Name: 재조합 가용성식이 GM - CSF 수용체를 사용하여 GM - CSF 항체의 중화 능력을 예측 세포 분석 시스템 무료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 GM-CSF 자가항체의 중화 능력을 정량화하는 무세포 수용체 결합 분석법을 사용하여 면역학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 재현성이 높아 전통적인 바이오분석법보다 우수한 결과를 제공합니다.

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우리가 그들의 귀중한 공헌에 대한 K. Nakagaki 박사 H. 이시이 박사 K. 스즈키, A. 야마가타, K. Oofusa 매우 감사하고 있습니다.

1. sGMRα의 생산 및 정화 <ol><li> 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 의해 인간의 태반 cDNA 라이브러리에서 sGMRα의 cDNA 확대. </li><li> 그의 태그 다른 PCR에 의해 PCR의 amplicon에 3 '끝에 50 기본 baculovirus의 polyhedrin 엔드의 5' - UTR 순서 27 기본 코딩 RGS를 추가합니다. </li><li> 플라스미드 pMSG1.1MG로 증폭 PCR 제품을 넣습니다. </li><li> 도우미 벡터 누에 쿨러 - W1 스트레인의 계란에 pHA3PIG로 구성 psGMR/M1.1MG을 주사. </li><li> 25 나방에 후면 부화 유충 G0 ° C. 형질 누에가 sGMRα 유전자를 베어링 얻기 위해 눈에 MGFP 표현을 위해 형제간에 또는 쿨러 - W1과 짝짓기로 확인한 화면 G1의 배아. </li><li> 500mM NaCl을 포함하는 인산염 버퍼와 유전자 변형 누에의 고치에서 재조합 sGMRα을 추출하고 4 저어 ° C를 24 시간을위한. </li><li> 이 precipitates 제거하는 15에 대한 20,000그램에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 니켈 - 친화 컬럼에 뜨는 적용됩니다. </li><li> 10mM 이미다졸, 500mM NaCl 및 20mM 인산 나트륨, pH6.3, 그리고 10mM에서 250mM로 졸의 선형 그라디언트로 elute로 컬럼을 씻으십시오. 에 대한 정화 sGMRα 및 dialyze 들어있는 분수 수영장 생리 인산염은 버퍼 (pH7.4) (PBS). </li></ol> 2. GM - CSF 재조합의 Biotinylation <ol><li> PBS에 대한 투석에 의해 sorbitol 준비를 제거합니다. </li><li> 얼음 솔루션 4 20mM 추위 나트륨 메타 periodate 솔루션 ° C의 1ml을 추가합니다. </li><li> 어두운 얼음 속에서 30 분에 대한 샘플을 품어. </li><li> 15mM의 최종 농도의 용액에 글리세롤을 추가합니다. </li><li> 100mM 아세트산 나트륨 버퍼 (pH5.5)에 대한 솔루션을 Dialyze </li><li> 5mM의 최종 농도에서 솔루션에 비오틴의 히드라 지드를 추가하고 지속적으로 실온에서 2 시간에 대한 솔루션을 선동하다. </li><li> PBS, pH7.4에 대한 투석에 의해 비 반응 물질을 제거합니다. </li></ol> 3. 셀 - 무료 GM - CSF 수용체 - 리간드 결합 분석 <ol><li> 4 박 단클론 항 polyHistidine 항체의 50μl와 코트 microtiter 접시 ° C. </li><li> PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 4 3H에 대한 차단 솔루션과 부화 ° C.의 100μl 추가 </li><li> PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 차단 솔루션에 sGMRα의 50μl를 추가하고 4 박 품어 ° C. </li><li> PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오. </li><li> GM - CSF 다음 autoantibody와 GM - CSF biotinylated의 25μl를 포함하는 샘플 25μl를 추가합니다. 4 1 시간에 대한 품어 ° C는 sGMRα - GM - CSF의 복합을 형성합니다. </li><li> PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 4 1시간에 대한 0.4mM streptavidin 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 50μl를 추가 ° C의 biotinylated GM - CSF 바운드 sGMRα를 검색할 수 있습니다. </li><li> PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 솔루션에 chemiluminescent 기판의 50μl를 추가하고 실온에서 1 시간을위한 incubated. </li><li> chemiluminescence 플레이트 판독기를 사용하여 chemiluminescence 활동을 감지합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : GM - CSF 수용체 신호 전달 경로의 첫 번째 단계는 세포 표면에 GM - CSF 수용체 알파에 GM - CSF의 바인딩입니다. GM - CSF autoantibody 특별히 GM - CSF를 바인딩하고 체외 16,17에있는 수용체에 그것의 바인딩을 차단하기 때문에, 우리는 autoantibodies 직접 GM - CSF에 바인딩하여 첫 번째 반응을 억제 것을 가상. 