Name: Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 다중바이러스 특이적 세포독성 T 림프구를 신속하게 생성하는 방법을 통해 동종조혈줄기세포이식 환자의 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 면역요법을 구현하는 기술입니다.

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이 작품은 셀룰러 테라피 (계약 NIH - NHLBI (HB - 10 - 03) HHSN26820100000C) (CMR), 셀 기반의 치료를위한 전문 센터에 대한 생산 지원에 의해 지원됩니다 부여 NIH - NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ASBMT 영 인베스티게이터 수상 (UG와 JV), 임상 연구 수상 (UG)에서 백혈병과 림프종 사회 특별 연구원, 그리고 에이미 Strelzer Manasevit 학술 수상 (AML).

1. 직류 nucleofection <ol><li> 셀 Genix IL4 (1000U/ml)와 보충 미디어 GMCSF (800IU/ml)와 추가 DC의 성숙의 크린 시토킨 IL4을 (1000U 사용하여 24 시간을위한 성숙을 사용하여 오일에 대한 교양 플라스틱 준수를 사용하여 풍부한되었습니다 하베스트 단핵구 - 파생 DC가, 3ml 전송 피펫과 부드러운 resuspension로 / ML), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF - α 10ng/ml, IL1 - β 10ng/ml 및 PGE2 (1μg/ml) 1. </li><li> trypan 파랑, 노 적은 6 0.5x10 이상과 배 15ml 튜브로 전송하고 더 이상 6 2x10 이상의 셀 / 튜브를 사용 가능한 DC가를 계산합니다. </li><li> 상업 중심지 @ 200g에 대한 DC가를 원심 분리기. 37 ° C / 5% CO 2 배양기에서 번호판을 처리 12 잘 조직 문화의 세 우물에 2ml/well -이 기간 동안 사전에 따뜻한 셀 Genix 미디어는 DC의 성숙의 크린 시토킨 (DC의 성숙 미디어)과 보완. </li><li> 일단 세포가 스피닝 완료, 뜨는을 기음과 DNA 5μg / 튜브의 최종 농도에 튜브의 각 관련 유전자 plasmids를 추가합니다. 이 경우에는 플라스미드 인코딩 튜브에 IE1 - pp65 # 1, 튜브에 Hexon - 펜톤 # 2, # 3 관 EBNA1 - LMP2 - BZLF1를 추가합니다. </li><li> Amaxa의 nucloefection 솔루션의 100μl와 Resuspend DCS 및 DNA가 잘 혼합하고 nucleofection의 cuvettes로 전송할 수 있습니다. </li><li> 4D nucleofector의 장소 cuvettes는, 프로그램 CB150 (Amaxa / Lonza)를 선택하고 시작을 누르십시오. </li><li> nucleofection가 쿠베트에 2ml 미리 예열 셀 Genix DC의 성숙 미디어의 500μl 추가 직후, prewarmed의 나머지 1.5 ML를 포함하는 준비된 12 잘 판에 2-3 시간, 전송 nucleofected DC가 아래로 pipetting과로 부드럽게 혼합 DC의 성숙 미디어. 37에 전송 ° C / 5% CO 2 배양기를 추가로 12 18hrs하십시오. </li></ol> 2. T 세포 자극 <ol><li> 수확 및 30Gy에서 nucleofected DC가를 계산하고, 비추다. CTL 매체 10ml (45 % RPMI, 45 % 클릭수 EHAA 10 % FBS, 2mM Glutamax)과 CTL 미디어 ML 당 resuspend @ 3 X 10 5 DC가 함께 한 번 씻으십시오. </li><li> 풀 7.5x10 5 (2.5ml)와 plasmids 각을 포함하는 DC가의 15x10 5 (5ml)의 최대 최소 그리고 보육에 배치됩니다 G - 렉스 장치에 DC가 풀링을 전송. </li><li> 응답 세포의 준비를 위해 이전에 냉동 PBMCs 또는 DC의 선택 (부착 또는 CD14 선택) 이후 유지 비 점착 성의 mononuclear 세포 중 하나를 사용합니다. 