Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

다음 절차의 전반적인 목표는 동종 조혈모세포 이식(HSCT) 수혜자에게 입양 이식하기에 적합한 공여자 유래 바이러스 특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 신속하게 생성하는 것입니다. 이는 먼저 바이러스 항원을 인코딩하는 플라스미드로 수지상 세포(DC)를 핵전환시켜 항원 제시를 위한 프라이밍을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 핵전환된 DC를 사용하여 항원 특이적 T 세포를 자극하며, 이후 GASPAR라는 가스 투과성 배양 장치 내에서 IL-4 및 IL-7 존재 하에 이들을 증식시킵니다.

다음으로, 7일간의 배양 후 세포를 분할 및 계대 배양하고 배지를 보충하여 시험관 내 CTL 확장을 최대화합니다. 마지막으로, 12일째에 세포를 수확하여 순도, 효능 및 안전성을 테스트하고 이후 임상 사용을 위해 냉동 보존합니다. 결과적으로, 세포 내 사이토카인 염색, 인터페론 감마 생성 및 세포 독성 분석을 통해 입증된 바와 같이, 다중 바이러스 특이성과 최소한의 동종 반응성을 가진 CTL 라인을 생성할 수 있습니다.

다중 바이러스 특이적 세포독성 T세포주를 제조하는 과정은 시간이 많이 소요되고 까다롭습니다. 이 과정에는 EBV(Epstein-Barr 바이러스) 변형 B세포주와 아데노바이러스 벡터가 필요하며, 절차에 약 3개월이 소요됩니다. 본 연구의 새로운 방법은 바이러스 벡터를 사용하지 않습니다.

세포가 최소한의 손실로 배양액 내에서 지수적으로 성장하므로, 이 절차는 신속하며 비용 효율적입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 실험실의 임상 펠로우인 Eureka Gerdeman입니다. IL-4와 G-M-CSF가 첨가된 Cellgenic 배지에서 생성된 후 성숙 사이토카인에서 24시간 동안 성숙시킨 단핵구 유래 DCs를 수확합니다. 3 mL 전송 피펫을 사용하여 부드럽게 재현탁합니다. 트라이판 블루(trypan blue)를 사용하여 DCs의 수를 세고, 튜브당 최소 0.5 × 10⁶개에서 최대 2 × 10⁶개의 세포가 되도록 세 개의 15 mL 튜브에 분배합니다.

다음으로 DCS를 200 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 동안 이전과 동일한 DC 성숙 사이토카인 칵테일이 첨가된 cell genix 배지 6 mL를 준비하고, 12-well 조직 배양 처리 플레이트의 3개 웰에 2 mL씩 분주합니다. 사용하지 않는 웰에는 멸균수 2 mL를 채웁니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 배양기로 옮겨 미리 데워둡니다.

세포 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거하고, 각 튜브에 해당 DNA 플라스미드를 튜브당 5 µg의 최종 농도로 첨가합니다. 여기서는 IE1 pp65를 인코딩하는 플라스미드는 1번 튜브에, gB를 2번 튜브에, 그리고 EBN1 LMP2 BZ F1을 3번 튜브에 첨가합니다. 100 µL의 핵 형질전환 용액(nuclear transfection solution)을 사용하여 DCS와 DNA를 현탁합니다.

잘 섞은 후 혼합물을 Nucleofector 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 Nucleofector 장치에 배치합니다. 프로그램 CB150을 선택하고 전기천공 직후에 시작 버튼을 누릅니다.

미리 데워둔 CELLGENIC DC 성숙 배지 500 µL를 각 튜브에 넣고, 피펫으로 2~3회 부드럽게 섞어준 뒤, 핵산이 도입된 DC를 나머지 1.5 mL의 미리 데워둔 DC 성숙 배지가 들어 있는 준비된 12-웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 12~18시간 동안 더 배양한 후, 핵산이 도입된 DC를 수확하여 수를 셉니다. 세포를 10 mL의 CTL 배지로 한 번 세척한 다음, 배지 1 mL당 3 × 10⁵ DC 농도로 재현탁합니다. 세 가지 핵산 감염군 모두에서 최소 7.5 × 10⁵개(2.5 mL)에서 최대 1.5 × 10⁶개(5 mL)의 DC를 모아 혼합하고, 이렇게 풀링된 플라스미드가 형질전환된 DC를 G-Rex 장치로 옮깁니다.

