Name: Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 JHMV 감염 마우스 척수에 신경 줄기 세포 이식 방법을 통해 재수초화 및 임상 개선을 촉진하는 기술을. 이 프로토콜은 다발성 경화증 같은 탈수초화 질환의 세포 치료 연구에 활용됩니다.

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1. 준비 <ol><li> Xylazine - 케타민을 솔루션 (케타민을는 규제 약품입니다. 상세한 기록 보관 및 솔루션은 안전 고정 위치에 보관해야합니다) 준비합니다. </li><li> 장비를 청소하고 소독. </li><li> 무균 에이전트 닦는 후 멸균 종이 수건으로 닦음과 덮개에 의해 수술 영역을 준비하고 micromanipulator를 설정합니다. </li></ol> 2. 이식 세포의 준비 <ol><li> 전용 250,000 세포가 마우스를 따라 이식 있지만 세포, 100,000 전지 / 전자 리터의 농도 resuspended 및되어야 세포의 과잉은 주사기 로딩 목적 (세포를 받고 마우스 적어도 초당 300,000 세포를 준비하는)가 필요합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 병에 HBSS에 3 번 이식하는 세포를 씻으십시오. 마지막 스핀 전에 세포를 계산합니다. </li><li> 후 아래 마지막 스핀, 가만히 따르다 HBSS와 펠렛에 도달에서 방울을 방지하기 위해 위치를 아래로 뒤집어에 병을 두십시오. </li><li> UV - 조사, 멸균 Kimwipe와 건조 내부 벽. 펠렛 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 천천히 수직 튜브를 개최하고 매우 정교한 HBSS의 절반 마지막 원하는 볼륨에있는 세포를 resuspend. </li><li> 피펫 팁에 정지의 대부분을 pipetting 후 전체 정지가 피펫 팁의 때까지 pipetter에 다이얼을 조정하여 전체 볼륨을 측정합니다. 이것은 원하는 농도에 필요한 얼마나 더 많은 HBSS를 알려 줄 것입니다. </li><li> HBSS를 추가하여 원하는 금액으로 볼륨을 가져와. </li><li> 얼음에 다시 넣습니다. 그들은 더 이상의 2 시간을위한 얼음해야하는 경우 세포의 생존을 확인합니다. </li></ol> 3. 수술과 이식을위한 생쥐의 준비 <ol><li> 마취제 (100mg/kg)과 ~ 100 μl 회에 걸쳐 xylazine (10mg/kg) 또는 이에 상응하는 마취의 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취. 외과 초등학교에서 suturing하는 전체 절차는 30-40분 소요됩니다. </li><li> (옵션 : 식별을 위해 각 마우스의 꼬리에 번호, 색깔 테이프를 적용) </li><li> 목 허리에서 마우스 등의 영역을 면도하고, 전기 면도기와 정중선에서 양국 2cm 연장. 머리는 (그것이 지역에 여러 번 이동해야 할 수 있습니다) 가능한 한 가까운 절단해야합니다. </li><li> 나머지 머리를 제거하려면, 거즈로 제모 크림 (나이르)의 얇은 레이어를 적용하는 것은 작은 주걱을 밀고. </li><li> 1~2분 후 비눗물로 가볍게 침수 거즈로 끝났다 나이르 닦으십시오. 준비 영역은 이후 수술 도중 상처로 얻을 수 머리카락의 몸에는 빠진 부분없이 깨끗한 맨 피부해야합니다. 요오드 용액으로 준비 영역을 소독. </li></ol> 4. Laminectomy <ol><li> 자주 절차 전반에 걸쳐 장갑을 변경 및 / 또는 소독. 머리가 (당신이 바로 잡 경우) 왼쪽을 가리키는와 마우스 등의 측면을 놓습니다. 