세포를 해동, prewarmed 문화 매체 전송, CTL 매체와 한 번 씻는다. CTL 미디어의 세포를 Resuspend, 세포를 포함하고 ML 당 2x10 6 세포의 농도로 끌고 오너라. 와 300ng IL7 (10ng/ml - 최종 CONC.) - 30000U IL4 (. 최종 CONC 1000U/ml)와 15x10 6 셀 또는 7.5ml 및 보충 가져가라. </li><li> G - 렉스와 30ml의 총 볼륨 CTL 매체와 생물 반응기까지 가기 PBMC의 7.5ml을 (15x10 6 셀) 전송합니다. </li><li> 문화 37 6~7일을위한 G - 렉스 ° C / 5% humidified CO 2 배양기. </li></ol> 3. T 세포 확장 <ol><li> 일 6-7 일, 미디어의 대기음의 10ml, 그때 10ml 피펫과 함께 미디어의 남은 20ml에 세포를 혼합하고 trypan 파랑을 사용 가능한 세포를 계산합니다. 있다면 &lt;50x10 6 새로운 미디어 + 크린 시토킨과 보충. &gt; 50x10 6 세포가있다면 세포 현탁액의 10ml를 제거, 새로운 G - 렉스로 전송하고 신선한 CTL 미디어 + 크린 시토킨과 함께 모두 G - 렉스스 먹이. </li><li> 추가 4-6일을위한 문화. 일단 충분한 세포는 나중에 사용하기 위해 CTL과 cryopreserve 초과 phenotypic과 기능 특성을 수행 확장되었습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 우리의 FDA 승인 multivirus 특정 CTL 생성 과정의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 바이러스 반응 T 세포를 자극 adenovectors과 EBV - LCL를 사용하여 대회 multivirus CTL 프로토콜과는 달리 2 우리의 DNA plasmids과 전염성 바이러스 자료를 교체했습니다 그 바이러스 3 각에서 파생된 여러 항원을 인코딩. trivirus의 CTL을 자극하기 위해 우리는 EBV 세 multicistronic plasmids 인코딩 Hexon과 펜톤 아데노 바이러스의 IE1 및 pp65 CMV, 그리고 EBNA1, LMP2 및 BZLF1을 설계했습니다. 이러한 항원들은 우리 자신과 T 세포가 교수실 hexon과 펜톤 2,4-6에 대한 감독 및 CMV - 1E1과 CMV - pp65은 생체내 7 보호 아르에게 보여주는 다른 그룹의 임상 결과를 장려하고 기반으로 선정되었습니다. EBV 들어, EBNA1는 immunodominant CD4 + 모든 EBV - 관련 malignancies 및 일반 EBV에 감염된 B 세포 표현 T 세포의 대상 항원이다 8,9, LMP2 여러 HLA 유형에 걸쳐 immunogenic이며, 대부분의 EBV malignancies로 표현, 10,11 BZLF1 동안 대부분의 개인에서 모두 CD4 +와 CD8 + T 세포를 자극하고 공동에 대한 가능성이 중요합니다 immunodominant, 즉각적인 초기 lytic 순환 항원을 인코딩바이러스 12 복제 세포 ntrol. 추가로 우리의 제조 방법을 최적화하기 위해 우리는 CTL 자극 13,14에 대한 minimalized, 항생제없는 (FDA 호환) plasmids를 생성 자연 기술과 협력. 같은 IFNγ ELIspot에 의해 측정된 최적의 DNA plasmids에 대한 응답으로 바이러스 구체적인 T 세포의 빈도가 큰 것을 높은 세포 생존 (데이터가 표시되지 않음) 3. 그림 2 프로그램을 유지하면서이 전략을 사용하면 우리는 지속적으로&gt; 35%의 nucleofection 효율성을 달성 동일한 항원 (N = 8 아데노 바이러스, N = 4 CMV하고, N = 2 EBV)를 표현하는 기존 pShuttle 기반 표현 plasmids에 대한 응답으로보다. DC의 최적 비율 : R 비율 (N = 2 기증자) : PBMC는 1시 50분의 비율이 1시 20분 S에 비해 하위 최적 활성화를 생산 그림 3과 같이 강력한 T 세포 자극에 중요했다. 광범위한 항원 특이성과 충분한 CTL 숫자의 생산 세 바이러스에 대한 임상 효능을위한 필수 조건입니다. 