재조합 가용성식이 GM - CSF 수용체를 사용하여 GM - CSF 항체의 중화 능력을 예측 세포 분석 시스템 무료

본 실험의 전반적인 목표는 G-M-C-S-F 자가항체의 중화 능력을 정량화하는 무세포 분석법을 확립하는 것입니다. 먼저 형질전환 누에를 확보하는 것으로 시작합니다. 인간 SGMR alpha 유전자를 도입하여 재조합 SGMR alpha를 생성하고, bioTE를 통해 재조합 인간 G-M-C-S-F를 표지합니다.

다음으로, GM-CSF 자가항체에 의한 SGMR alpha로의 GM-CSF 결합 억제 연구를 통해 무세포 시스템과 일반적인 바이오어세이 간의 상관관계를 평가합니다. 얻어진 결과는 혈청 IgG 분획 및 정제된 GM-CSF 자가항체에 의한 바이오어세이의 성장 억제와 무세포 시스템의 결합 억제 사이에 유의미한 상관관계가 있음을 보여줍니다. TF-one 바이오어세이와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 본 시스템이 GM-CSF 자가항체의 중화 능력을 측정하는 데 있어 우수한 재현성과 높은 분석력을 가진다는 점입니다.

GM CSF 자가항체는 자가면역성 일차 전체 예후를 유발하므로, 본 기술의 영향은 진단 분야까지 확장됩니다. 또한 BEGF 및 TNFA 수용체와 같은 재조합 사이토카인 수용체를 이용한 경쟁적 결합 분석법(competitive binding assays)에도 적용될 수 있습니다. 본 실험 과정의 시연은 제 연구실의 박사 과정 학생인 ano가 진행할 예정입니다. 그는 이 pH-free 시스템을 처음으로 개발했습니다.

이 영상은 재조합 SGMR alpha 생산에 사용되는 누에를 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간 태반 cDNA 라이브러리로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 SGMR Alpha의 cDNA를 증폭하여 PCR 증폭 산물을 얻는 것입니다. 이어지는 두 번째 PCR을 통해 5' 말단에 ULA 바이러스 polyhedrin의 50 base 5' UTR 서열을 추가합니다.

R RRGs에 태그를 부착하기 위해, 증폭된 PCR R 산물의 3' 말단에 태그를 추가하여 플라스미드 P MSG one one mg에 클로닝합니다. 제작된 컨스트럭트 PS GMR slash M1 one mg를 헬퍼 벡터 PHA three pig와 함께 누에 PNDW one 계통의 난자에 공주입합니다. 부화한 G zero 유충을 25 °C에서 나방이 될 때까지 사육합니다. 이후 형제간 교배 또는 PNDW one과의 교배를 통해 G one 배아를 스크리닝하며, 눈에서 MG FP가 발현되면 해당 누에가 트랜스제닉 개체임을 나타냅니다.

SGMR alpha 유전자를 이용해 500 millimolar 염화나트륨이 포함된 인산염 완충액으로 형질전환 누에 고치에서 재조합 SGMR alpha를 추출하고 4 °C에서 24시간 동안 교반합니다. 샘플을 20,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 침전물을 제거하기 위해 상층액을 니켈 친화성 컬럼에 적용합니다.

10 millimolar에서 250 millimolar까지의 선형 구배를 사용하여 컬럼을 세척하고 단백질을 용리합니다. 정제된 SGMR alpha가 포함된 분획들을 모아 인산염 완충 식염수로 투석합니다. 먼저 샘플을 PBS로 투석하십시오.

G-M-C-S-F 준비물에서 sorbitol을 제거하려면, 20 millimolar의 차가운 sodium meta date 용액 1 mL를 첨가하고 샘플을 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양합니다. 이제 glycerol을 최종 농도가 15 millimolar가 되도록 첨가하고 100 millimolar sodium acetate 완충액으로 투석합니다. 이어서 biotin azide를 최종 농도가 5 millimolar가 되도록 용액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 혼합합니다.

마지막으로, PBS를 이용한 투석을 통해 비반응성 물질을 제거하고, 마이크로타이터 플레이트에 50 µL의 모노클로날 anti-polyhis 항체를 코팅하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBST로 5회 세척합니다. 그 다음, 블로킹 용액 100 µL를 첨가하고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

다시 PBST로 5회 세척합니다. PBST로 5회 세척한 후, 블로킹 용액에 SGMR alpha 50 microliters를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. G-M-C-S-F 자가항체가 포함된 시료 25 microliters를 첨가한 다음, biotinylated G-M-C-S-F 25 microliters를 첨가하고 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

SGMR alpha G-M-C-S-F 복합체를 형성하려면, PBST로 5회 세척을 계속한 다음, biotinylated G-M-C-S-F가 결합된 SGMR alpha를 검출하기 위해 alkaline phosphatase streptavidin 50 µL를 첨가하여 4 °C에서 1시간 동안 반응시킵니다. PBST로 5회 세척한 후, 용액에 chemiluminescence substrate 50 µL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양한 뒤 플레이트 리더를 사용하여 화학발광 활성을 측정합니다. SDS page 분석 결과, 누에 유래 recombinant SGMR alpha는 비환원 조건에서는 단량체(monomeric)와 이량체(DME) 형태 모두로 존재하지만, 환원 조건에서는 단량체 형태로만 존재합니다.

SGMR alpha의 단량체와 이황화 결합 이량체가 혼합된 이 재조합 혼합물은 경쟁적 결합 분석에서 기능적입니다. 비오틴화된 G-M-C-S-F와 SGMR alpha의 복합체는 다양한 농도의 중화 항체를 추가했을 때는 해리되지만 비중화 항체를 추가했을 때는 해리되지 않으므로 특이성을 나타냅니다. 또한, G-M-C-S-F 중화 항체의 농도가 증가함에 따라 결합 억제 백분율이 용량 의존적으로 증가하는 양의 상관관계를 보입니다.

예상한 대로, G-M-C-S-F 비중화 항체의 결합 억제는 용량 의존적이지 않았습니다. 이 무세포 시스템은 G-M-C-S-F 자가항체에 의한 SGMR alpha의 G-M-C-S-F 결합 억제와 계산된 값 사이에 r = 0.988, P value = 0.002로 밀접한 상관관계가 있음을 보여줍니다. G-M-C-S-F 자가항체에 의한 결합 억제는 용량 의존적인 방식으로 증가했습니다.

마찬가지로, 결합 억제는 import의 성장 억제와 유의미한 상관관계를 보였습니다. 이 분석법은 백분율 결합 억제에 대한 IC 50와 혈청 IgG 분획에 의한 백분율 성장 억제 사이의 관계를 통해 입증된 바와 같이, 자가면역 PAP 환자의 혈청 IgG 분획 분석 및 활용에 유용합니다. 또한, 실험 간 변동 계수는 세포 없는 시스템이 성장 억제 바이오어세이보다 유리함을 나타냅니다.

숙련되면, 이 무세포 GM GSF 수용체 리간드 결합 분석법은 38시간 이내에 성공적으로 완료할 수 있습니다. 반응 온도와 배양 시간을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 기술은 기존의 생물학적 분석법 대신 신규 항체 의약품의 생물학적 활성을 스크리닝하는 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.