Name: 고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 고양이 성상세포에서 산화 스트레스를 측정하는 방법을 CM-H2DCFDA 형광 지시약과 유세포 분석을 사용하여. 이 기술은 신경보호 연구와 중추신경계 질환 이해에 필수적입니다.

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1. 세포 고양이 astrocytes의 문화와 H 2 O 2와 치료 <ol><li> 37 DMEM 미디어 플러스 영양소와 75cm이 플라스크에 문화 세포주 G355 - 5 ° C와 5% CO 2 60 % 합류 (~ 5 일)까지. 모든 1~2일 미디어를 교체 또는 건강한 문화를 유지하는 데 필요한. </li><li> 미디어를 제거하고 0.25 %의 트립신 2 ML를 추가합니다. 45 S에 대한 pipetting하여 세포를 리프트 - 실내 온도 (RT)에서 1 분. </li><li> 신속 미디어 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG, 23 ° C에서 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 신선한 미디어 6-7 ML을 추가하고 세포를 resuspend. </li><li> 6 잘 플레이트의 각 잘하는 셀 ~ 1 ML을 추가합니다. 각 물론 미디어로부터 2-3 ML을 추가하고 80~90%의 합류까지 품어. </li><li> 미디어 과산화수소의 100μM 솔루션 (H 2 O 2)를 준비합니다. </li><li> 각 우물에서 미디어를 제거하고 하나 둘 ML 신선한 매체 (제어), H 2 O 2 (치료) 또는 DPBS의 2ml 2 ML로 바꿉니다. ° C, 5 % CO 2 3 H. 위해 37 알을 품다 </li><li> 솔루션을 제거하고 세포를 리프트하는 트립신 1 ML를 추가합니다. 0.5 ML의 DPBS을 포함하는 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포를 전송합니다. 이 단계는 연장 트립신 보육에서 세포 죽음을 방지하기 위해 각 잘 개별적에서 수행되어야합니다. </li><li> 3 분 300 XG에 스핀, 버리고 뜨는 및 DPBS 1 ML에 resuspend. </li></ol> 2. ROS를위한 염색법 <ol><li> 얼룩의 모든 단계 표백 방지하기 위해 최소한의 빛의 노출을 실시해야합니다. </li><li> 긍정적인 제어 50 MM의 CCCP 1 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C, 5 % 5 분 CO 2. </li><li> H 2 O 2 그룹 10 MM CM - H 2 DCFDA 솔루션 5 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C 5 % CO 15-30 분 2. 아무 얼룩은 생리 예제에 추가하지 않습니다. </li><li> 잔여 얼룩을 제거하는 DPBS 2 ML과 샘플을 씻으십시오. </li><li> 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG에 스핀. </li><li> DPBS 0.5 ML에서 세포를 Resuspend. 생리를 제외하고, 각 예제 1 μl PI를 추가합니다. </li><li> 5ml 흐름 cytometer 튜브에 샘플을 전송합니다. </li><li> 흐름 cytometer를 실행합니다. </li></ol> 3. 유동세포계측법 <ol><li> 525, 775 및 620 nm의 모든 ± 20 nm의 : 488 nm의 아르곤 레이저 다음과 같은 밴드 패스 갖춘 베크맨 쿨터 FC500 (또는 이에 상응하는 금액)에서 샘플을 실행합니다. </li><li> 해당 컨트롤을 준비 : 흠없는 세포가, CM - H 2 DCFDA은 (대조군) PI 단, 더블 스테인드 밖에 스테인드. </li><li> FS 대 SS, PI 대 CM - H 2 DCFDA 다음 histoplots을 가진 프로토콜을 확인합니다. 또한 다음과 같은 histograms을 가집니다 얼룩에 해당하는 휴대폰 번호 대 FL1, FL2 및 FL3을. </li><li> 샘플을 실행하기 전에, 장비, 유체 및 폐기물 컨테이너를 확인합니다. 최소한 20 분 장비를 따뜻하게. </li><li> 장비를 청소하고 제조 업체의 표준에 따라 적절한 주판으로 보정을 수행합니다. </li><li> 귀하의 프로토콜을 선택하고 샘플을 실행합니다. </li><li> 이전 완료로 장비를 청소하십시오. </li><li> 제조 업체의 기준에 따라 진공 라인을 청소하십시오. </li><li> 흐름을 끄고 머리 / 진공 라인을 청소하십시오. </li><li> 소프트웨어 및 컴퓨터를 끕니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 유동세포계측법 결과는 FlowJo 7.6과 얼룩 컨트롤이 객관적으로 게이팅을 설정하는 데 사용되었다를 사용하여 분석했다. 이것을 근거로, 건강한 세포가 히스토그램 및 ROS (산화 스트레스)의 왼쪽에 표시가 오른쪽으로 세포의 변화로 감지되었다. 그림 1은 건강한 고양이 astrocytes에 과산화수소의 효과의 결과를 보여줍니다. FL1에서 데이터는 ROS의 존재를 나타내는 CM - H 2 DCFDA의 강도를 측정하는 데 사용되었다. 예상했던대로, ROS의 높은 금액은 H 2 O 2 대우 샘플에서 발견되었다. 이것은 왼쪽에서 오른쪽으로 형광 강도의 변화로 히스토그램에 표시됩니다. DMEM 대 DPBS 취급 건강한 세포를 비교하면, ROS의 양을 (그림 2)에는 큰 변화가 없었다. <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 건강한 고양이 astrocytes에서 산화 스트레스의 수준과 건강한 세포에 H 2 O 2의 효과 그림 1. 유동세포계측법 결과. 결과없이 치료 (DMEM)과 세포와 비교하여 H 2 O 2 건강한 세포에 ROS의 수준을 증가시킬 수있다는 것을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> DPBS와 3hrs에 대한 incubated 건강한 세포에 감지 ROS의 수준의 그림 2. 유동세포계측법 결과.