문화 증가 IL4과 IL7의 덧셈으로 레퍼토리와 특이성이 그림 4B에 표시하면서 이것은, 종래의 24 잘 접시 (그림 4A) 15와 비교하여 우수한 T 세포 확장을 지원하는 G - 렉스에 CTL 문화에 의해 이루어집니다 CMV - pp65 - 파생 HLA - A2에 대한 반응 T 세포의 빈도가 resticted 어디 NLV 펩타이드는 IL4 및 / 또는 IL7 16,17의 존재 또는 부재에서 생성된 문화에 평가되었다. cryopreservation / 주입을위한 최종 제품에 우리가 흐름 cytometric 분석을 수행 확장 세포, 세포 시토킨 얼룩 / IFNγ ELIspot 및 CR 51 릴리스 assays의 표현형 및 기능적 능력을 평가합니다. 일반적으로 생성된 세포가 CD4 + 두 T 세포 구획에 감지 항원 특이성과 CD8 + T 세포의 혼합 인구 polyclonal 있습니다. CTL들은 생체내 (그림 5)에 이식 - 대 - 호스트 질병 (GvHD)을 유발해서는 안 나타냅니다, 바이러스 부분 - HLA 일치 목표 부정하지 바이러스성 항원 표현 대상 세포를 죽일하지만 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. rCTL ​​생성 프로토콜. 첫째, DC가이 바이러스 항원 - 인코딩 plasmids와 nucleofected 그리고 R에 au​​tologous PBMCs와 혼합 : 10 20시 1분의 S. 전지는 다음 수확 집계, 기능, 정체성과 불임에 대한 검사, 그리고 임상 사용을위한 cryopreserved IL4과 IL7의 면전에서 10~14일에 대한 G - 렉스로 확장됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 최적의 DNA plasmids은 체외에서 우수한 T 세포 활성화를 유도. DC가이 최적화, FDA 준수 plasmids 인코딩 Hexon와 펜톤 (교수실), IE1 및 pp65 (CMV) 및 EBNA1, LMP2 및 BZLF1 (EBV) 또는 동일한 항원을 인코딩 기존 pShuttle의 plasmids과 nucleofected되었습니다. 이들은 T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다과 특이성은 IFNγ ELIspot 10 일 이후의 자극에 의​​해 분석되었다. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3 최적의 DC :. CTL 활성화를위한 T 세포의 비율. 이 기증자의 DC가 세 개 모두 최적화 plasmids와 nucleofected 후 1시 20분 또는 1시 50분 DC에서 autologous PBMCs을 자극하는 데 사용되었습니다 PBMC 비율. 활성화 T 세포의 빈도가 IFNγ에 의해 ELIspot 일 10 일 평가했다. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 향상 크린 시토킨를 사용하여 G - 렉스의 T 세포 확장. 패널 A는 G - 렉스 장치뿐만 아니라 현미경으로 평가 가스 침투성 막에 CTL 외관을 보여줍니다. 접시 VS G - 렉스를 취급 대회 조직 문화 달성 셀 출력 비교도 표시됩니다. 패널 B는 아니 시토킨 혼자 IL4, IL7 혼자하고 IL4 + IL7의 존재의 확장 문화에 달성 CMV pentamer 긍정적인 CTL의 빈도를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 표현형 및 확장 CTL의 기능을 수행합니다. 와 CD8 + - 패널 A는 CD4 + (도우미 45 %)의 혼합물로 polyclonal있는 확장 multivirus의 CTL의 표현형의 대표 예를 나타냅니다 (42 % - 세포 독성) 대부분 (95 %)을 표현하는 T 세포, 메모리 마커 CD45RO + / CD62L +. 패널 B는 이러한 세포가 모든 자극 항원에 대한 특정하고 IFNΓ의 생산과 항원 자극 후 TNFα를 감지하는 세포 시토킨 얼룩에 의해 평가로 polyfunctional 것을 보여줍니다. 패널 C는 확장 CTL가 측정으로 작동되는 보여줍니다 CR 51 분석에 의해. Autologous LCL, 단독으로 또는 CMV - pp65을 표현 NULL 벡터 또는 adenoviral 벡터와 transduced는 타르로 사용되었습니다도착. Alloreactivity은 대상으로 allogeneic PHA의 폭발을 사용하여 평가되었다.

