Name: 세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 배우세요 CD8+ T 세포에 의한 췌장 베타 세포 사멸을 평가하는 두 가지 시험관 내 방법을. 크로뮴 51 방출 분석과 실시간 라이브 세포 이미징 기법을 통해 제1형 당뇨병의 자가면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다. </li><li> 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 2. 효과기 CD8 + T autoreactive 세포의 수집 및 활성화 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a]와 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]는 잭슨 연구실 (바 하버, ME)에서 구입했다 저희 마우스 시설에서 자란. 와 NOD - AI4a의 matings에서 F1 잡종 자손 NOD - AI4b [NOD - AI4a / B] 시대의 3~5주에서 당뇨병을 개발합니다. 모든 생쥐는 무균 시설에서 보관되어 및 관련 기관의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> CO 2를 사용하여 3~4주 오래된 NOD - AI4a / B 쥐를 안락사. </li><li> 생쥐의 spleens를 수집합니다. Euthanized 생쥐는 에탄올 스프레이로 준비하고 수술 후드 아래에 열립니다. Spleens은 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼에 넣어 있습니다. </li><li> 7 ML 유리 균질 화기를 사용하여 비장 세포를 수집합니다. 두 세 spleens 각각 차가운 HBSS 5 ML 넣고 7 ML 유리 균질 화기로 균질하고 있습니다. Homogenate 4에서 5 분 동안 1200rpm에서 수집 및 centrifuged 있습니다 ° C Sorvall RT7 + 원심 분리기를 사용하여. 세포 펠렛을 수집하고 있습니다. </li><li> hypotonic 솔루션 치료를 사용하여 적혈구를 제거합니다. 우박이 5 분 얼음 솔루션 / 비장 5 ML hypotonic로 처리되며, 다음 HBSS의 동일한 음량을 추가하여 무력화. 위에서, 원심 분리하여 세포를 수집, 50 ML HBSS에 resuspend. 셀 스트레이너를 통해 정지 세포를 통과하고 TrypanBlue의 얼룩과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. </li><li> 세포를 활성화합니다. RPMI1640에서 0.1 μm의 AI4 mimotope (아미노산 서열 YFIENYLEL) 25 U / ML IL - 2와 3 일간의 문화를 사용하여 5x10 6 / ML 및 활성화에 Resuspend 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 3. 51 피크 자료 분석은 CML를 검토 <ol><li> 라벨 대상 세포 : 3 시간 μCi / 음과 문화 1 세포를 대상으로, 문화 매체로 3 번 씻어 51 피크를 추가합니다. </li><li> 최종 볼륨이 각각 잘에 추가 있도록 단계 2.5에서 언급한로 RPMI 1640 배지에 효과기 세포를 일시 중지하면 200 μl 있습니다. </li><li> 비율 : 표시 대상 세포의 최종 세척 후, (T E)를 대상으로 원하는 이펙터에서 대상 셀 문화 활성화 효과기 세포를 추가합니다. 0.4:1, 1시 1분, 2시 1분, 5시 1분, 10시 1분, 20시 1분과 50:1에서 T 비율 : 우리는 일반적으로 E를 사용합니다. </li><li> 자연 용해 제어 역할을 타겟 세포 6 웰스 신선한 수정 RPMI 1640 매체 (단계 2.5 참조) 추가합니다. </li><li> 16시간 공동 문화 효과기 및 대상 세포. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브에 뜨는 수집 </li><li> 100μl 2% SDS를 추가하고 부드럽게 여러 번 pipetting하여 세포를 Lyse. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브의 다른 집합에 세포 lysate를 수집합니다. </li><li> 깨끗한 H 2 O로 한 우물을 세척하고 세포 lysate 튜브에 세척을 추가합니다. </li><li> 감마 카운터를 사용하여 supernatants 및 세포 lysates 카운트. </li><li> 다음과 같이 구체적인 용해를 계산 : <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="방정식 1"></li></ol> 4. 라이브 셀 이미징에 대한 세포의 스테 이닝 가장 일반적으로 사용되는 mitochondrial 막 잠재적인 염료 중 TMRM는 최소한 mitochondrial 독성을 전시하고 있습니다. 따라서 3 이러한 라이브 셀 이미징 연구 TMRM을 선택합니다. <ol><li> -20 ° C.에 DMSO와 저장소에 40 MM 주식 TMRM 솔루션을 준비 [25 NM] NIT - 1 세포 배양 1 모든 보충제와 페놀 레드없는 DMEM에 신선한 작업 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 37 30 분 TMRM 25 NM과 목표 NIT - 1 세포를 얼룩 ° C. </li><li> 염료 4 평형 분포를 유지하기 위해 TMRM 5 nm의를 포함하는 새로운 미디어로 미디어를 교체합니다. </li><li> hematocytometer를 사용하여 활성화 효과기 AI4 T 세포를 계산합니다. </li><li> 1 μl / ML Picogreen 위해 함께 활성화 효과기 T 세포 AI4 스테인5 상온에서 분 페놀 레드없는 문화 중간 3 회와 함께 씻으십시오. </li></ol> 5. 