불임을 보장만을 면도 지역 노출되는 위해 동물을 드레이프. laminecomy 사이트 T12에 대한 흉부 척추 T8에서 스팬 이상의 수직 절개 (~ 1.3cm)를 확인합니다. </li><li> 왼쪽에서 개최된 graefe의 집게로 단단히 T9 (그림 1A)에서 척추를 보호하고 척추 만곡을 과장하기 위해 마우스를 올려. </li><li> T10와 T11의 경계인 두 가시 라고나할까요 사이의 공간을 점수 메스를 사용합니다. 더 신중하게 (C를 그림 1B 참조) 뼈가 노출 떨어진 근육 레이어를 scrapping하여 접합을 폭로. </li><li> 멀리 라미나에서 작은 자르는으로 작은 꽃자루 주위 명확 근육을 심화하기 위해 가위를 사용합니다. 이것은 척추 사이의 작은 공간을 열 것입니다. 천천히 그리고 정교한이 간격으로 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 작은 꽃자루를 싹둑. 가위의 곡률은 항상 멀리 코드에서 옆으로 위치에 있는지 확인하십시오. 반대편에 반복합니다. (그림 1D, E 참조) </li><li> 코드를 노출하는 얇은 판을 들어 신중히를 싹둑. 뒤에 어떤 무료 또는 톱니 뼈 조각을 떠날하지 않도록주의하십시오. (그림 1 층 참조) </li><li> 이전 분사로 살균 목화 면봉을 제거하는 혈액을 청소하십시오. </li></ol> 5. 세포의 분사 <ol><li> 해밀턴 주사기에 바늘 너트와 바늘을 첨부와 물, 다음 70 % 에탄올로 여러 번 플러싱하여 청소하고, 마지막으로 HBSS. 물, 70 % 에탄올 또는 HBSS 각 입력 후 플런저를 삽입합니다. </li><li> 플런저를 제거하고 바늘 너트를 느슨해진 멀리 backpressure을 방지하기 위해 주사기에서 바늘을 당기는하여 셀 로딩에 대한 해밀턴 주사기를 준비합니다. 바늘 및 너트의주의 처리가 멸균 장갑을 착용 한채로 완료되었는지 확인합니다. </li><li> 피펫 팁로 세포의 15μl를로드하고 주사기로 세포를로드하기 위해 주사기의 백 엔드에 단단히 팁을 누르십시오. </li><li> 5mm에 대한 플런저를 삽입 후 바늘 너트를 조이십시오. </li><li> 플런저 취소를 낮춰까지 세포 현탁액의 일부가 바늘을 종료 볼 수 있습니다. </li><li> 거기에 주사기에 거품이없고, 중력에 그라디언트 만들기에서 세포를 방지하기 위해 수평 위치에 주사기를 누워 있는지 확인하십시오. </li><li> T8 및 T9 (그림 2B, C)의 쪽이를 연결하는 spinalis dorsi 근육에 의해 laminectomized 마우스를 꽉 잡아. </li><li> 마우스의 전면 손바닥이 하늘에 있고 그 뒤쪽 손바닥이 가볍게 인물 2A와 2B와 같이 멸균 종이 타월의 플랫폼을 감동 있도록 왼쪽 (세로) micromanipulator 암에 hemostat를 클램프. </li><li> 오른쪽 micromanipulator 암 (70 ° 각도)에 주사기를 부착하고 고정하기 전에 가능한 한 낮은 위치로 주사기를 슬라이드. </li><li> 종이 타올에 대한 꼬리를 달아 천천히 주사기 (그림 2B)을 낮게하여 마우스를 안정화. </li><li> 코드 향해 바늘을 내리고 등의 정중선 (그림 2C)를 통해 반대 북반구에 바늘 1mm를 삽입합니다. 바늘 끝은 중앙 운하에 가까운 회색 문제에 있어야합니다. </li><li> 천천히 세포의 2.5μl를 삽입. 1μl / 5 초 속도로 주입. 세포를 주입 후, 바늘이 코드의인지 10 초마다 때까지 한 번에 10 초 기다렸다가 바늘에게 차례의 10를 철회. 세포 현탁액의 유출 가능성에 관심을 기울이십시오. </li><li> 신속하게 주사기를 철회하고 micromanipulator 부문에서 분리합니다. 수평 주사기를 내려 놓 아라. </li><li> 마우스 및 suturing 테이블에 전송 놓습니다. </li><li> 주사기납니다 때까지 반복 각 마우스 5.7-5.14 단계를 반복합니다. 도구 (살균기) 및 동물 사이에 바늘을 (에탄올로 닦고 바이) 소독. 