마찬가지로 앞에서 설명한 (Ref. 9-15), 우리는 고순도로 재조합 sGMRα 많은 양의 얻기 위해 유전자 변형 누에 기술을 적용. 오직 monomeric 양식이 감소 조건에서 검색되었습니다 반면, 누에 파생 재조합 sGMRα가 아닌 절감 조건 SDS - PAGE에로드되었을 때, sGMRα은 (그림 1B), 두 monomeric (45 KDA)와 dimeric (90 KDA) 양식을 보여주 , 재조합 sGMRα은 단량체 및 체인이 황을 통해 연결된 dimmers 18 혼합 것을 나타냅니다. 셀 - 무료 시스템 (그림 2A)를 사용하여, 우리는 GM - CSF의 autoantibodies (그림 2B 및 그림. 2C)에 의해 sGMRα에 GM - CSF 바인딩의 억제를 평가했다. 이러한 방법은 우라노 외 의해 참조 19 설명했다. 성장 억제는 밀접하게 GM - CSF autoantibody (그림 3A) 19의 다양한 농도에 구속력을 억제 (R = 0.988, P = 0.002)과 상관했다. 마찬가지로, 바인딩 억제가 크게 성장 억제와 상관했다. 바인딩 억제는 GM - CSF의 autoantibodies (그림 3B) 19 복용량에 의존 방식으로 증가했다. 다른 환자에서 혈청 IgG의 분수에 대한 이러한 두 매개 변수가 서로 상관 있었다 (R = 0.589 P = 0.006, 그림. 3C). 어느 구속력을 억제하거나 성장 억제는 KD 가치와 상관하고, 따라서 두 매개 변수를 바인딩 친화력 19 영향을받지되었습니다. 구속력와 g 사이의 데이터의 재현성 결과세 가지 다른 샘플에 세 개의 독립적인 실험을 통해 얻은 rowth 억제가 평가되었다. 변화의 계수는 세포없는 시스템 bioassay (표 1)의 그것보다 더 좋은 것을 지적했다. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 유전자 변형 누에를 사용 sGMRα의 생산을위한 절차 플로우 차트. 변환 벡터 9-11의 A) 구조물. 절감 및 비 절감 조건 정화 sGMRα의 B) SDS - PAGE와 쿠매시 브릴리언트 블루 염색법. sGMRα, 가용성 GM - CSF 수용체 알파, MGFP, 괴물 녹색 형광 단백질, BmNPVpol5' - UTR, Bombyx 모리 핵 polyhedrosis 바이러스 polyhedrin의 5' - 번역되지 않은 지역의 순서, SV40 polyA, SV40 polyA 신호 시퀀스, P 3xP3, 3xP3 발기인; P ser1, ser1 발기인; fibL polyA, 피브로인 L - 체인 polyA 신호 시퀀스, hr3, Bombyx 모리 핵 polyhedrosis 바이러스 hr3 향상제. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 전지 - 무료 분석 시스템의 제도. 누에 제작한 sGMRα를 사용하여 A) 경쟁 바인딩 분석. B) 중화가 아닌 중화 항체의 효과 세포가없는 시스템에서 바인딩을 억제에. C) 중화 항체가 아닌 중화 항체의 다양한 농도 사이의 바인딩 억제의 차이. GM - CSF, 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자, sGMRα, GM - CSF 가용성 수용체 알파, 그의, RGS, 그 태그, AP, 알칼리성 인산 가수 분해 효소. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. GM - CSF polyclonal 항체 또는 면역 PAP 환자에서 혈청 IgG의 분수의 효과에 의해 sGMRα에 GM - CSF 바인딩을 억제. GM - CSF autoantibody에 의해 구속력을 저해하고 성장 억제 사이의) 관계. GM - CSF autoantibody의 다양한 농도에서 B) 바인딩 억제. 혈청 IgG의 분수 19 %의 바인딩을 억제하고 %의 성장 억제를위한 IC ~ 50 세 C) 관계. IC 50, 50 % 억제 농도, GM - CSF, 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자. <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> 인터 - 검정 </td></tr><tr><td> # 결정의 </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 평균 값 (% 구속력을 억제) </td><td> 61.6 </td><td> 63.8 </td><td> 69.7 </td></tr><tr><td> 평균 값 (%의 성장 억제) </td><td> 21.0 </td><td> 73.4 </td><td> 82.8 </td></tr><tr><td> 변동 계수 (%) (% 구속력을 억제) </td><td> 6.0 </td><td> 5.6 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> 변동 계수 (%) (%의 성장 억제) </td><td> 64.4 </td><td> 18.3 </td><td> 10.4 </td></tr></tbody></table> 두 assays 5 NG / ML GM - CSF 및 GM - CSF autoantibody와 같은 농도에서 수행되었다. 표 1. 세 독립적인 실험을 통해 얻은 %의 바인딩과 성장의 통제 사이의 변형 계수의 비교.

