질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

안녕하십니까, 저는 오하이오 주립대학교 약리학과 부교수 Frederick Dina입니다. 본 시연에서는 EPR 스핀 트래핑(Spin Trapping)을 이용하여 세포로부터 일산화질소와 슈퍼옥사이드를 검출하는 방법을 보여드리겠습니다.

활성 산소 및 질소 종은 다양한 질병의 발생과 연관되어 있으며, 따라서 생물학적 시스템 내에서 이들을 검출하는 것은 매우 중요합니다. 생물학적 시스템에서 활성 종을 검출하기 위해 사용되는 신뢰할 수 있는 방법은 소수에 불과하며, 이들은 특이성과 민감도 면에서 한계가 있습니다. 그러나 스핀 트래핑은 활성 산소 종(ROS)의 식별에 흔히 사용되며, 이는 라디칼이 니트로 스핀 트랩이나 금속 복합체와 첨가 반응을 일으켜 지속성 스핀 부가물을 형성하는 과정을 포함합니다. 이 부가물은 전자 상자성 공명 분광법(EPR)으로 검출할 수 있으며, 다양한 라디칼 부가물은 생성되는 라디칼을 식별할 수 있는 독특한 스펙트럼을 나타내어 라디칼 생성의 성질과 속도론에 관한 풍부한 정보를 제공할 수 있습니다.

산화질소 합성효소(Nitric oxide Syntase)는 N-A-D-P-H를 이용하여 L-arginine을 L citruline으로 전환하며 산화질소를 생성하는 촉매 작용을 합니다. 산적 스트레스 조건 하에서 eNOS는 '언커플링(uncoupling)'이라 불리는 과정을 통해 산화질소 대신 초과산화물을 생성하는 상태로 전환될 수 있으며, 이는 헴(heme)의 산화 또는 테트라하이드로비옵테린(tetrahydrobiopterin) 보조 인자의 결핍으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 생물학적 시스템에서 산화질소 조절은 혈관 확장과 같은 유익한 생리적 기능을 유도하는 세포 신호 전달에서 결정적인 역할을 하므로 매우 중요하지만, 과잉 생성될 경우 종종 염증성 상태와 연관됩니다. 따라서 생물학적 시스템 내의 산화질소 검출은 매우 중요합니다.

생물학적 시스템에서 또 다른 중요한 신호 전달 분자 군은 일산화질소와 같은 활성 산소종입니다. 낮은 농도의 활성 산소종은 세포 기능, 신호 전달 및 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하지만, 조절되지 않은 농도로 존재할 경우 세포 산화 손상을 일으켜 산화 스트레스로 이어질 수 있습니다. 초과산화물 라디칼 음이온은 가장 중요한 활성 산소종 중 하나이며, 초과산화물 아질산염 및 하이드록실 라디칼과 같이 생물학적 시스템에 존재하는 것으로 알려진 가장 강력한 산화종들의 주요 전구체입니다. 따라서 생물학적 시스템에서 초과산화물의 검출 및 격리는 중요한데, 이는 초과산화물의 생성이 산화적 폭발의 첫 번째 징후를 나타내기 때문입니다.

본 프로토콜에서는 서면 절차에 기술된 대로 배양된 소 대동맥 내피 세포를 트립신 처리합니다. 세포를 라벨이 부착된 6-웰 플레이트로 옮기고, 배양 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

인큐베이터에서 6-웰 플레이트를 꺼내고 첫 번째 웰의 배지를 흡입하여 제거합니다. 1 mL의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 두 번 세척합니다. 1 mL의 칼슘 및 마그네슘 함유 DPBS에 0.8 mg의 황산철을 첨가하여 1.9 mM 황산철 7수화물 용액을 준비합니다.

염화 칼슘과 염화 마그네슘이 포함된 500 µL의 DPBS에 2.7 mg의 암모늄 MGD를 넣어 MGD 용액을 준비합니다. 갓 제조한 1.9 mM 황산 철 헵타하이드레이트 210 µL와 1:7의 몰비를 사용하여 갓 제조한 MGD 210 µL를 첨가하고 결과 현탁액을 혼합합니다. 4.6 µL의 칼슘 이온 포(calcium ion four)를 첨가하고 피펫팅하여 용액을 다시 혼합합니다.

그 후 샘플을 37 °C에서 36분 동안 배양합니다. EP tube에 가라앉은 상층액을 수집합니다. EPR 획득 파라미터로 중심 자기장 3427 gauss, 변조 진폭 6 gauss 및 주파수 9.8 GHz를 입력합니다.

기기 및 실험 조건에 따라 파라미터가 달라질 수 있으므로, 해당 장비에 사용된 다른 파라미터는 본문을 참조하십시오. 상층액을 파라핀으로 밀봉된 EPR 플랫 셀에 옮겨 EPR 캐비티에 넣습니다. 실험이 시작된 후, 121회 스캔, 스캔당 10.4초 설정으로 약 21분 동안 스펙트럼을 기록합니다.

Brucker WIN EPR 프로세싱을 사용하여 베이스라인을 보정하고 2D 스펙트럼을 적분함으로써 배경 노이즈를 줄입니다. 스캔 시간과 스캔 횟수는 실험마다 다를 수 있음에 유의하십시오. 또한, 베이스라인 보정 방법 역시 소프트웨어마다 다를 수 있습니다.