라이브 셀 이미징을 사용하여 평가 T 림프구 - 중재 베타 세포를 파괴 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경의 무대에 스테인드 NIT 세포와 chambered의 coverglass를 탑재합니다. dremmel 및 가스 etheline 산화와 chambered 유리를 소독과 탭을 제거합니다. 무대는 온도 37 ° C 제어 및 5% 수분과 CO 2.이 살아있는 세포 이미징 챔버를 갖추고 있습니다 </li><li> 활성화 추가 및 다른 전자에서 지정 방으로 스테인드 T 세포 : T 비율. </li><li> 제어 방으로 스테인드 Jurkat 세포의 같은 번호를 추가했습니다. </li></ol> 6. 라이브 셀 이미지를 얻기 현미경 우리가 반복 실험의 시간이 코스를 통해 자동으로 동일한 또는 다른 회의소와는 다른 위치에서 이미지를 얻기위한 허용 전동 무대를 갖추고 있습니다. <ol><li> 63x 오일 객관적인 렌즈를 사용하여, 위치 300 프레임의 총 매 3 분 간격으로 이미지를 가져가라. </li><li> 방출 565-619 NM 위해 여기 파장 543 nm의 길이 및 필터 집합을 사용하여 TMRM의 염색법을 감지 </li><li> 자극 488 NM 및 방출 500-630 nm의에 대한 필터 설정을 사용하여 Picogreen의 얼룩을 감지합니다. 비디오 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다. </li></ol> 7. 게시를 위해 비디오 변환 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 AVI 포맷으로 압축되지 않은 동영상 파일을 만듭니다. </li><li> 출판 형식으로 비디오를 변환하려면, 소프트웨어 패키지 피지 (로 동영상을 가져올 <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / 엘제이 /</a> LOCI (에서 Bioformats 플러그인 사용) 배포 <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> 녹색과 빨간색 신호와 프레임 속도는 애니메이션 옵션 메뉴를 사용하여 두 프레임 / 초로 설정되었습니다 균형을 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. </li><li> 압축되지 않은 AVI 파일로 512 X 512 픽셀과 수출하기 위해 동영상을 자르기. </li><li> 소프트웨어 퀵타임 7 (애플 컴퓨터, 쿠퍼 티노, CA)에서이 AVI 파일을 열고 압축 및 1200 KBS / 초에서 열린 비디오 파일 형식 H264/MPEG-4으로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <ol><li> 51 피크 CML 분석의 대표적인 결과. 대상 비율 (X 축) 증가 : 그림 1은 %의 구체적인 용해 (Y 축)는 효과기 증가 CML 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 대상 세포 immunodeficient NOD으로부터 격리 기본 아일 레츠 아르 Rag1 - / -. 생쥐 51 피크로 표시. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 Splenocytes는 분리 단계 위의 2에서 설명한대로 활성화됩니다. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 위의 단계에서 설명한대로 3.11 %의 구체적인 용해가 계산됩니다. </li><li> T 세포 - 매개 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 손실의 두 대표 (긍정적이고 부정적인) 결과가 표시됩니다. 세포가 묻은하고 반응은 4 단계, 5 이상 6 설명한대로 기록, 비디오 파일은 7 단계에서와 같이 만들어집니다. 비디오 1 : 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드되었습니다. 50:1의 비율 T : 활성화, CD8 + T autoreactive는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)를 E에서 이러한 NIT - 1 세포와 공동 교양되었습니다. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재력은 400 분 동안 점차 소산 기간,하지만 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 인치 비디오 2 : 제어 실험으로 NIT - 1 세포 TMRM 및 E에 Picogreen 스테인드 Jurkat 세포 공동 교양 물들일되었습니다 50:1의 비율 T. Jurkat 세포는 MHC 일치되는 인간의 T 세포 라인입니다. NIT - 1 세포가 공동 잠복기 400 분 전체 기간에 걸쳐 mitochondrial 막 잠재력을 유지. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서, 살인 유도하지 않습니다. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1 CML의 대표 결과가 immunodeficient NOD.Rag1 - / 격리 대상 세포 기본 아일 레츠로 사용 -. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 마우스 및 splenocytes. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 퍼센트 특정 용해는 효과기 증가 : 대상 비율이 증가합니다. 비디오 1. 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드했습니다. 활성 autoreactive CD8 + T는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)이 NIT - 1 E의 전지와 함께 공동 교양되었습니다 50:1의 비율 T. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재 dissipa테드는 점차 400 분 기간 동안,하지만 녹색 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">비디오를 볼하려면 여기를 클릭하십시오</a> . 비디오 1 Picogreen 스테인드 인간의 T 세포 라인 Jurkat 공동 양식에 설명된대로 동영상 2. NIT - 1 세포가 같은 얼룩되었습니다. NIT - 1 세포는 mitochondrial 막 잠재력 400분 기간을 생각을 유지할 수 있었다. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서 살인을 유발하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
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<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
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<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
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<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 ​​때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변화에 집중했다. Mitochondrial 막 잠재적인 소실은 apoptosis 8 이어지는 mitochondrial 기능 변경하는 동안 일찍 되돌릴 단계입니다. 공촛점 현미경 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 autoreactive T lymphocytes와 상호 작용하는 동안 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 소실을 시각화 수 있었다. 이 실험 설정은 T1D의 개발 기간 동안 베타 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine 메틸 에스테르 (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> 아미노산 서열 : YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060 - CL </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td><td> 11,140 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 쌍둥이 자리 </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드없는 DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 인큐베이터 </td><td> 써모 피셔 </td><td> HeraCell 150i </td><td> 세포 배양을위한 무균 보관 </td></tr><tr><td> 생물 안전 캐비닛 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 견적 1440 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 문화 튜브, 6x50 mm 라임 유리 </td><td> 어부 </td><td> 14-958 - </td><td></td></tr><tr><td> 감마 카운터 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> 마법사 1470 자동 감마 카운터 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> LSM 510 메타 공촛점 </td><td> 전동 무대와 라이브 셀 챔버와 함께 </td></tr><tr><td> 피펫 (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 튜브 (앰버) </td><td> 어부 </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Sorvall 레전드 RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD - AI4α / β F1 마우스 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF 동물 시설에서 자란 </td></tr></tbody></table>