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후안 F. 베라 윌슨 늑대 제조 컨설턴트입니다. 다른 저자는 관련 공개가 없습니다.

바이러스성 감염은 자신의 질병 또는 치료에 의해 immunocompromised 아르 환자에서 상당한 병적 상태와 사망률을 차지합니다. HSCT 후, 예를 들어, EBV와 CMV뿐만 아니라 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)와 같은 호흡기 바이러스와 같은 영구 herpesviruses에 의한 감염은 잘 알려진 반면 교수실, BK 바이러스에 의한 감염의 중요성, 인간 herpesvirus는 (HHV) -6 더 최근에는 감사하고 있습니다. 약리 대리인 어떤 감염에 대한 표준 치료하는 동안, 그들은 실질적인 toxicities을 가지고, 강한 변종을 생성하고, 자주 비효 있습니다. 대조적으로, 줄기 세포 기증자에서 파생된 바이러스 구체적인 T 세포는 hemopoietic 줄기 세포 이식에 바이러스 감염 또는 질병 (HSCT) 설정 2,5,6,18-21의 예방 및 치료에 안전하고 효과적인 입증했습니다. 그러나 T 세포 immunotherapy의 광범위한 구현 궁극적으로 CTL 생산에 필요한 비용, 복잡하고 시간에 따라 제한됩니다. 현재 원고에 기술된 multivirus CTL을 생성하기 위해 우리의 소설과 빠른 접근 방식은 실질적으로 immunocompromised 호스트에 대한 치료의 표준이 될 수있는 전략을 사용, 바이러스성 질환에 대한 세포 독성 T 세포 치료의 가능성을 증가한다. APCs로 플라스미드 nucleofected DC가의 사용은 다른 DC의 집단은 각각의 플라스미드 3 활용되기 때문에 하나의 셀 안에 표시되고 여러 바이러스 항원의 바이러스성 벡터는 물론 경쟁없이는 MHC 클래스 I 및 II 모두에서 항원 프레 젠 테이션을 수 있습니다. correspondingly 16,17 항원에 특정한 T 세포 응답의 주파수와 레퍼토리을 높일 수 있습니다 IL - 7분의 4 증가 T 세포 생존과 확산의 사용합니다. 마지막으로, G - 렉스의 문화는 크게 문화 중 T 세포 apoptosis을 줄일 수 있습니다. 가스 교환 (에서 O 2, CO 2 아웃)가 더 많은 영양소를 제공하고 폐기물을 diluting, 세포 위의 매체보다 깊이있게하면서 hypoxia을 방지, 술병의 바닥에 가스 투과 실리콘 막에 걸쳐 발생합니다. 이 플랫폼은 또한 보호 항원을 식별하는 경우 추가로 바이러스 확장될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D 시스템 </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> 인간 AB 혈청 </td><td> 밸리 바이오 메디컬 주식 회사 </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF - 1001B &amp; AAF - 1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection 키트 </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP - 3012 </td></tr><tr><td> Plasmids </td><td> NTC </td><td> N / A </td></tr><tr><td> GM - CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> 201 - LB - 025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206 - IL - CF </td></tr><tr><td> TNFα </td><td> R &amp; D </td><td> 210 - TA - 010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> 시그마 </td><td> P6532 - 1MG </td></tr><tr><td> G - 렉스 </td><td> 윌슨 울프 제조 </td><td> AY11 - 00027 </td></tr></tbody></table>

