에 페놀 레드 프리 보충 DMEM으로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 활성화된 effector cell에 pico green을 추가하거나 control cell을 milliliter당 1μliter의 최종 농도로 저크합니다.

튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호한 다음 배양 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 페놀 레드 프리 DMEM을 첨가하고 간단히 혼합한 후 250GS에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세 번 세척합니다. 이미징을 위해 세포를 수집하려면 섭씨 37도 및 5%CO2에서 전동 스테이지와 가습된 라이브 셀 이미징 챔버가 장착된 컨포칼 현미경의 스테이지에 챔버 슬라이드를 놓습니다.

여기에서 평가할 목표 비율에 따라 활성화된 피코 그린 염색 효과기 세포를 챔버에 추가합니다. 이미징된 ET 비율은 50 대 1이며, 이미징 소프트웨어를 설정하여 3분마다 3개의 위치가 있는 4개의 웰에서 이미지를 수집하고, 위치당 300프레임씩 TMRM 및 Pico Green에 적합한 필터 세트를 사용하여 인용합니다. 모든 이미지가 수집되면 여기에 게시하기 위해 변환해야 합니다.

Fiji 및 Image J는 loci의 bio formats 플러그인과 함께 사용됩니다. 비디오 변환에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 텍스트에서 확인할 수 있습니다. 세포 매개 림프 세포 독성 또는 CML 분석은 이 비디오에 설명된 대로 크롬 51을 사용하여 수행되었습니다.

본 명세서에서 볼 수 있듯이, Y축에 나타난 특이적 용해율은 X축에 나타난 효과기 대 표적 비율이 증가함에 따라 증가하여 살아있는 세포 이미징에 의한 세포 사멸을 평가하고, 마우스 베타 세포주 니트 1을 적색 활성화 자가반응성 I 4개의 CD에 나타낸 미토콘드리아 막 전위 염료 TMRM으로 염색하고, 8개의 양성 T 세포가 피코 그린으로 녹색을 유지하고, 2개의 세포 유형을 공동 배양하였다 여기에서 볼 수 있듯이 50 대 1의 E 대 T 비율로. 니트 1개의 미토콘드리아 막 전위는 400분 동안 서서히 소멸되었지만, 대조군 실험으로 녹색 AI 4개의 T 세포와 상호 작용하는 클러스터에서만 가능합니다. 염색된 니트 one 세포는 대신 여기에서 볼 수 있듯이 T 세포에서 MHC가 일치하지 않는 피코 그린으로 배양되었습니다.

니트 원세포는 400분 동안 미토콘드리아 막 전위를 유지할 수 있었습니다. 회로 세포는 니트 1 클러스터와 상호 작용하지 않았으므로 살해를 유도하지 않았습니다. 일단 마스터하면.

이 기술은 세포 전처리를 포함하여 약 5일이 걸립니다. 이 비디오를 관찰하면 자가반응성 T세포의 공격을 받을 때 베타 세포막 전위가 어떻게 변하는지 잘 이해할 수 있을 것입니다. 방사성 동위원소로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 적절한 교육을 받고 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.