Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO 적혈구 조혈

본 실험 절차의 전반적인 목표는 인간 조혈모세포 및 전구세포를 적혈구 계통으로 분화시키고, 체외 적혈구 생성 과정 중에 특정 전사 인자를 넉다운(knock down)하는 것입니다. 이를 위해 먼저 제대혈, 골수 또는 GCSF로 동원된 말초혈액에서 CD34 양성 인간 줄기세포 및 전구세포를 분리합니다. 절차의 두 번째 단계에서는 특정 사이토카인을 조합하고 기질 세포층에서 공배양하여 골수 미세환경을 모방하는 4단계 세포 배양 절차를 통해, 이러한 조혈모세포를 적혈구 계통으로 분화시킵니다.

다음으로, 관심 전사 인자에 대항하는 HRNA 분자, 음성 대조군으로서의 scrambled HRA 분자 및 바이러스 감염 효율을 확인하기 위한 GFP 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자를 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 분화의 특정 단계에 있는 인간 일차 적혈구 세포에 렌티바이러스 입자를 감염시키는 것입니다. 최종적으로 세포 형태 분석, 전구 세포의 콜로니 형성 능력, 헤모글로빈 생성 및 FACS를 통한 적혈구 특이적 마커의 발현 분석을 통해 세포 증식과 적혈구 분화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

바이러스 감염 효율은 FACS를 통한 GFP 발현 측정을 통해 분석하며, 표적 전사 인자의 넉다운(knockdown) 정도는 RT-qPCR로 분석합니다. 이 방법은 일차 인간 세포가 제공하는 비변형 환경에서 각 전사 인자에 의한 분자 기전 및 유전자 발현 조절과 같은 조혈 작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 운명 결정, 자기 재생 증식 또는 세포 사멸과 같은 조혈 작용의 근본적인 과정을 이해하는 데 중요합니다.

이 방법은 정상적인 적혈구 생성 영역(ROI)과 분자 수준에서의 조절 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 진성적혈구증가증 및 적백혈병과 같은 골수증식성 질환을 포함하여 불균형, 내성장 및 분화로 인해 발생하는 질병의 표적 치료제를 연구하기 위한 모델 시스템으로도 활용될 수 있습니다. 인간 조혈모세포 및 전구세포로부터 헤모글로빈을 함유한 성숙한 적혈구까지의 ex vivo 적혈구 생성 프로토콜은 CD34 양성 인간 조혈모세포 및 전구세포의 분리와 세포 배양을 통한 무혈청 적혈구 분화의 두 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서는 양성 면역 선택법을 사용하여 탯줄 혈액, 골수 또는 GCSF로 동원된 인간 말초 혈액으로부터 CD34 양성 세포를 분리합니다.

무혈청 적혈구 분화의 두 번째 단계는 CD 34 양성 세포를 액체 배양에서 성장시키는 것을 포함합니다. DU 실험실에서 처음 개발한 방법을 응용한 4단계 프로토콜에 따라, 0일부터 11일까지 조혈 세포를 하이드로코르티손, 줄기세포 인자, 인터루킨 3 및 에리트로포이에틴이 함유된 보충된 ice cuffs, modified ECCOs 배지에서 성장시킵니다. 그 후 3단계인 11일부터 15일까지, 적혈구 세포를 EPO가 함유된 보충된 IMDM 배지 내의 MS five 중간엽 세포와 공동 배양합니다.

추후 사용을 위해 여름 적혈구 세포를 수확한 후, 남은 세포들은 사이토카인이 포함되지 않은 보충 IMDM 배지 내의 MS five 세포와 공동 배양합니다. 마지막으로, 18일째부터 26일째까지 적혈구 세포를 3~4배 농축하여 MS five 층 위에서 유지함으로써 성숙을 유도하며, 배양된 적혈구의 보존력을 높이기 위해 보충 IMDM 배지에 10% FBS를 첨가합니다. 본 비디오 논문에서는 적혈구 분화의 두 번째 단계인 에리스로포이에틴을 이용한 중간엽 세포와 적혈구 세포의 공동 배양 과정만을 시연하겠습니다.

이 절차에서 가장 어려운 부분은 공배양을 위해 AUS five 세포가 들어 있는 플라스크의 배지를 대규모로 세척 및 교체하고, 이어서 art trade 세포를 해당 플라스크로 옮기는 단계를 수행하는 것입니다. 따라서 한 번에 4개의 플라스크를 처리하며 2%organ을 동시에 진행합니다. 중간엽 세포 위에서 EPO를 이용한 적혈구 세포의 공배양을 시작하려면, 트립판 블루를 사용하여 사멸 세포를 제외한 적혈구 세포의 수를 측정하십시오.