multivirus 특정 t 세포 생성 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

바이러스성 감염은 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자의 병적 상태와 사망률의 원인이됩니다. 우리와 다른 사람이 성공적으로 생성되고 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)와 monocytes와를 사용하여 아데노 바이러스 (교수실)에 대한 T - 세포를 특정 주입이 EBV - 변환 lymphoblastoid 셀 (EBV - LCL) 아데노 바이러스 벡터와 마찬가지로 유전자 - 수정 항원 제시 세포 (APCs). 마찬가지로 몇 가지 2x10으로 5 / kg trivirus 특정 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)은 주입 후 몇 가지 로그의 확산 및 다른 가능한 치료에 내성도 심각한 바이러스성 질병을 예방하고 치료 나타났다. 준비 -이 장려 접근법의 광범위한 구현은 높은 생산 비용, 제조의 복잡 성과 연장 시간 (총 10-14주 CTL 제조 EBV - LCL의 생성 및 4~8주에 대한 4~6주)에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 새로운 GMP 준수 CTL 생산 프로토콜을 개발했습니다. 첫째, 우리는 항원 제시와 같은 DNA plasmids 인코딩 LMP2, EBNA1 및 BZLF1 (EBV), Hexon 및 펜톤 (교수실), 그리고 pp65 및 IE1 (CMV)와 nucleofected 돌기 세포 (DCS)를 사용하여 T - 세포를 자극하는 adenovectors 대신에 세포. 이러한 APCs는 모든 자극 항원에 대한 T 세포가 특정 재활 성화. 둘째, 문화는 IL - 4의 존재에 T - 세포를 활성화 (1,000 U / ML)와 IL - 7 (10ng/ml)은 증가 및 라인에서 특정 T 세포의 레퍼토리와 주파수를 부양하고 있습니다. 셋째, 우리는 따라서 EBV - LCLs에 대한 요구 사항을 제거하고 기술자의 개입을 줄이고, 하나의 자극 후 대형 세포 숫자의 확장과 생존을 촉진 새로운 가스 투과 문화 장치를 (G - 렉스) 사용하고 있습니다. 이러한 변경 사항을 구현함으로써 우리는 지금&gt; 90%에 의해 줄어 듭니다 10 6 세포 당 비용 EBV, CMV 및 교수실을 대상으로 multispecific CTL를 생산하고, 수있는 추가로 연장할 수 있습니다 접근법을 사용 단 십일 오히려 10 주 보호 바이러스 항원. 우리의 FDA 승인 접근 방식은 높은 위험 allogeneic HSCT받는 사람에 대한 예방 및 치료 응용 프로그램에 가치가 있어야합니다.

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

바이러스 감염은 동종 조혈모세포 이식(HSCT) 수혜자에게 이환 및 사망을 초래합니다. 본 연구진과 다른 연구자들은 성공적으로...