세포를 버리고 clumping이 보이는 경우 다시로드합니다. </li><li> 하중 사이의 단계 5.1로 주사기를 청소합니다. </li></ol> 6. 봉합하고 수술 치료 <ol><li> 절개를 봉합. 봉합사의 바늘은 절개의 양쪽에있는 표면 근막에 삽입됩니다. 스레드는이를 제거 라미나의 사이트에 노출된 척수를 덮고, (그림 3A) 함께 표면 근막을 끌어를 통해 중독이다. 피부 또는 뒷면의 골격 근육에 연결된 피부 근육을 치료하지 마십시오. 약 2분의 1가. "바늘 홀더, 세 옹이가 형성되고 스레드가 가능한 매듭 가까이로 줄어들 수 있습니다 사용 떠나는를 통해 전체 스레드를 당겨. </li><li> 피부 (그림 3B)에 2 ~ 3 스테이플을 (절개의 크기에 따라 다름) 적용하여 절개를 닫습니다. 조심스럽게 기본 근육 stapling 피하기 위해 멀리 마우스 피부를 가져옵니다. </li><li> 26G3 / 8 바늘을 사용하면 하위 cutaneously 멀리 절개에서 허리에 0.5ml Lactated 링거스를 삽입. </li><li> 다시는 케이지에 넣어 마우스. 그것이 마취에서 마우스가 수술 사이트와 케이지 침구 간의 접촉을 피하기 위해, 우리에의 측면에 배치해야하는 동안 편안하게 숨을 쉴 수있게되도록합니다. 케이지스는 가열 패드에 배치해야합니다. </li><li> 마취가 출혈이 가라 앉다을 보장하기 위해 약 기운이 떨어지기 후에 마우스가 모니터링되고 봉합은 폐쇄, 그 생쥐는 사전에 수술의 이동성으로 돌아갑니다. </li><li> 진통 buprenorphine (0.05-0.1 MG / kg) 다음과 같은 수술 생쥐 한 번 드셔보세요. </li><li> 장애 쥐가 먹이와 물을 충분한 액세스 권한이 있는지 확인 : 물 병 연장 3.5 인치 spouts과 아르 손으로 먹이로 물 및 / 또는 높은 열량식이 보충제 (Nutri - 칼, Tomlyn)을 도보로 수없는 생쥐가 장착되어 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 원하는 결과를 주사하는 동안 세포 현탁액의 유출의 부족에 의해 및 절차에 따라 척수의 손상 외모로 식별됩니다. 이를 위해, 그것은 laminectomy 동안과 주입하는 동안 마우스의 척추에 밝고 직접 조명을 가지고 중요합니다. 최적의 조명 광섬유 조명 (그림 2A)에 의해 촉진됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 - Laminectomy (A) 일단 척추 T9가 solidly 점수 마이크로 가위의 진입을 촉진하기위한 T10와 T11 사이의 메스와 척추 (B, C), Graefe의 집게와 함께 개최됩니다.. (D) 조심스럽게 T10 및 T11 (화살표와 삽입된 페이지, E) 사이의 공간을 통해 마이크로 가위를 슬라이드와 지느러미 라미나을 무료로 각 측면에있는 pedicles (대시, E)를 잘라. (F) rostrally 라미나을 전환하고 잘라. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. NSCs의 사출. (A) 70 각도로 오른쪽 팔을 왼쪽 팔과 해밀턴 주사기에 연결된 마우스를 쥐고있는 hemostat과 micromanipulator의 일반적인 설정. (B) hemostat는 T8과 T9의 쪽이를 연결하는 spinalis dorsi 근육을 보유. (C) 주사 바늘은 t를 통해 저하됩니다그는 정중선과 중앙 운하에 근위 반대 북반구에있는 회색 물질로. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 봉합하고 상처 폐쇄가. (A) 봉합은 절개의 양쪽에있는 표면 근막에 적용됩니다. (B) 절개는 필요에 따라 2-3 스테이 플스 (한 주요 3 필요 상처에 표시)으로 닫힙니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