세포 독성 t lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제. 효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된 Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다. 400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

제1형 당뇨병(T1D)은 T 세포 매개 자가면역 질환입니다. 발병 과정 동안, 인슐린...함에 따라 환자들은 점진적으로 인슐린 결핍 상태가 됩니다.

제1형 당뇨병은 자가 반응성 T 세포에 의해 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포가 파괴되는 자가면역 질환입니다. 관련 기전을 이해하는 것은 이 질환의 효과적인 치료법을 개발하기 위한 통찰력을 제공할 것입니다. 본 영상에서는 in vitro에서 특정 cd8 양성 T 세포가 매개하는 췌장 베타 세포의 파괴를 관찰하는 두 가지 방법인 chromium 51 기반의 세포 매개 림프구 세포독성 또는 CML 분석법과 시각적 CML 분석법을 시연합니다.CML 분석을 수행하기 위해 먼저 마우스 비장에서 CD8 양성 T 작동 세포를 준비합니다. Knit 1 또는 Knit 4 표적 베타 세포를 chromium 51로 라벨링하고 작동 세포와 함께 공동 배양합니다. 표적 베타 세포가 사멸하면 chromium 51이 방출됩니다. 이후 상층액과 세포 용해물을 수집하고, 감마 카운터를 사용하여 세포 사멸 정도를 나타내는 방사성 수치를 측정합니다. 시각적 CML 분석을 수행하기 위해 Knit 1 및 Knit 4 표적 베타 세포는 미토콘드리아 막 전위 염색약인 TM RM으로 라벨링하며, 작동 세포는 pico green으로 라벨링합니다.세포들을 혼합하고 살아있는 세포 이미징을 수행하여 미토콘드리아 막 전위의 소실로 나타나는 세포 사멸 속도를 조사합니다. 크롬 방출 분석과 같은 기존 분석법에 비해 이 분석법의 주요 장점은 베타 세포의 사멸을 실시간으로 관찰할 수 있다는 점입니다. 추가적인 장점으로는 CD8 T 세포 매개 베타 세포 사멸이 접촉 의존적인지 여부를 결정할 수 있다는 점과, 형광 지표를 사용하여 베타 세포 사멸 경로를 매핑하도록 이 분석법을 확장할 수 있다는 점이 있습니다.이 방법은 세포독성 T 세포가 관여하는 모든 질병의 병태생리에 관한 핵심적인 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 베타 세포의 생존과 생리적 작용 모두에 필수적이므로, 이 기술의 영향력은 치료 및 잠재적으로 진단 영역까지 확장됩니다. Jing Chen과 제가 이 절차를 시연하겠습니다.본 시연에 사용된 표적 세포는 마우스 베타 세포주인 knit one과 knit four이며, 마우스 베타 세포를 인식하거나 사멸시키지 않는 Jurkat CD3+ 인간 림프구 세포주를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 여기에 사용된 작동 세포(effector cells)는 3~4주령의 NOD AI4 αβ F1 마우스의 비장에서 얻은 자가 반응성 CD8+ T 세포입니다. 세포를 얻기 위해 먼저 5 mL의 차가운 HBSS가 들어 있는 7 mL 유리 Dounce 균질기에 비장을 넣습니다. Dounce 균질기를 사용하여 비장을 균질화한 다음, 세포 현탁액을 원추형 튜브로 옮겨 250 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 적혈구를 제거하기 위해 비장 하나당 5 mL의 저장액(hypotonic solution)으로 펠렛을 재현탁합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.배양 후, 얼음처럼 차가운 HBSS 10 mL로 세포 펠릿을 두 번 세척하며 원심분리합니다. 각 세척 단계 사이의 세포 현탁액에서 세포를 얼음처럼 차가운 HBSS 10 mL에 다시 현탁합니다. 그런 다음 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.다시 원심분리한 후, 세포를 보충된 RPMI 1640에 5×10⁶ cells/mL의 밀도로 재현탁하여 T 75 플라스크에 5×10⁶ cells/mL의 밀도로 분주합니다. 마지막으로, 세포를 활성화하기 위해 AI four myope와 IL two를 각각 0.1 µM 및 25 units/mL의 최종 농도로 플라스크에 첨가합니다. 플라스크를 37 °C, 5% CO₂ 배양기에서 3일 동안 배양합니다. 이렇게 활성화된 세포는 ACROMIUM 51 기반 CML 분석 또는 시각적 CML 분석에 사용할 수 있습니다.여기서 세포 매개 림프구 세포독성 또는 CML 분석법은 표적 세포로부터의 chromium 51 방출을 CD8 매개 베타 세포 사멸의 지표로 사용합니다. chromium 51로 MIN6 또는 MIN4 표적 베타 세포를 라벨링하려면, 먼저 96웰 플레이트의 웰당 5 × 10⁴ cells의 밀도로 보충된 DMEM에 200 µL를 분주하여 seeding하고, 37 °C, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, chromium 51과 보충된 DMEM을 20 µL당 1 µCi 농도로 희석합니다.다음으로, 웰당 1 $\mu$Ci가 되도록 표적 베타 세포가 들어 있는 각 웰에 희석된 chromium 51 20 $\mu$L를 첨가합니다. 플레이트를 5% $\text{CO}_2$가 포함된 37 °C 습윤 배양기에 넣고 3시간 동안 배양합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 신선한 배양 배지로 세포를 3회 세척합니다.다음으로, 각 웰에 추가되는 최종 부피가 200 µL가 되도록 활성화된 CD8 positive 작동 세포(effector cells)에 배지를 추가합니다. 