Name: Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO 적혈구 조혈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 배우세요 인간 조혈 줄기 세포를 적혈구로 분화시키고 렌티바이러스를 이용해 TAL1 전사인자를 녹다운하는 ex vivo 방법을. 이 기술은 조혈 과정의 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 혈액 샘플을 (오타와 병원 연구 윤리위원회에 따라 얻은 제공을위한 전 생체내 erythroid 차별, D. 앨런과 H. 앳킨스 (오흐르지, 캐나다)에 대한 조언 L. 도이와 MC Giarratana을 (Université 파리 VI, 프랑스) 감사 # 2007804 - 01H), D. Trono (이콜 Polytechnique Fédérale 호텔 드 로잔) 비판적 원고를 읽기위한 lentiviral 벡터와 FJ 딜워쓰을 (오흐르지, 캐나다) 제공. 이 프로젝트는 MBCGP에 CIHR 부여 (걸레 - 82813)에 의해 재정 지원되었다 온타리오 연구 기금 전산 Regulomics 교육 박사 과정 이수 해안받는 사람입니다. MB의 유전자 발현의 규정에 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법 번호는 성공의 변수 정도로 문화에 erythroid 세포를 차별화하기 위해 이전에 사용되었습니다. 예를 들어, MS - 5 공동 문화없이는 어떤 프로토콜 erythroid 세포의 확장을 허용했지만 12-17 완전히 성숙 enucleated 적혈구를 생산 효율이되지 않습니다. 다른 방법은 효율적인 핵의 제거를 허용하는 동안, 그것은 확산 18,19의 비용입니다. 우리가 처음 도이 실험실 6 발전, 여기서 사용한 방법은, (게놈과 proteomics 연구에 필요한) erythroid 차별의 초기 단계 동안 세포 증폭을 연장하기 때문에 초기 progenitors 다수의 우리에게 제공하는 최초의 액체 문화 단계를 결합 하고, 헤모글로빈 합성을 극대화하고 적혈구의 완전한 핵의 제거를 얻는 것이 중요합니다 MS - 5 mesenchymal 세포에 공동 문화의 두 번째 단계. 우리의 방법의 두 가지 제한이 지금까지 완전히 단백질 수준과이 프로토콜을 수행 2) 높은 가격에서 매...

lentiviral - 중재 최저 동안 예 vivo</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

적혈구 조혈은 세포 분화 연구를 일반적으로 사용되는 모델 시스템입니다. 적혈구 조혈 동안, pluripotent 성인 인간의 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 oligopotent progenitors, 헌신 엽 성의 전구 물질과 성숙 적혈구 1로 구분. concomitantly 다른 세포 유형 2와 관련된 유전자를 억압하는 동안이 과정은 구체적인 전사 요소 혈통 특정 유전자를 활성화 의하여 유전자 발현의 수준에서 큰 부분을 규제합니다. 적혈구 조혈을 조절 전사 요인에 연구는 종종 분화 3-5의 주어진 단계에, 어느 정도, erythroid 세포를 나타내는 인간과 murine 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나 변형 세포 라인은 부분적으로만 erythroid 세포를 모방 수 있으며 가장 중요한 그들은 하나가 comprehensibly 최종 erythroid 운명을 향해 여러 단계를 통해 세포의 진행으로 발생하는 역동적인 변화를 연구하는 것을 허용하지 않습니다. 따라서, 현재의 과제는 게놈과 proteomics 실험을 수행하기 위해 충분 수량 분화의 여러 단계에서 기본 HSCs과 erythroid 세포의 비교적 동질적인 인구를 얻을 수있는 프로토콜의 개발 남아 있습니다. 여기 우리는 코드 혈액, 골수, 또는 G - CSF (leukapheresis)을 동원 성인 말초 혈액 중의 고립되었습니다 인간의 조혈 줄기 / 전구 세포에서 erythroid 분화를 유도하기 위해 전직 생체내 세포 문화 프로토콜을 설명합니다. 처음 도이 실험실 6 개발한이 시스템은 문화, 골수 microenvironment을 모방하기 위해 mesenchymal 세포에 크린 시토킨 및 공동 문화를 사용합니다. 이 전 생체내 차별 프로토콜을 사용하여, 우리는 erythroid progenitors의, 독점적 erythroid의 혈통과 enucleated 적혈구의 무대에 완전한 성숙을 향해 분화의 유도의 강력한 증폭을 관찰합니다. 따라서,이 시스템은 erythroid의 혈통을 따라 조혈 줄기 세포의 진전으로 transcriptional 규제의 분자 메커니즘을 연구하는 기회를 제공합니다. transcriptional 수준에서 적혈구 조혈을 공부하면 기본 erythroid 세포의 이상 - 명시적 또는 최저의 특정 요소 수있는 능력이 필요합니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 분리와 비 분리 전지 7 모두의 효율적인 감염을 허용 lentivirus - 중재 유전자 전달 시스템을 사용합니다. 여기서 우리는 효율적으로 기본 인간 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1을 최저 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 또한, GFP의 표현이 90 % 가까이 lentiviral 감염의 효율성을 보여줍니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 규제 전사 요소의 네트워크 제어하는​​ 적혈구 조혈의 특성화를위한 매우 유용한 기능을 제공합니다.