잘 실행 이식 세포의주의 laminectomy 및 사출에 주로 힌지 것입니다. laminectomy 중에 피하기 위해 기본 함정은 척수의 손상이다. 이 절차 자체 동안이나 절차에 따라 남아 날카로운 뼈 조각에 의한 손상에 의해 발생할 수 있습니다. 이것을 방지하려면 곡선 마이크로 가위의 포인트는 항상 멀리 코드에서 직면 확인하고 신중하게 모든 뼈 조각이 해제되는 것을 보장하기 위해 laminectomized 척추를 검사하고 나머지 척추 구조가 명백히 튀어나온이나 계단이없는 가장자리 것을. 이전에 언급했듯이 빛을 주사하는 동안 노출된 척수에 밝은 직접 빛나는 경우 유출의 검색이 가능합니다. 유출은 30 게이지 바늘 (33 게이지 비교)과 사출이 너무 빠르게 할 경우 일어날 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 우리에게 좋은 결과를 주신지만, 다른 retracting 바늘 다음 사출 8,9에게 전 (최대 5 분) 기간을 기다리고 이상보고있다. 또한, 작은 게이지 바늘이 바람직하지만, 우리는 33 게이지 바늘을 통과하면 일부 세포가 너무 쉽게 lys​​ed 것을 관찰했습니다. 효율을 극대화하기 위해 네 가지 방송국 (마우스를 준비, laminectomy, 사출 및 봉합) 매닝 이식 팀이 바람직합니다. 또한, 각 절차에 대한 타이밍은 세포가 얼음위에 대기하는 시간을 최소화하기 위해 최적화해야합니다. 예를 들어, 우리가 4 (주사기의 각 하중에 복용의 숫자)의 그룹의 마우스를 이식, 세포를 주입 사람이 세 번째 마우스가 laminectomized 후 주사기를로드 시작하고 생쥐를 준비하는 사람은 다음과 마취해야 이전 그룹의 두 번째 마우스 이후 그룹이 laminectomized되었습니다. 각각의 마우스가 약 30-40 분 소요됩니다하더라도 이러한 방법으로, 우리는 약 3 시간 40 마우스로 셀 (또는 제어 미디어) 이식 수 있습니다. 일부 CNS 장애의 치료를위한 세포 대체 요법 10 임상 실험에 있습니다. 이 NSC 이식 및 바이러스성 유도 demyelination MS의 중요한 모델의 사용을 용이와 생쥐의 척수 코드에 NSCs의 engraftment위한 프로토콜의 생체내 모델에 대한 대체가없고 쉽게 다른 모델로 적용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> 피닉스 Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine 하이드로 클로라이드 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> 나이르 </td><td> 처치 &amp; 드와이트 (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  μl 해밀턴 주사기 W / 이동식 바늘 </td><td> 해밀턴 회사 </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 해밀턴 바늘, 30G 또는 33 G, ½ 인치, 30 ° 사각 </td><td> 해밀턴 회사 </td><td> 7803-077803-05 </td><td> 사용할 수있는 최고의 게이지를 확인하기 위해 바늘을 통해 통로를 따라 당신의 세포의 생존을 테스트 </td></tr><tr><td> 마이크로 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> 소형 Graefe의 포셉 </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 1772 유니버셜 홀더 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 1773 전극 홀더 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 902 작은 동물 stereotaxic </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 960 왼쪽 전극 캐리어 </td><td></td></tr><tr><td> 봉합 </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated 링거스 </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> 스테이 플스 </td><td> 파인 과학 </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpels, 크기 10,11 </td><td> 어부 </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> 봉합 </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> 크기 5-0, 3 / 8 &quot;원형, 19mm 바늘, 45cm 꼰 스레드 </td></tr><tr><td> 리플렉스 7 상처 클립 작은 주걱 </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm 리플렉스 상처 클립 </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> 올센 - 헤거 니들 홀더 </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