11일째에 세포 밀도는 mL당 약 1.5 × 10⁶ cells가 되어야 하며, MS5 중간엽 세포와의 공배양을 위해 적혈구 세포 배양액 약 80 mL를 따로 보관합니다. PBS가 첨가된 IMDM 배지와 EPO가 포함된 IMDM 배지를 37 °C에서 예열합니다. 그다음, MS5 세포가 confluence 상태로 도달하도록 미리 준비해 둔 플라스크 4개를 인큐베이터에서 꺼냅니다.

각 플라스크를 20 milliliters의 1X PBS로 세척하고, 즉시 EPO가 포함된 신선한 보충 IM DM 배지 80 milliliters를 각 플라스크에 첨가하십시오. 적혈구 세포가 준비되는 동안 세포를 인큐베이터에 보관하십시오. 이제 보관해 두었던 적혈구 세포를 두 개의 50 milliliter 원추형 튜브로 옮기고 1500 RPM에서 10분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거한 후, 두 개의 세포 펠릿 각각을 20 milliliters의 보충된 IMDM 배지로 세척하고, EP가 포함된 40 milliliters의 보충된 IMDM 배지에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그다음, MS five 세포와 80 milliliters의 배지가 들어 있는 4개의 플라스크에 이 세포 현탁액을 각각 20 milliliters씩 분배합니다. 이 단계에서, 0.3 times 10 to the six cells per milliliter 농도의 적혈구 세포 100 milliliters가 포함된, MS five 세포가 confluence 상태인 플라스크 4개가 준비되어야 합니다. 다음 날, trypan blue를 사용하여 죽은 세포를 제외한 적혈구 세포를 계수합니다. 세포 밀도는 약 0.6 times 10 to the six cells per milliliter여야 합니다.

적절한 세포 증식 및 적혈구 분화를 확인하기 위한 테스트에 필요한 수의 세포를 수확합니다. 전사 수준에서 적혈구 생성(erythropoiesis)을 연구하려면 일차 적혈구 세포에서 특정 인자를 과발현시키거나 넉다운(knock down)하는 능력이 필요합니다. 본 예시에서는 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 일차 인간 적혈구 세포의 전사 인자를 넉다운합니다.

렌티바이러스 벡터 입자 제조 프로토콜은 원고에서 확인할 수 있습니다. 본 영상에서는 유전자 전달을 위한 일차 적혈구 세포의 렌티바이러스 감염 절차를 시연합니다. 핵이 있는 적혈구 세포는 50에서 100의 감염 다중도(multiplicity of infection)를 사용하여 분화의 어느 단계에서든 효율적으로 감염시킬 수 있습니다.

여기서는 분화 8일 및 9일 차의 적혈구 세포를 감염시키기 위해 TAL1 또는 scramble shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 세포당 52 MOI로 사용합니다. 이 절차를 시작하려면, 각각 TAL1 knockdown, scrambled 음성 대조군, GFP 발현용으로 사용될 1×10⁶개의 적혈구 세포가 담긴 15mL 원추형 튜브 3개를 준비합니다. EPO가 포함된 보충 IMDM 배지 5mL로 세포를 세척한 후, 1000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 가능한 한 많이 제거합니다.

렌티바이러스가 세포에 최대한 흡수될 수 있도록 최소량의 배지에서 감염을 진행해야 합니다. 농축된 렌티바이러스가 담긴 각 튜브에 최종 농도가 40 micrograms per milliliter가 되도록 poly brain을 첨가합니다. poly brain이 포함된 준비된 농축 바이러스 100 microliters를 각 세포 튜브에 첨가합니다.

37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하며, 10분마다 손가락으로 톡톡 쳐서 혼합합니다. 이렇게 하면 1시간의 배양이 끝날 때 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지 1.9 mL를 각 튜브에 넣어 세포 전체에 바이러스가 균일하게 분포되도록 할 수 있습니다. 각 샘플을 6-웰 플레이트로 옮기고 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후에, 세포를 각각의 15 milliliter 튜브에 수확합니다. 1000 RRP M에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 감염 과정을 반복하여, 바이러스와 poly brain을 첨가하고 핑거 태핑(finger tapping)을 하며 37 degrees Celsius에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 EPO가 첨가된 보충 IMDM 배지를 세포에 추가합니다. 각 샘플을 6-웰 플레이트로 옮기고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 15 mL 원추형 튜브 3개로 옮기고 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 신선한 배지로 세포를 재부유시키는 세척 과정을 수행합니다.