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</ol>

셀 - 무료 분석 뛰어난 재현성과 인텔리와 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 추정했다. GM - CSF의 autoantibodies 또는 환자의 혈청 IgG의 분수에 의해 바인딩을 억제이 분석에 의해 평가되었다. 데이터 셀없는 분석의 바인딩 억제 각각 TF - 1 세포를 사용하여 bioassay의 성장을 억제 사이의 상관을 보여주었다. bioassay 널리 이용하지만, 여러 가지 시설과 우리는이 새로운 시스템을 사용하여 피할 수 있습니다 다른 시간 지점 사이의 데이터를 비교에 어려움을 숨겨왔다. GM - CSF는 낮은 선호도와 sGMRα에 바인딩하고 바이너리 복잡한 형태 20. 최근 연구는 인간의 GM - CSF는 GM - CSF 수용체 알파와 세포 표면 21 높은 친화력을 가진 dodecameric 복잡한를 형성 GM - CSF 수용체 베타에 바인딩되는 보여주었다. 따라서, GM - CSF monomeric 수...

재조합 가용성식이 gm - csf 수용체를 사용하여 gm - csf 항체의 중화 능력을 예측 세포 분석 시스템 무료

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

배경 : 이전, 우리가 중화 능력을 보여주지만, GM - CSF autoantibody 아니다 농도가 면역 폐의 폐포의 proteinosis (PAP) 1-3 환자의 질병 심각와 상관했다. 폐에 GM - CSF의 bioactivity 폐기가 4,5 면역 PAP에 대한 가능성이 원인이기 때문에, 그것은 PAP 각 환자의 질병 심각도를 평가하기위한 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 측정하는 약속입니다. 지금까지 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력은 인간의 골수 세포 또는 GM - CSF 6-8로 자극 TF - 1 세포의 성장 억제를 평가하여 평가되었습니다. bioassay 시스템에서, 그러나, 그것은 지속적인 상태로 세포를 유지 기술적인 문제로 인해 서로 다른 실험실에서 데이터를 비교하기 위해 신뢰할 수있는 데이터뿐만 아니라를 얻기 위해 종종 문제가됩니다. 목표 : 세포없는 수용체 결합 - 검정을 사용하여 세포 표면에 GM - CSF 수용체에 바인딩 GM - CSF를 모방합니다. 방법 : 트렌스 제닉 누에 기술은 고순도 9-13로 재조합 수용성 GM - CSF 수용체 알파 (sGMRα)에 대한 큰 금액을 얻기 위해 적용되었다. 재조합 sGMRα은 실크 단백질에 융합되지 않고 실크 스레드의 친수성 sericin 층에 포함된되었고, 따라서, 우리는 쉽게 중립 수성 솔루션 14,15 잘 순도의 고치에서 추출할 수 있습니다. 다행히도, GM - CSF와 바인딩에 대한 중요한 올리 고당 구조는 다른 곤충이나 효모에 의해 만들어진보다 인간 sGMRα의 구조에 더 비슷합니다. 결과 : sGMRα를 사용하여 셀 - 무료 분석 시스템이 높은 소성과 안정성으로 데이터를 굴복. sGMRα에 바인딩 GM - CSF는 sGMRα를 사용하여 새로운 세포가없는 분석 시스템이 중화 활동의 측정에 대한 더 유용하다는, TF - 1 세포를 사용하여 bioassay와 비슷한 방식으로 polyclonal GM - CSF autoantibody에 의해 저해 약을 - dependently되었습니다 TF - 1 세포 또는 인간의 골수 세포를 사용하여 bioassay 시스템보다 GM - CSF의 autoantibodies니다. 결론 : 우리는 GM - CSF autoantibody의 중화 능력을 quantifying 셀 - 무료 분석을 설립했습니다.