마우스 간염 바이러스의 neurotropic JHM 스트레인 (MHV)에 감염된 생쥐는 demyelinating 질병 다중 경화증 (MS) 환자와 유사한 병리 및 임상 결과를 개발할 수 있습니다. 우리는 모두 remyelination 및 임상 결과에 상당한 개선 아픈 쥐 결과의 척추 코드에 NSCs의 이식을 표시합니다. 만성 neurologic 질환의 치료를위한 세포 대체 요법은 이제 현실이며, 생체내 모델에 engrafted 세포 및 호스트 조직 microenvironment 사이의 상호 작용을 이해하는 핵심입니다. 이 프레 젠 테이션 JHMV에 감염된 생쥐의 척수에 세포를 이식에 대한 적응 방법을 제공합니다. 간단한, 우리는)​​) II, 이전 이식)를 게시 수술 치료를 미리 수술 생쥐의 치료, 3) laminectomy 통해 척수의 노출, IV) NSCs의 stereotactic 사출 및 IV를 NSCs의 준비를 I에 대한 절차를 제공합니다 .

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

신경친화성 마우스 간염 바이러스(mouse hepatitis virus, MHV) JHM 균주에 감염된 마우스는 ... 환자와 유사한 병리적 및 임상적 결과를 보입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 JHMV에 감염된 마우스의 척수에 신경 줄기세포를 이식하여, 탈수초화가 진행된 동물의 재수초화를 촉진하고 임상적 개선을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 실험 동물을 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 흉추 부위에서 척추후궁절제술을 시행하는 것입니다.그 다음 10개의 세포를 노출된 척수에 주입합니다. 주입이 성공적으로 완료되면 상처 부위를 봉합합니다. 최종적으로 척수 내 마우스 신경 줄기 세포의 존재를 확인합니다.실질 조직은 형광 현미경과 같은 방법으로 시각화할 수 있으며, JHMB의 척수로 신경줄기세포를 이식할 수 있습니다. 감염된 마우스 모델은 세포가 어떻게 이동, 증식 및 분화하는지, 또한 세포가 중추신경계에 어떤 영향을 미치는지와 같이 탈수초성 질환 치료를 위한 세포 대체 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 치료적 이점을 강화하기 위해 이식되는 세포나 척수 환경을 수정할 수 있는지 여부도 확인할 수 있습니다.이 방법은 탈수초화 바이러스 모델에서의 세포 대체 요법에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 및 척수 손상과 같은 다른 탈수초화 및 손상 모델에도 적용될 수 있습니다. 세포 주입을 준비하기 전, 필요한 모든 용액을 조제하십시오. 그다음, 모든 장비를 세척하고 멸균하십시오.수술 부위를 준비하고 마이크로 매니퓰레이터를 설정하여 이식할 세포를 트립신 처리하여 준비한 후, 50 milliliter 원추형 튜브에 재부유시킵니다. 이식할 세포를 HBSS로 3회 세척합니다. 마지막 원심 분리 전에 세포 수를 측정합니다.마지막 원심 분리가 끝난 후, HBSS 상층액을 따라내고 펠릿에 액적(droplet)이 닿지 않도록 튜브를 뒤집은 상태로 둡니다. UV 조사된 멸균 Kim wipe로 내부 벽면을 닦아냅니다. 이때 펠릿이 마르지 않도록 주의하십시오.튜브를 수직으로 세운 상태에서 천천히 매우 조심스럽게 유지하십시오. 최종 목표 부피의 절반에 해당하는 HBSS에 세포를 재부유시킵니다. 최종적으로 세포 농도는 microliter당 100,000 cells가 되어야 합니다.현탁액을 피펫 팁에 취한 후, 현탁액 전체가 피펫 팁에 들어올 때까지 피펫의 다이얼을 조정하여 전체 부피를 측정하십시오. 이를 통해 원하는 농도를 맞추기 위해 필요한 HBSS의 추가 양을 알 수 있습니다. 세포의 부피를 원하는 수준까지 맞추십시오.HBSS를 첨가하여 세포를 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 다시 얼음 위에 둡니다.세포를 2시간 이상 얼음에 보관해야 하는 경우, 세포의 생존력을 확인하십시오. 수술 절차를 시작하기 전, 발가락 꼬집기 반사(toe pinch reflex)를 통해 마취 수준이 적절한지 확인합니다. 전기 이발기를 사용하여 마우스의 허리 아래쪽부터 목까지 등 부위를 제모하십시오.해당 부위를 면도한 후, 제모 크림을 얇게 도포하여 남아 있는 털을 제거합니다. 1~2분 후, 마른 거즈로 해당 부위를 깨끗이 닦아낸 다음 비눗물에 살짝 적신 거즈로 다시 닦아냅니다. 이제 수술 부위에 털이 없어야 합니다.