다음 절차의 전반적인 목표는 동종 조혈모세포 이식(HSCT) 수혜자에게 입양 이식하기에 적합한 공여자 유래 바이러스 특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 신속하게 생성하는 것입니다. 이는 먼저 바이러스 항원을 인코딩하는 플라스미드로 수지상 세포(DC)를 핵전환시켜 항원 제시를 위한 프라이밍을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 핵전환된 DC를 사용하여 항원 특이적 T 세포를 자극하며, 이후 GASPAR라는 가스 투과성 배양 장치 내에서 IL-4 및 IL-7 존재 하에 이들을 증식시킵니다.다음으로, 7일간의 배양 후 세포를 분할 및 계대 배양하고 배지를 보충하여 시험관 내 CTL 확장을 최대화합니다. 마지막으로, 12일째에 세포를 수확하여 순도, 효능 및 안전성을 테스트하고 이후 임상 사용을 위해 냉동 보존합니다. 결과적으로, 세포 내 사이토카인 염색, 인터페론 감마 생성 및 세포 독성 분석을 통해 입증된 바와 같이, 다중 바이러스 특이성과 최소한의 동종 반응성을 가진 CTL 라인을 생성할 수 있습니다.다중 바이러스 특이적 세포독성 T세포주를 제조하는 과정은 시간이 많이 소요되고 까다롭습니다. 이 과정에는 EBV(Epstein-Barr 바이러스) 변형 B세포주와 아데노바이러스 벡터가 필요하며, 절차에 약 3개월이 소요됩니다. 본 연구의 새로운 방법은 바이러스 벡터를 사용하지 않습니다.세포가 최소한의 손실로 배양액 내에서 지수적으로 성장하므로, 이 절차는 신속하며 비용 효율적입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 실험실의 임상 펠로우인 Eureka Gerdeman입니다. IL-4와 G-M-CSF가 첨가된 Cellgenic 배지에서 생성된 후 성숙 사이토카인에서 24시간 동안 성숙시킨 단핵구 유래 DCs를 수확합니다. 3 mL 전송 피펫을 사용하여 부드럽게 재현탁합니다. 트라이판 블루(trypan blue)를 사용하여 DCs의 수를 세고, 튜브당 최소 0.5 × 10⁶개에서 최대 2 × 10⁶개의 세포가 되도록 세 개의 15 mL 튜브에 분배합니다.다음으로 DCS를 200 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 동안 이전과 동일한 DC 성숙 사이토카인 칵테일이 첨가된 cell genix 배지 6 mL를 준비하고, 12-well 조직 배양 처리 플레이트의 3개 웰에 2 mL씩 분주합니다. 사용하지 않는 웰에는 멸균수 2 mL를 채웁니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 배양기로 옮겨 미리 데워둡니다.세포 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거하고, 각 튜브에 해당 DNA 플라스미드를 튜브당 5 µg의 최종 농도로 첨가합니다. 여기서는 IE1 pp65를 인코딩하는 플라스미드는 1번 튜브에, gB를 2번 튜브에, 그리고 EBN1 LMP2 BZ F1을 3번 튜브에 첨가합니다. 100 µL의 핵 형질전환 용액(nuclear transfection solution)을 사용하여 DCS와 DNA를 현탁합니다.잘 섞은 후 혼합물을 Nucleofector 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 Nucleofector 장치에 배치합니다. 프로그램 CB150을 선택하고 전기천공 직후에 시작 버튼을 누릅니다.미리 데워둔 CELLGENIC DC 성숙 배지 500 µL를 각 튜브에 넣고, 피펫으로 2~3회 부드럽게 섞어준 뒤, 핵산이 도입된 DC를 나머지 1.5 mL의 미리 데워둔 DC 성숙 배지가 들어 있는 준비된 12-웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 12~18시간 동안 더 배양한 후, 핵산이 도입된 DC를 수확하여 수를 셉니다. 세포를 10 mL의 CTL 배지로 한 번 세척한 다음, 배지 1 mL당 3 × 10⁵ DC 농도로 재현탁합니다. 세 가지 핵산 감염군 모두에서 최소 7.5 × 10⁵개(2.5 mL)에서 최대 1.5 × 10⁶개(5 mL)의 DC를 모아 혼합하고, 이렇게 풀링된 플라스미드가 형질전환된 DC를 G-Rex 장치로 옮깁니다.그런 다음 리스폰더(responder) 세포 준비를 위해 장치를 인큐베이터에 넣습니다. DC 선택 후 남아있는 비부착 단핵구를 사용하십시오. 리스폰더 세포를 예열된 배양액으로 옮깁니다.CTL 배지로 한 번 세척합니다. 세포를 CTL 배지에 현탁합니다. 세포 수를 측정하여 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다.15 × 10⁶ 개의 세포 또는 7.5 mL를 취하여 사이토카인 IL-4와 IL-7을 첨가합니다. 