여기에서 원하는 E:T 비율로 작동 세포와 표적 베타 세포 배양물을 혼합하며, 자발적 용해 대조군을 준비하기 위해 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 및 0.25:1의 비율을 사용합니다. 표적 베타 세포가 들어 있는 6개의 웰에 신선한 배지를 추가합니다.그 후 플레이트를 인큐베이터에 넣고 작동 세포(effector cell)와 표적 세포(target cell)를 16시간 동안 공동 배양합니다. 다음 날, 멀티 채널 피펫을 사용하여 상청액을 50mm 라임 글라스 튜브 6개에 옮깁니다. 이어서 세포를 용해하기 위해 2% SDS 100µL를 플레이트에 넣고 피펫으로 부드럽게 여러 번 섞어줍니다.세포 용해물을 50 mm 라임 유리 튜브 6개에 각각 옮깁니다. 그다음, 모든 세포 용해물을 수집하기 위해 멸균 증류수 100 µL를 각 웰에 넣고 피펫팅한 후, 이를 세포 용해물 튜브에 추가하여 베타 세포 파괴 정도를 측정합니다. 카운팅이 완료되면 감마 카운터를 사용하여 상층액과 용해물의 방사능을 측정합니다.다음 식과 같이 실험군 상층액의 카운트 백분율에서 자발적 용해 대조군 상층액의 카운트 백분율을 빼서 특이적 용해도를 결정합니다. T세포 매개 베타 세포 사멸을 실시간으로 관찰하기 위해, 표적 세포와 작동 세포의 공배양 상태에서 생세포 이미징을 통해 미토콘드리아 막 전위를 모니터링합니다.현미경 관찰을 준비하기 위해, 수정 및 멸균된 8-웰 챔버 커버 글라스에 베타 세포를 5 × 10⁴ cells/well 농도로 분주합니다. 슬라이드를 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에 넣고 세포를 48시간 동안 배양합니다. 실험 당일에 25nM의 미토콘드리아 막 전위 염색약인 tetraethylrhodamine methyl ester (TMRM)가 포함된 phenol red-free 보충 DM EM 배지를 첨가하고 30분 동안 배양합니다.TMRM으로 세포를 염색한 후, 염료의 평형 분포를 유지하기 위해 5 nM TMRM이 포함된 신선한 배지로 교체합니다. 다음으로, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 활성화된 effector CD4 T 세포 또는 control Jurkat 세포의 수를 측정하고, 15 mL 원추형 튜브에 적절한 농도로 phenol red가 제거된 보충 DMEM에 세포를 재현탁합니다. 이어서, 활성화된 effector 세포 또는 Jurkat 대조군 세포에 PicoGreen을 최종 농도 1 µL/mL가 되도록 첨가합니다.빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싼 후, 배양 후 상온에서 5분 동안 방치합니다. 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM을 첨가하여 짧게 혼합하고 250 GS에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 3회 세척합니다. 이미징을 위해 세포를 수집하려면, 전동 스테이지와 37 °C 및 5% CO2 조건의 습윤 라이브 셀 이미징 챔버가 장착된 공초점 현미경의 스테이지 위에 챔버 슬라이드를 놓습니다.활성화되어 pico green으로 염색된 작동 세포를 분석하고자 하는 작동 세포 대 표적 세포 비율로 챔버에 추가합니다. 촬영할 ET 비율은 50:1이며, 이미징 소프트웨어를 설정하여 4개의 웰에서 각 위치당 3곳씩 3분 간격으로 위치당 300프레임을 수집하고, TMRM 및 Pico Green에 적합한 필터 세트를 사용하여 여기시킵니다. 모든 이미지 수집이 완료되면, 해당 이미지들을 출판용으로 변환해야 합니다.Fiji와 Image J는 loci의 bio formats 플러그인과 함께 사용됩니다. 비디오 변환에 관한 더 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 텍스트에서 확인할 수 있습니다. 본 비디오에서 설명한 바와 같이 chromium 51을 사용하여 세포 매개 림프구 세포독성 또는 CML 분석을 수행하였습니다.여기서 보는 바와 같이, 세포 사멸을 실시간 세포 이미징(live cell imaging)으로 평가하기 위해 X축에 표시된 작동 세포 대 표적 세포 비율(effector to target ratio)이 증가함에 따라 Y축에 표시된 특이적 용해율(percent specific lysis)이 증가합니다. 마우스 베타 세포주 KNIT-1은 빨간색으로 표시된 미토콘드리아 막 전위 염색약인 TMRM으로 염색되었으며, 활성화된 자가 반응성 I-4 CD8 양성 T 세포는 PicoGreen으로 녹색으로 염색되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 두 세포 유형은 50:1의 E:T 비율로 공배양되었습니다. KNIT-1의 미토콘드리아 막 전위는 400분의 지속 시간 동안 점차 소실되었으나, 이는 녹색 I-4 T 세포와 상호작용하는 클러스터에서만 나타났습니다. 대조 실험으로서, 염색된 KNIT-1 세포를 여기에서 보는 바와 같이 PicoGreen으로 염색된 MHC 불일치 인간 Jurkat T 세포와 함께 배양하였습니다.Knit one 세포는 400분 동안 미토콘드리아 막 전위를 유지할 수 있었습니다. Circuit 세포는 knit one 클러스터와 상호작용하지 않았으며, 따라서 세포 사멸을 유도하지 않았습니다. 숙달 완료 후.이 기술은 세포 준비를 포함하여 약 5일이 소요됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 자가반응성 T세포(Autoreactive T-cell)의 공격을 받을 때 베타 세포막 전위가 어떻게 변화하는지에 대해 충분히 이해할 수 있을 것입니다. 방사성 동위원소를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 교육을 이수하고 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