마지막으로, 준비된 부위를 Betadine 용액으로 소독하고 눈에 연고를 도포합니다. 건조를 방지하기 위해 마우스를 등 쪽이 위로 오도록 배치합니다. 흉추 부근부터 시작하여 척추궁 절제술 부위 위로 절개합니다.T 8에서 T 11까지입니다. 척추의 곡률을 강조하여 T 10을 찾으십시오. 이곳은 편평한 돌기가 있는 첫 번째 척추이며, 일반적으로 척추 곡률의 정점에서 두 개의 척추만큼 머리 쪽(rostral)에 위치합니다.회색 포셉을 사용하여 척주를 단단히 고정합니다. T9 위치에서 메스로 T10과 T11의 두 가시 돌기 사이의 공간에 절개선을 넣습니다. 다음으로, 가위의 곡면이 척수 반대 방향을 향하도록 주의하면서 근육층을 긁어내어 아래의 뼈를 노출시킵니다.가위 날 하나를 T 10과 T 11 사이에 천천히 삽입합니다. 날을 척수와 T 10의 척추경(pedicle) 사이에 밀어 넣어 척추경을 절단합니다. 반대편에서도 동일하게 반복합니다. 척추궁판(lamina)을 들어 올려 그 아래의 척수를 노출시킨 후 조심스럽게 절단합니다.유리되거나 거친 뼈 조각이 남지 않도록 주의하십시오. 모든 뼈 조각을 제거한 후, 멸균 면봉으로 혈액을 닦아냅니다. 먼저, 니들 너트를 사용하여 바늘을 부착하여 Hamilton 시린지를 준비하십시오.플런저를 삽입하고 물로 여러 번 세척합니다. 세척 후에는 70% ethanol과 HBSS로 한 번씩 헹굽니다. 플런저를 제거하고 바늘 너트를 풉니다.역압을 방지하기 위해 바늘을 주사기에서 멀리 떼어냅니다. 세포를 로딩할 때는 피펫 팁을 주사기 뒷부분에 밀착시켜 15 µL의 세포를 주사기에 넣습니다. 플런저를 약 5 mm 정도 삽입한 후 바늘 너트를 조입니다.세포 현탁액의 일부가 바늘 끝으로 나올 때까지 플런저를 누릅니다. 주사기 안에 기포가 없는지 확인하고, 중력에 의해 세포 농도 구배가 형성되는 것을 방지하기 위해 주사기를 수평으로 눕힙니다. 다시 동물로 돌아가 지혈집게를 사용하여 S 극돌극근을 잡습니다.T8과 T9의 척추를 연결합니다. 마우스의 앞발은 공중에 뜨고 뒷발은 멸균 종이 타월 플랫폼에 살짝 닿도록 지혈鉗(hemostat)을 왼쪽 마이크로 조작기 암(micro manipulator arm)에 고정합니다.주사기를 오른쪽 마이크로 조작기 암에 70도 각도로 부착하고, 클램프로 고정하기 전에 주사기를 가능한 가장 낮은 위치까지 밀어 넣습니다. 종이 타월에 꼬리를 고정하여 마우스를 안정시킵니다. 바늘을 척수를 향해 천천히 내립니다.등쪽 정중선을 통해 반대쪽 뇌반구로 팁을 1mm 삽입하십시오. 바늘의 끝은 회색질 내 또는 중앙관에 닿지 않으면서 그 근처에 위치해야 합니다. 5초당 1µL의 속도로 2.5µL의 세포를 천천히 주입하십시오.세포를 주입한 후 10초 동안 대기하고 바늘을 후퇴시킵니다. 1/10바퀴 정도 돌립니다. 바늘이 척수에서 완전히 빠져나올 때까지 10초마다 이 속도로 후퇴시킵니다.세포를 너무 빠르게 주입하거나 바늘을 너무 빨리 제거하면 세포 현탁액이 역류할 수 있습니다. 이러한 현상이 발생하면 해당 마우스는 연구 대상에서 제외하십시오. 탯줄에서 바늘을 제거한 후, 빠르게 바늘을 후퇴시키고 마이크로 매니퓰레이터 암에서 주사기를 분리하십시오.다시 마우스를 수평으로 눕힙니다. 마우스를 놓아주고 봉합대로 옮깁니다. 주사기가 비워질 때까지 각 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다.세포 응집이 관찰되면 세포를 버리고 다시 장전하며, 장전 사이에 시린지를 세척하고 청소합니다. 주입 후, 동물은 봉합을 위해 별도의 장소로 이동합니다. 절개창 양측의 표재근막을 통해 봉합 바늘을 통과시킵니다.봉합사를 당겨 근막을 모으고, 제거된 추궁 부위의 노출된 척수를 덮어줍니다. 포셉과 니들 홀더를 사용하여 매듭을 세 번 묶고 실을 최대한 짧게 잘라냅니다. 생쥐의 피부를 젖힐 때는 보통 하나의 봉합사만으로 충분합니다.하부 근육이 스테이플에 함께 박히지 않도록 주의하며, 절개 부위를 2~3개의 스테이플로 봉합합니다. 상처가 모두 폐쇄되면 젖산 링거액 0.5 milliliters를 절개 부위를 피해 허리 하단 피부 아래에 피하 주사합니다. 마우스가 케이지 바닥재에 수술 부위가 닿지 않도록 주의하며 케이지 안에 옆으로 눕혀 둡니다.동물이 완전히 회복될 때까지 관찰하십시오. 이 이미지는 척수 관상면에서 성공적으로 이식된 GFP 표지 생쥐 신경줄기세포를 보여줍니다. 이식 후 21일째입니다.이 영상을 시청하고 나면, JHMV에 감염된 마우스의 척수에 신경 줄기세포를 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면 약 3시간 만에 마우스 40마리를 대상으로 이 기술을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