<em&gt; 예 생체내</em&gt; 프로토콜 설명 조혈 줄기 / progenitors에서 성숙한 인간의 적혈구를 생성합니다. 또한 우리는 최저 기본 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1를 효율적 lentiviral 배달 방법을 설명합니다. lentivirus 매개 유전자 전달의 효율성은 GFP 표현 바이러스를 사용하여 증명합니다.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

적혈구 생성은 세포 분화를 연구하기 위해 흔히 사용되는 모델 시스템입니다. 적혈구 생성 과정 동안, 다능성 성인 인간 조혈모세포는 ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 인간 조혈모세포 및 전구세포를 적혈구 계통으로 분화시키고, 체외 적혈구 생성 과정 중에 특정 전사 인자를 넉다운(knock down)하는 것입니다. 이를 위해 먼저 제대혈, 골수 또는 GCSF로 동원된 말초혈액에서 CD34 양성 인간 줄기세포 및 전구세포를 분리합니다. 절차의 두 번째 단계에서는 특정 사이토카인을 조합하고 기질 세포층에서 공배양하여 골수 미세환경을 모방하는 4단계 세포 배양 절차를 통해, 이러한 조혈모세포를 적혈구 계통으로 분화시킵니다.다음으로, 관심 전사 인자에 대항하는 HRNA 분자, 음성 대조군으로서의 scrambled HRA 분자 및 바이러스 감염 효율을 확인하기 위한 GFP 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자를 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 분화의 특정 단계에 있는 인간 일차 적혈구 세포에 렌티바이러스 입자를 감염시키는 것입니다. 최종적으로 세포 형태 분석, 전구 세포의 콜로니 형성 능력, 헤모글로빈 생성 및 FACS를 통한 적혈구 특이적 마커의 발현 분석을 통해 세포 증식과 적혈구 분화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.바이러스 감염 효율은 FACS를 통한 GFP 발현 측정을 통해 분석하며, 표적 전사 인자의 넉다운(knockdown) 정도는 RT-qPCR로 분석합니다. 이 방법은 일차 인간 세포가 제공하는 비변형 환경에서 각 전사 인자에 의한 분자 기전 및 유전자 발현 조절과 같은 조혈 작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 운명 결정, 자기 재생 증식 또는 세포 사멸과 같은 조혈 작용의 근본적인 과정을 이해하는 데 중요합니다.이 방법은 정상적인 적혈구 생성 영역(ROI)과 분자 수준에서의 조절 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 진성적혈구증가증 및 적백혈병과 같은 골수증식성 질환을 포함하여 불균형, 내성장 및 분화로 인해 발생하는 질병의 표적 치료제를 연구하기 위한 모델 시스템으로도 활용될 수 있습니다. 인간 조혈모세포 및 전구세포로부터 헤모글로빈을 함유한 성숙한 적혈구까지의 ex vivo 적혈구 생성 프로토콜은 CD34 양성 인간 조혈모세포 및 전구세포의 분리와 세포 배양을 통한 무혈청 적혈구 분화의 두 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서는 양성 면역 선택법을 사용하여 탯줄 혈액, 골수 또는 GCSF로 동원된 인간 말초 혈액으로부터 CD34 양성 세포를 분리합니다.무혈청 적혈구 분화의 두 번째

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이 동영상에서는 shRNA 렌티바이러스 벡터의 transduction을 수행하여 immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs)에서 안정적인 knockdown cell line을 얻는 방법을 보여줍니다.

짧은 헤어핀 RNA 매개 유전자 knockdown in iHSPCs In vitro: 특정 유전자 발현의 Knockdown을 위해 iHSPC에 렌티바이러스 기반 shRNA 발현 시스템 전달

우리는 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계를 해부 체외 마우스 태아 간 erythroblast 문화 시스템을 제시한다. 이 시스템은 서로 다른 개발 단계에서 특정 유전자의 기능 분석을 용이하게한다.

마우스 태아 간 문화 시스템은 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계에서 대상 유전자의 기능을 해부하기

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

적혈구 모델링은 이 과정에서 행위자의 생물학적 중요성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 새로운 치료 접근법을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 여기에서는 CD34+ 조혈모세포와 전구세포를 체외에서 효율적으로 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

배우세요 인간 조혈 줄기 세포를 적혈구로 분화시키고 렌티바이러스를 이용해 TAL1 전사인자를 녹다운하는 ex vivo 방법을. 이 기술은 조혈 과정의 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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