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</ol>

바이러스 자주 제안된 메커니즘의 연결 손상이 산화 스트레스 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31 유도. 기본적으로, 그것은 제안 이러한 수산화, 초과 산화물의 음이온, 질산 산화물 및 / 또는 신경에​​ 독성이 과산화수소, 같은 바이러스성 노출을 통해 glia (astrocytes와 microglia)가 릴리스 반응 산소 래디 칼. 마찬가지로, 산화 스트레스는 또한 암페타민 유발 neurotoxicity 2, 6, 17의 주요 pathologic 메커니즘으로 제안되었습니다. 우리 그룹 CNS에 대한 학대의 바이러스와 약물 모두의 영향에 관심이 있기 때문에, 우리는 astrocytes에 초과 ROS의 현재를 결정하는 빠른 선별 검사를 사용하여 선출. 의 연결을 글루타티온의 대부분은 astrocytes 제작한 다음 뉴런 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30로 전달됩니다. 따라서, 산화 스트레스에 astrocytes 역할은 뉴런에 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-020 - CL </td><td> 1퍼센트 (V / V) </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Hyclone </td><td> 17 - 605E </td><td> 1퍼센트 (V / V) </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Hyclone </td><td> 25-025 - CL </td><td> 1퍼센트 (V / V) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (V / V) </td></tr><tr><td> 필수 아미노산 </td><td> Cellgro </td><td> 25-030 - CL </td><td> 0.2 % (V / V) </td></tr><tr><td> 500ml 진공 여과 시스템 </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75cm 두 조직 문화 flasks </td><td> 매 </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 잘 조직 배양 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM - H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Propidium의 이우 (PI) </td><td> 시그마 </td><td> P4170 - 10mg </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> 시그마 </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ의 항생제 </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0.1 % (V / V) </td></tr><tr><td> G355 - 5 전지 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 2033 </td><td> 일반 고양이 뇌 </td></tr></tbody></table>

고양이 astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, g355 - 5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