출처: Weber, R. Z., et al. 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 뇌내 이식 및 생체 내 생물 발광 추적. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 유전자 변형 인간 신경 전구 세포(NPC)를 마우스 뇌로 정위 이식하는 방법을 보여줍니다. 연구자들은 루시페라아제와 형광 단백질을 발현하는 NPC를 주입하여 생체 내 생물발광 이미징과 사후 형광 현미경을 통해 신경학 연구에서 세포 생존, 이동 및 통합을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 이식

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

이 비디오는 종양 용해성 바이러스가 로드된 치료용 신경 줄기 세포를 뇌종양 보유 마우스 모델에 비강 내 전달을 보여줍니다. 줄기세포의 비침습적 비강 내 투여는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 치료 적용을 위해 뇌의 종양 부위로 전달을 용이하게 합니다.

쥐 모델에서 치료용 신경 줄기세포(NSC)의 비강 내 전달: 종양 용해성 바이러스가 로드된 NSC를 뇌종양 베어링 마우스 모델에 종양 표적 전달하기 위한 절차

출처: Parajuli, B., et.al. 비침습적 경비강 경로를 통한 면역 적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 미세아교세포의 이식. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 유도 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG) 세포를 마우스 뇌로 경비강 이식하는 방법을 보여줍니다. 히알루로니다아제는 미세아교세포가 고갈된 마우스의 콧구멍에 적용되어 투과성을 향상시킵니다. iPSMG 현탁액을 비강 내로 투여하고 마우스를 회복시킵니다. 성장 인자가 풍부한 배지는 뇌 조직에서 iPSMG 생존을 지원하기 위해 정기적으로 투여됩니다.

유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 마우스 뇌로 경비강 이식

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

본 프로토콜은 종양 세포를 추간 공간에 주입하여 척수 신경교종의 재현 가능한 쥐 모델을 개발하는 방법을 설명하며, 연구 및 치료 개발을 위한 보다 효과적이고 덜 침습적인 접근 방식을 제공합니다.

종양 세포를 마우스의 척수에 외과적 이식

학습하세요 JHMV 감염 마우스 척수에 신경 줄기 세포 이식 방법을 통해 재수초화 및 임상 개선을 촉진하는 기술을. 이 프로토콜은 다발성 경화증 같은 탈수초화 질환의 세포 치료 연구에 활용됩니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

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