이 비디오는 세포독성 T 림프구 또는 CTL 반응에서 면역 우성을 분석하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 주입된 형광 표적 세포는 면역원성 항원결정기에 해당하는 다양한 형광을 나타냅니다. 비장 후 수집 및 분류를 통해 고강도 형광 세포가 감소하는 것으로 나타나 CTL 반응에서 면역 우세를 확인할 수 있습니다.

세포독성 T 림프구 반응에서 면역우성을 평가하기 위한 분석

이 비디오는 이식된 루시페라제 발현 베타 세포를 비만하지 않은 당뇨병성 면역결핍 마우스로 시각화하는 이미징 기반 방법을 보여줍니다. 당뇨병이 있는 쥐에서 비장세포를 도입하면 점진적인 베타 세포 파괴가 일어나며, 기질 도입 후 발광이 감소하여 시각적으로 확인됩니다.

당뇨병성 비장세포에 걸린 면역결핍 마우스의 형질전환 베타 세포 이미징(Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes)

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

이 연구는 췌장섬에서 사이토카인 유도 세포사멸 및 세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 컨포칼 현미경과 결합된 세포 사멸 및 세포자멸사에 대한 다중 염색 형광 기반 마커β 활용합니다. 그것은 세포 외 자극에 대한 반응으로 세포 사멸과 세포 사멸의 공간적, 시간적 변화를 보여줍니다.

Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

배우세요 CD8+ T 세포에 의한 췌장 베타 세포 사멸을 평가하는 두 가지 시험관 내 방법을. 크로뮴 51 방출 분석과 실시간 라이브 세포 이미징 기법을 통해 제1형 당뇨병의 자가면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

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