그런 다음 리스폰더(responder) 세포 준비를 위해 장치를 인큐베이터에 넣습니다. DC 선택 후 남아있는 비부착 단핵구를 사용하십시오. 리스폰더 세포를 예열된 배양액으로 옮깁니다.

CTL 배지로 한 번 세척합니다. 세포를 CTL 배지에 현탁합니다. 세포 수를 측정하여 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다.

15 × 10⁶ 개의 세포 또는 7.5 mL를 취하여 사이토카인 IL-4와 IL-7을 첨가합니다. 7.5 mL의 PBMC를 G-Rex로 옮기고, CTL 배지를 추가하여 바이오리액터의 총 부피를 30 mL로 맞춥니다. 마지막으로, G-Rex를 인큐베이터에 넣고 6~7일 동안 배양하며, 6~7일 차에 배지 10 mL를 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 10 mL 피펫을 사용하여 남은 20 mL의 배지를 혼합합니다. 세포 수가 50 × 10⁶개 미만인 경우, trypan blue를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 신선한 배지와 사이토카인을 추가하여 배양액을 보충합니다.

세포 수가 50 × 10⁶개를 초과하는 경우, 세포 현탁액 10 mL를 제거하고 세포를 새로운 G rex로 옮긴 후, 두 G rex 모두에 신선한 CTL 배지와 사이토카인을 공급합니다. 세포를 4~6일 더 배양하여 충분한 수로 증식시킨 후, 세포를 수확하고 수를 측정합니다. 그 후, 표현형 또는 기능 분석에 사용되지 않은 세포는 향후 사용을 위해 동결 보존합니다. 인터페론 감마 ELISPOT으로 측정한 결과, 멀티코닉 DNA 플라스미드가 멀티바이러스 특이적 T 세포를 유도하며, 반응성 세포의 빈도가 동일한 항원을 발현하는 기존 PHU 플라스미드를 사용하여 생성된 세포주보다 더 높음을 보여주는 대표적인 결과입니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, DC와 PBMC의 최적 비율은 강력한 T-세포 자극을 위해 중요하며, 1:50 비율은 1:20의 자극 세포 대 반응 세포 비율과 비교했을 때 차단된 재활성화를 유도합니다. 이 그림에서 나타나듯 G rex에서의 CTL 배양은 기존의 24-well 플레이트와 비교하여 우수한 T-세포 확장을 지원합니다. 배양액에 IL-4와 IL-7을 첨가하면 확장된 세포의 레퍼토리와 특이성이 증가하는데, 여기서 CMV PP65 유래 HLA-A2 제한 NLV 펩타이드에 반응하는 T-세포의 빈도를 IL-4 및/또는 IL-7의 존재 여부에 따라 생성된 배양액에서 평가하였습니다. 이 그림은 빠르게 확장된 multi virus CTL의 표현형에 대한 대표 샘플을 보여주며, 이는 CD4 양성과 CD8 양성 T-세포가 혼합된 다클론성(polyclonal)이며, 대다수가 기억 마커인 CD45RO와 CD62L을 발현합니다. 확장된 CTL은 모든 자극 항원에 특이적이며 다기능성을 갖는데, 이는 크롬 방출 분석(chromium release assay)으로 평가한 후 항원 자극 후 인터페론 감마(interferon gamma)와 TNF-알파(TNF alpha)의 생성을 탐지하는 세포 내 사이토카인 염색을 통해 여기서 평가되었습니다.

확장된 CTL은 바이러스 표적을 특이적으로 사멸시킬 수 있으나, 비바이러스성 HLA 불일치 표적에 대해서는 비특이적 활성을 보이지 않았으며 이는 매우 중요한 안전성 고려 사항입니다. 이 영상을 시청하고 나면, GNP를 준수하며 바이러스 관련 질환 환자에게 입양 이식하기에 적합한 다중 바이러스 특이적 세포독성 T 세포주를 신속하게 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차의 간소화는 전문 제조 시설 너머로의 확장을 용이하게 하여, 면역 저하 상태이며 바이러스 관련 질환에 매우 취약한 환자들을 위한 표준 치료법으로 자리 잡는 데 기여할 것입니다.