다시 상층액을 흡입하여 제거하고, EPO가 포함된 보충 IMDM에 세포를 0.2 × 10⁶ cells/mL 농도로 재부유합니다. 그 후, ex vivo 적혈구 분화 절차를 진행하며, ex vivo 적혈구 분화 프로토콜 동안 2일마다 세포 수를 측정합니다. 로그 스케일로 나타낸 대표 결과는 10,000배의 증폭으로 알 수 있듯이 세포의 증식 능력이 매우 높음을 보여줍니다.

또한, Grunwald-Giemsa 염색을 통해 0일부터 8일까지는 0.05 × 10⁶ cells를, 그 외의 날짜에는 0.2 × 10⁶ cells를 사용하여 이틀마다 형태학적 염색을 수행합니다. 이 그림에서 보는 바와 같이, 분화의 특정 단계에 있는 세포들은 식별 가능한 크기와 형태를 나타냅니다. 20일부터 시작되어 분화 끝 단계에서 일어나는 핵 제거(enucleation) 과정을 확인하십시오.

26일째에 모든 세포의 핵이 소실되었습니다. 분화 초기 며칠 동안의 초기 및 후기 조혈 전구세포를 검출하기 위해 콜로니 형성 분석법이 사용되었으며, 0일째의 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 적혈구 전구세포 외에도 초기 CD 34 양성 세포 내에는 과립구 및 대식세포 전구세포가 상당 부분 포함되어 있습니다.

분화가 진행됨에 따라 일부 GM이 상당히 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 6일째에는 적혈구 전구세포인 BAUE와 CAUE로 완전히 대체됩니다. 또한, 4일째부터 6일째까지 초기 적혈구 전구세포인 BAUE가 더 분화된 형태인 CAUE로 점차 대체된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 10일째가 되면 적혈구 세포들은 기본적으로 콜로니 형성 능력을 상실하게 됩니다.

여기에 BFUE와 CFUE의 전형적인 사진이 제시되어 있습니다. 적갈색은 BFUE와 CFUE의 헤모글로빈으로 인한 것입니다. ex vivo 분화 과정 중 적혈구 생성은 지정된 시점에서 세포를 수집하고, FACS 또는 현미경 분석을 통해 세포 표면 마커의 발현을 분석하여 모니터링합니다.

여기서 막대는 양성 세포의 백분율을 나타냅니다. 주요 관찰 결과로는 조혈 줄기 및 전구세포 마커인 CD 34의 점진적인 소실, 전구세포 마커인 CD 36의 점진적인 획득 및 소실, 적혈구계 전구세포 및 망상적혈구 마커인 CD 71의 점진적인 획득 및 소실, 그리고 적혈구계 전구세포 및 적혈구 마커인 GPA의 증가가 포함됩니다. 적혈구 분화의 다른 마커로는 benadine 염색으로 측정한 8일 차부터의 헤모글로빈 합성과 20일 차부터 시작되는 세포 핵 탈락이 있습니다.

DNA 염색 시약 LDS의 소실로 측정한 결과, 전사 인자 T one의 녹다운에 따른 인간 일차 전적혈구(pro erythroblasts) 내 렌티바이러스 매개 유전자 전달 결과가 나타나 있습니다. 이는 렌티바이러스로 전달된 anti T one shRNA 또는 스크램블 대조군 shRNA에 의해 매개되었습니다. RT-qPCR을 통한 T one mRNA 전사체 수준의 역학 측정 및 18S rRNA 대비 T one 전사체의 발현량 분석 결과, 일차 적혈구 세포에서 T one 전사체의 75%가 성공적으로 녹다운되었음을 확인하였습니다.

9일 차부터 12일 차까지의 T one 전사체 수준의 증가와 스크램블 대조군은 적혈구 분화 과정에서 이 전사 인자의 중요성을 강조합니다. 마지막으로, 별도의 실험에서 적혈구 세포에 GFP 단백질을 발현하는 렌티바이러스를 감염시켰습니다. 이 그림은 감염 3일 후, 현미경 하의 형광 관찰과 FACS 측정을 통해 대부분의 적혈구 세포가 GFP를 발현하고 있음을 보여줍니다.

이는 일차 적혈구 세포의 감염 효율이 개발 후 거의 100%에 달함을 나타냅니다. 이 기술은 조혈 작용 분야의 연구자들이 인간 적혈구 생성의 전사 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 배양액에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 적혈구로 분화시키는 방법과 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 통해 이러한 분화 과정의 어느 단계에서든 효율적인 유전자 녹아웃을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.