우리는 수용체에 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자의 바인딩 (GM - CSF)를 추정하기 위해 셀 무료 수용체 결합 분석을 설계했습니다. 그것은 우수한 재현성과 GM - CSF autoantibody에 의해 용해 GM - CSF 수용체 알파에 바인딩 GM - CSF biotinylated의 경쟁 억제를 평가하는 데 있습니다.

재조합 가용성식이 GM - CSF 수용체를 사용하여 GM - CSF 항체의 중화 능력을 예측 세포 분석 시스템 무료

배경: 이전에 본 연구진은 GM-CSF 자가항체의 농도가 아닌 중화 능력이 질환과 상관관계가 있음을 입증하였습니다...

본 실험의 전반적인 목표는 G-M-C-S-F 자가항체의 중화 능력을 정량화하는 무세포 분석법(cell-free assay)을 확립하는 것입니다. 먼저 형질전환 누에를 확보하는 것으로 시작합니다. 인간 SGMR alpha 유전자를 도입하여 재조합 SGMR alpha를 생산하고, bioTE를 통해 재조합 인간 G-M-C-S-F를 표지합니다.다음으로, GM-CSF 자가항체에 의한 SGMR alpha로의 GM-CSF 결합 억제 연구를 통해 무세포 시스템과 일반적인 생물학적 분석법(bioassay) 간의 상관관계를 평가합니다. 얻어진 결과는 혈청 IgG 분획 및 정제된 GM-CSF 자가항체에 의한 생물학적 분석법의 성장 억제와 무세포 시스템의 결합 억제 사이에 유의미한 상관관계가 있음을 보여줍니다. TF-one bioassay와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, GM-CSF 자가항체의 중화 능력을 측정함에 있어 재현성이 우수한 높은 분석 효율을 제공한다는 점입니다.GM-CSF 자가항체가 자가면역성 일차 전반적 예후를 유발하므로, 이 기술의 함의는 진단 분야까지 확장됩니다. 또한 BEGF 및 TNFA 수용체와 같은 재조합 사이토카인 수용체를 이용한 경쟁적 결합 분석법(competitive binding assays)에도 적용될 수 있습니다. 절차 시연은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 ano가 진행하겠습니다. 그는 이 pH-free 시스템을 처음으로 개발하였습니다.이 영상에서는 재조합 SGMR alpha 생산에 사용되는 누에를 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간 태반 cDNA 라이브러리로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 SGMR Alpha의 cDNA를 증폭하는 것이며, 이를 통해 PCR 증폭 산물을 얻습니다. 두 번째 PCR을 수행하여 5' 말단에 ULA 바이러스 polyhedron의 50 base 5' UTR 서열을 추가합니다.R RRGs의 3' 말단에 태그를 붙이기 위해, 증폭된 PCR R 생성물을 플라스미드 P MSG one one mg에 클로닝합니다. 구성물 PS GMR slash M1 one mg을 헬퍼 벡터 PHA three pig와 함께 누에 PNDW one 계통의 알에 공동 주입합니다. 부화한 G0 유충을 25 °C에서 나방이 될 때까지 사육합니다. 그 후, 형제간 교배 또는 PNDW one과의 교배를 통해 G1 배아를 스크리닝하며, 눈에서의 MG FP 발현은 해당 형질전환 누에의 보유를 나타냅니다.SGMR alpha 유전자를 사용하여 500 mM NaCl이 포함된 인산염 완충액으로 형질전환 누에 고치에서 재조합 SGMR alpha를 추출하고 4 °C에서 24시간 동안 교반합니다. 샘플을 20,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 침전물을 제거하기 위해 상층액을 니켈 친화성 컬럼에 적용합니다.10 millimolar에서 250 millimolar까지의 선형-구배 ole을 사용하여 컬럼을 세척하고 단백질을 용출합니다. 정제된 SGMR alpha가 포함된 분획들을 모으고 phosphate puffed saline으로 투석합니다. 먼저 샘플을 PBS로 투석합니다.G-M-C-S-F 제제에서 sorbitol을 제거하려면, 20 millimolar의 차가운 sodium meta date 용액 1 mL를 첨가하고 샘플을 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양합니다. 