의 연결을 손상을 유도 바이러스의 자주 제안 메커니즘은 산화 스트레스입니다. Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 산화 스트레스를 조절에 중요​​한 역할을했습니다. Astrocytes는 반응 산소 종 (ROS)에서 뉴런뿐만 아니라 보호하는 뉴런에 생체 항상성 환경을 유지할 수 있도록 도와주십시오. CM - H2DCFDA는 ROS의 존재에 대한 세포 침투성 표시기입니다. CM - H 2 DCFDA이 아닌 형광 화합물로 세포를 입력하고, 휴대폰 esterases은 아세테이트 그룹을 제거한 후 형광되고, 화합물이 산화됩니다. 녹색 fluorescing 것으로 판단될 유동세포계측법에 의해 측정한 세포의 숫자는 산화 상태에있는 세포의 수를 나타냅니다. CM - H 2 DCFDA 다른 ROS 다수에 의해 산화 쉽습니다. 이 분석에 관계없이하는 산소의 산화 세포 환경을 화면으로 사용할 수로 ROS는 CM - H 2 DCFDA을 산화 수있는에 대한 특이성의이 부족은,이 화합물 pathogenesis 조사의 초기 단계에 사용하기 위해 가치있는 리젠트합니다 ROS의 급진 또는 조합은 세포 조건에 책임이 있습니다. 일단 그것은 ROS가 CM - H 2 DCFDA의 산화에 의해 현재 다음 추가 실험이 ROS 또는 로스의 조합이 특정 pathogenesis 과정에 참여하는 결정하기 위해 수행할 수있는 것으로 설립되었습니다. 본 연구의 결과는 과산화수소 CM - H 2 DCFDA의 증가 또한이 분석은 G355 - 5 세포 내에서 산화 환경을 검출을위한 가치있는 테스트입니다 나타내는 생리 컨트롤에 상대적으로 감지되었습니다 형광 것을 입증 고양이 astrocyte 세포 라인.

산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.

고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5

바이러스로 인해 유도되는 신경 세포 손상의 기전으로 자주 제시되는 것은 산화적 스트레스입니다. 성상교세포는 ...의 산화적 스트레스를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.

성상세포는 중추신경계의 산화성 스트레스를 조절하여 뉴런을 위한 항상성 환경을 유지하고, 활성 산소종으로부터 뉴런을 보호하는 중요한 역할을 합니다. 본 과정에서는 성상세포의 산화성 스트레스를 분석하는 방법을 제시합니다. 이 분석법의 작동 원리를 설명하기 위해, 과산화수소와 세포 대사 과정에서 일반적으로 생성되는 ROS를 고양이 성상세포에 적용하여 분석합니다.활성 산소종(reactive oxygen species) 측정을 위해 세포 투과성 지시약인 CMH 2D CFDA를 세포에 첨가합니다. CMH 2D CFDA는 비형광 화합물 형태로 세포 내로 진입하며, 세포 내 에스테라제(esterases)가 아세테이트 그룹을 제거합니다. 활성 산소종이 존재하면 이 화합물이 산화되어 형광을 띠게 됩니다.그 다음 세포를 회수하여 유세포 분석법으로 형광을 측정합니다. 형광 세포의 수는 산화 상태에 있는 세포의 수를 나타냅니다. 물론, 이후의 목적은 서로 다른 프로브를 사용하여 세포 내에 어떤 특정 산소 라디칼이 존재하는지 검출하는 것입니다.이는 특히 신경학 분야에서 매우 중요하며, 신경 질환에서 생성되는 다양한 라디칼과 서로 다른 질병 및 인자들을 기본적으로 연관 지을 수 있게 함으로써 신경학자들에게 새로운 연구 방향을 열어주었습니다. 이러한 성과는 저희 실험실의 두 기술자인 Omar Alvarado와 Andrea Warnell, 그리고 대학원생인 Jonathan Lee의 뛰어난 기술적 숙련 덕분입니다.영양분이 첨가된 DMEM이 담긴 75 cm² 플라스크에서 고양이 성상교세포(astrocyte) 세포주 G 3 55-5를 배양하여 이 절차를 시작합니다. 세포가 약 60% 합류(confluent)될 때까지 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, 이는 약 5일이 소요됩니다. 건강한 배양 상태를 유지하기 위해 1~2일마다 또는 필요에 따라 배지를 교체합니다.세포가 적절한 밀도에 도달하면, 흡입법으로 배지를 제거합니다. 0.25% Trypsin 2 mL를 첨가하고, 실온에서 45초에서 1분 동안 피펫팅하여 세포를 떼어냅니다.이는 세포 사멸과 손상을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 현탁액을 10 mL의 배지가 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브로 빠르게 옮긴 후, 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 부드럽게 섞어줍니다. 세포 현탁액을 300 g, 23 °C에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿을 얻습니다.원심분리 후, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 펠

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Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

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Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

배우세요 고양이 성상세포에서 산화 스트레스를 측정하는 방법을 CM-H2DCFDA 형광 지시약과 유세포 분석을 사용하여. 이 기술은 신경보호 연구와 중추신경계 질환 이해에 필수적입니다.

고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5

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