Enos 언커플링을 시작하려면, 6-웰 플레이트의 두 번째 웰에서 배지를 제거하고 1 mL의 DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그다음 준비된 0.5 mM Syn one 용액 100 µL를 첨가하고, 10% FBS가 포함된 DPBS로 전체 부피를 2 mL로 맞춥니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후,

세포를 DPBS로 두 번 세척합니다. 그다음, 갓 조제한 2.8 millimolar 황산철 7수화물 210 microliters와 이전 절차에 따라 갓 조제한 19.6 millimolar MGD 210 microliters를 첨가합니다. 이어서, 1.9 millimolar 칼슘 이온 4 4.6 microliters를 첨가하고 용액을 다시 혼합합니다.

이전과 마찬가지로, 세포를 37 °C에서 36분 동안 배양합니다. 36분 후, 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 가라앉은 상층액을 수집하여 EPR 평면 셀(flat cell)로 옮깁니다. 획득 후, 이전과 동일한 획득 파라미터를 사용하여 EPR 스펙트럼을 기록합니다.

본 프로토콜을 시작하기 전에 동일한 방식으로 데이터를 처리하십시오. 1 M DMPO의 스톡 용액과 0.1 mM DTPA를 포함하는 PBS를 준비합니다. 그다음 4 by 12의 1 mg/mL 용액을 만듭니다.

DMSO에 용해된 Myra State 13 acetate 또는 PMA를 사용하여, 1 mg/mL D-glucose와 1 mg/mL Albumin이 포함된 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내의 PBS로 PMA 스톡 용액을 10 µg/mL로 희석하여 1 mL씩 분주합니다. 1.5 mL 에펜도르프 튜브에서 피펫팅을 통해 PMN 세포를 5~6 x 10⁶ cells/mL로 조절합니다. 약 1.6 x 10⁶개의 PMN 세포, 10 mM DMPO 및 0.2 µg/mL PMA를 포함하여 최종 부피가 60 µL가 되도록 혼합물을 준비합니다.

본 실험에서는 Bruker ESP 300 X 밴드 분광계를 사용합니다. 용액을 EPR 평면 셀로 옮긴 다음, 평면 셀을 EPR 캐비티에 넣습니다. EPR 수집 파라미터로 중심 자기장 3, 486 goss, 변조 진폭 0.5 goss, 주파수 9.8 gigahertz를 입력하십시오.

기기 및 실험 조건마다 파라미터가 다를 수 있으므로, 스펙트럼 획득에 이 실험에서 사용된 다른 파라미터들은 본문을 참조하시기 바랍니다. 본 시연에서는 두 가지 서로 다른 스핀 트랩인 iron MGD와 DNPO를 사용하여 일산화질소 및 SU 과산화물 라디칼의 검출 방법을 보여줍니다.

우리는 칼슘 이온 포레(calcium ion four)로 혈관 내피 세포를 자극하면 일산화질소가 생성되며, 신원 1(seen one) 처리 시 일산화질소 생성량이 감소함을 보여줍니다. 그러나 니트로 스핀 트랩(nitro spin trap)이 존재하는 상태에서 PMA로 호중구를 자극하면, 초기에 형성된 슈퍼옥사이드 adda의 불안정성으로 인해 S 산화물 대신 하이드록실 라디칼 ADDA가 생성됩니다. 철 MGD 니트로스(iron mg d nitros)에 의한 스핀 트래핑 메커니즘은 기본적으로 동일하지만, 철 MGD에 일산화질소가 첨가되는 반응은 반응 속도가 매우 빠르며 형성된 철 MGD 일산화질소 add 형태는 매우 안정적입니다.

실제로 용액을 -80 °C에서 냉동 보관했다가 나중에 EPR 스펙트럼을 측정하더라도 EPR 신호 강도가 크게 감소하지 않습니다. 반면, 니트로 스핀 트랩을 이용한 산화물 검출은 속도가 느립니다. 따라서 철 MGD 4를 이용한 일산화질소 검출 방식과 비교했을 때 더 높은 농도의 스핀 트랩이 필요합니다.

초과산화물 부가물을 성공적으로 검출하기 위해 여러 가지 접근 방식이 사용되어 왔으나, 본 영상에서는 더 이상 시연하지 않았습니다. 예를 들어, 플랫 셀(flat cell)을 사용하면 세포 밀도가 더 높아져 초과산화물 부가물 신호 강도를 더 높일 수 있습니다. 이 문제와 관련해서는 텍스트 내용을 참고하시기 바랍니다.

또한, DMPO 대신 BMPO 및 VMP와 같은 인증된 스핀 트랩이나, 더 지속적인 SU 과산화물 부가물을 생성할 수 있는 인산화된 Nitro DAP MPO를 사용할 수 있습니다. SU 검출을 위해 스핀 트랩핑을 적용할 때 SU 과산화물 부가물을 안정화하기 위해 사이클로덱스트린을 사용하기도 했습니다. SU 슈퍼옥사이드 생성 직후에 EP 스펙트럼을 즉시 획득하는 것이 매우 권장됩니다.

따라서 철 MGD를 이용한 일산화질소 검출은 훨씬 더 효율적이며, 초과산화물-전전환(PR) 스핀 트래핑이 직면한 주요 과제는 철 MGD 일산화질소 부가물 형성에서 관찰된 특성들을 확보하는 것입니다. 즉, 빠른 초과산화물 반응성과 안정적인 부가물 형성입니다. 현재 본 연구실과 다른 연구 그룹들에서 초과산화물에 대해 빠른 반응성을 보이고 안정적인 스핀 부가물을 형성하는 스핀 트랩 개발 노력이 진행되고 있습니다.