그다음 glycerol을 최종 농도가 15 millimolar가 되도록 첨가하고 100 millimolar sodium acetate 버퍼로 투석합니다. 이어서 biotin azide를 최종 농도가 5 millimolar가 되도록 용액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 혼합합니다.마지막으로, PBS를 이용한 투석을 통해 비반응성 물질을 제거하고, 마이크로타이터 플레이트에 50 µL의 단클론성 anti polyhis 항체를 코팅하여 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. PBST로 5회 세척합니다. 그 다음 100 µL의 블로킹 용액을 첨가하고 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.다시 PBST로 5회 세척합니다. PBST로 5회 세척한 후, 블로킹 용액에 SGMR alpha 50 µL를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. G-M-C-S-F 자가항체를 포함하는 샘플 25 µL를 첨가한 다음, 비오틴화된 G-M-C-S-F 25 µL를 첨가하여 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.SGMR alpha G-M-C-S-F 복합체를 형성하기 위해, PBST로 5회 세척을 계속한 다음, biotinylated G-M-C-S-F와 결합된 SGMR alpha를 검출하기 위해 4°C에서 1시간 동안 50 µL의 alkaline phosphatase streptavidin을 첨가합니다. PBST로 5회 세척한 후, 용액에 50 µL의 화학 발광 기질을 첨가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고 플레이트 리더를 사용하여 화학 발광 활성을 측정합니다. SDS-PAGE 분석 결과, 누에 유래 재조합 SDMR alpha는 비환원 조건에서는 단량체(monomeric)와 이량체(DME) 형태 모두로 존재하지만, 환원 조건에서는 단량체 형태로만 존재합니다.SGMR alpha의 단량체와 이황화 결합 이량체로 구성된 이 재조합 혼합물은 경쟁적 결합 분석에서 기능적입니다. 비오틴화된 G-M-C-S-F와 SGMR alpha의 복합체는 다양한 농도의 중화 항체를 첨가했을 때는 해리되지만 비중화 항체에서는 해리되지 않아 특이성을 나타냅니다. 또한, G-M-C-S-F 중화 항체의 농도가 증가함에 따라 결합 억제율이 농도 의존적으로 양의 상관관계를 보이며 증가합니다.예상대로, G-M-C-S-F 비중화 항체의 결합 억제는 용량 의존적이지 않았습니다. 이 무세포 시스템은 G-M-C-S-F 자가항체에 의한 SGMR alpha로의 G-M-C-S-F 결합 억제와 계산된 값 사이의 밀접한 상관관계를 보여주었으며, r 값은 0.988, P 값은 0.002였습니다. G-M-C-S-F 자가항체에 의한 결합 억제는 용량 의존적으로 증가했습니다.마찬가지로, 결합 억제는 유입의 성장 억제와 유의미한 상관관계를 보였습니다. 이 분석법은 퍼센트 결합 억제에 대한 IC 50와 혈청 IgG 분획에 의한 퍼센트 성장 억제 사이의 관계에서 입증된 바와 같이, 자가면역 PAP 환자의 혈청 IgG 분획 분석 및 활용에 유용합니다. 또한, 실험 간 변동 계수는 세포 없는 시스템이 성장 억제 생물 분석법보다 유리함을 나타냅니다.숙련되면, 이 무세포 GM GSF 수용체 리간드 결합 분석법은 38시간 이내에 성공적으로 완료할 수 있습니다. 반응 온도와 배양 시간을 유지하는 것이 중요합니다. 이 기술은 기존의 생물학적 분석법 대신 신규 항체 의약품의 생물학적 활성을 스크리닝하는 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.

a-cell-free-assay-system-estimating-neutralizing-capacity-gm-csf

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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