7.5 mL의 PBMC를 G-Rex로 옮기고, CTL 배지를 추가하여 바이오리액터의 총 부피를 30 mL로 맞춥니다. 마지막으로, G-Rex를 인큐베이터에 넣고 6~7일 동안 배양하며, 6~7일 차에 배지 10 mL를 흡입하여 제거합니다.그 다음, 10 mL 피펫을 사용하여 남은 20 mL의 배지를 혼합합니다. 세포 수가 50 × 10⁶개 미만인 경우, trypan blue를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 신선한 배지와 사이토카인을 추가하여 배양액을 보충합니다.세포 수가 50 × 10⁶개를 초과하는 경우, 세포 현탁액 10 mL를 제거하고 세포를 새로운 G rex로 옮긴 후, 두 G rex 모두에 신선한 CTL 배지와 사이토카인을 공급합니다. 세포를 4~6일 더 배양하여 충분한 수로 증식시킨 후, 세포를 수확하고 수를 측정합니다. 그 후, 표현형 또는 기능 분석에 사용되지 않은 세포는 향후 사용을 위해 동결 보존합니다. 인터페론 감마 ELISPOT으로 측정한 결과, 멀티코닉 DNA 플라스미드가 멀티바이러스 특이적 T 세포를 유도하며, 반응성 세포의 빈도가 동일한 항원을 발현하는 기존 PHU 플라스미드를 사용하여 생성된 세포주보다 더 높음을 보여주는 대표적인 결과입니다.이 그림에서 보는 바와 같이, DC와 PBMC의 최적 비율은 강력한 T-세포 자극을 위해 중요하며, 1:50 비율은 1:20의 자극 세포 대 반응 세포 비율과 비교했을 때 차단된 재활성화를 유도합니다. 이 그림에서 나타나듯 G rex에서의 CTL 배양은 기존의 24-well 플레이트와 비교하여 우수한 T-세포 확장을 지원합니다. 배양액에 IL-4와 IL-7을 첨가하면 확장된 세포의 레퍼토리와 특이성이 증가하는데, 여기서 CMV PP65 유래 HLA-A2 제한 NLV 펩타이드에 반응하는 T-세포의 빈도를 IL-4 및/또는 IL-7의 존재 여부에 따라 생성된 배양액에서 평가하였습니다. 이 그림은 빠르게 확장된 multi virus CTL의 표현형에 대한 대표 샘플을 보여주며, 이는 CD4 양성과 CD8 양성 T-세포가 혼합된 다클론성(polyclonal)이며, 대다수가 기억 마커인 CD45RO와 CD62L을 발현합니다. 확장된 CTL은 모든 자극 항원에 특이적이며 다기능성을 갖는데, 이는 크롬 방출 분석(chromium release assay)으로 평가한 후 항원 자극 후 인터페론 감마(interferon gamma)와 TNF-알파(TNF alpha)의 생성을 탐지하는 세포 내 사이토카인 염색을 통해 여기서 평가되었습니다.확장된 CTL은 바이러스 표적을 특이적으로 사멸시킬 수 있으나, 비바이러스성 HLA 불일치 표적에 대해서는 비특이적 활성을 보이지 않았으며 이는 매우 중요한 안전성 고려 사항입니다. 이 영상을 시청하고 나면, GNP를 준수하며 바이러스 관련 질환 환자에게 입양 이식하기에 적합한 다중 바이러스 특이적 세포독성 T 세포주를 신속하게 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차의 간소화는 전문 제조 시설 너머로의 확장을 용이하게 하여, 면역 저하 상태이며 바이러스 관련 질환에 매우 취약한 환자들을 위한 표준 치료법으로 자리 잡는 데 기여할 것입니다.

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 CD8+ T 세포를 사용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제를 억제하는 분석을 보여줍니다. HBV 특이적 수용체로 조작된 이 T 세포는 형질전환 마우스로 전달됩니다. 그런 다음 복제 가능한 HBV 게놈 플라스미드를 간에 직접 주입하여 바이러스 DNA 흡수를 가능하게 합니다. 바이러스 항원이 하이브리드 MHC-I 분자에 의해 발현되고 제시되면 조작된 T 세포는 이러한 복합체를 인식하고 결합합니다. 이는 세포독성 분자의 방출을 유발하여 HBV에 감염된 간 세포를 파괴하고 바이러스 복제를 억제합니다.

바이러스 항원 특이적 T 세포를 이용한 B형 간염 바이러스 복제 억제

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

학습하세요 다중바이러스 특이적 세포독성 T 림프구를 신속하게 생성하는 방법을 통해 동종조혈줄기세포이식 환자의 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 면역요법을 구현하는 기술입니다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

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