Name: Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 학습하세요 수술 후 신선한 조직에서 온콜리틱 백신 바이러스의 복제를 평가하는 방법을. GFP 및 루시퍼레이스 발현을 통해 바이러스 감염성을 모니터링하고 환자 맞춤 암 치료 적용 가능성을 확인합니다.

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우리는 그림 2에 표시되는 데이터에 대한 인간의 수술 표본을 제공하는 박사 Hesham Abdelbary 감사하고 싶습니다.

1. 조직 처리 <ol><li> 최상의 결과를 얻으려면,이 프로토콜은 신선하게 고립 조직 10 % 이전 처리하기 위해 수술 다음 FBS, 1 %의 Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 즉시 0.1 % Amphothericin B 솔루션을 포함하는 DMEM 매체로 입금을 사용하여야한다. 이것이 불가 능할 경우, 조직은 사전 처리 4 정도에서이 중간에 밤새 남아있을 수 있습니다. </li><li> 전에 샘플을 처리하기 위해 적어도 5 분 70 % 에탄올 용액에서 그들을 입금하여 금속 집게와 일회용 블레이드를 검사. 또한 10 %를 포함하는 DMEM 매체 2 ML FBS, 1 %의 Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 0.1 % Amphothericin B.있는 24 잘 플레이트를 준비 </li><li> 소독 집게를 사용하여 층류 유동 세포 배양 후드에서 조직 샘플을 수집하고, 측면에 멸균 쪽 뚜껑을 유지, 빈 15cm 배양 접시에있는 조직을 입금. </li><li> 세포 배양 후드에서, 그림 1에서와 같이 조직 내의 지역의 다양한 다른 코어를 얻기 위해 2mm 생검 펀치를 사용합니다. 그들은 쉽게 수평 축을 따라자를 수 있도록 각각의 코어 사이에 충분한 공간을두고, 집게의 도움으로 15cm의 배양의 뚜껑에있는 코어를 입금. </li><li> 그림 1에서와 같이 소독 면도날을 사용하여 4 분기에도 각각의 코어를 분할. </li><li> pipet 팁을 사용하여 이미 DMEM 10 % FBS, 1 % Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 0.1 % Amphothericin B 솔루션을 포함하는 1.5 ML를 포함, 그림 1과 같이 A4로 A1에서 다른 우물에 주어진 핵심에서 각 코어 분기하다 . 각각의 코어에 대해 반복합니다. 주어진 잘 / 상태 편견을 최소화하면서 이것은 종양의 대표적인 표본 추출을 허용해야합니다. 더 나은 표현을 위해, 코어의 개수를 증가시킵니다. </li></ol> 2. 조직 생존 능력 평가 <ol><li> 그림 1에 표시된와 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 37 도로 1 시간 동안 품어으로 다음과 같은 조직 처리, 잘 # A1과 A2에 25μl # 알라마 파란색을 추가합니다. </li><li> 알라마과 청색에 따라 부화는 각 A1과 A2 우물에서 3 회 100 μl를 제거하고 96 - 웰 플레이트에 6 개의 우물을 전송할 수 있습니다. 형광 플레이트 리더 (530 여기, 590 방출)를 사용하여 신호를 읽고 기록에 대한 데이터를 보관. </li><li> 알라마 푸른 신호가 읽은 후에는 DMEM 10 % FBS + PS + AmphoB 포함되어 C1에 잘 A1에서 pipet 팁을 사용하여 조직의 모든 조각을 전송합니다. 잘 A1에서 미디어의 과도한 금액을 전송하지 않도록주의하십시오. </li><li> GFP - 표현과 우두 바이러스 미디어 25 μl에 희석 루시페라제 - 표현 10 6 PFU와 각각 우물 A3와 A4를 감염. 음 A2는 눈꼽만치도를 포함하지 주어진 transgene을 표현하는 바이러스에 감염된 수 있습니다. </li><li> 72시간 후, 우물 C1 및 D1 25 μl 알라마 파란색을 추가하고 2.2 단계 반복 </li></ol> 3. 개화 현미경에 의해 GFP transgene 표현의 시각화 <ol><li> 좋은 형광 사진을 찍는하기 위해 조직 조각을 다루는 모든 세포 배양 미디어를 제거합니다. </li><li> 형광 가능 해부 현미경을 사용하면, 먼저 적절한 해상도 위상 콘트라스트 이미지를 받아 </li><li> 형광 모드로 전환이 경우 GFP에 대한 관심의 transgene을 시각화하기 위해 적절한 필터를 사용하여 사진을 찍었. </li><li> 배경 형광의 사진을 찍을 관심 transgene (예 : RFP 등)의로부터 멀리 가능한 다른 파장의 형광 필터를 사용 </li></ol> 4. 루시페라제 표현의 시각화는 생체내 이미징 시스템 (IVIS)에서 사용하여 <ol><li> 당신이 시작하기 전에 IVIS이 초기화되어 있는지 확인합니다. </li><li> 웰스 A4와 B4에 MG / ML, 잘 섞어 실온에서 5 분 품어 luciferin 기판 10 5 μl를 추가합니다. </li><li> 오초에 IVIS 노출 시간을 설정하고 웰스의 사진을 찍을. 이미지가 포화되면, 낮은 노출 시간 반복하십시오. 신호가없는 경우에는 노출 시간을 향상시킬 수 있습니다. </li><li> IVIS 이미징 소프트웨어를 사용하면 잘 B4의 신호를 사용하여 배경을 제거하고 발광 신호를 수치 관심의 영역을 선택할 수 있습니다. </li></ol> 5. 플라크의 분석에 의해 바이러스 titers 평가 <ol><li> 전에 바이러스 titers을 quantifying하기 위해 조직이 처음 바이러스 입자를 공개 균질해​​야합니다. -80에 저장되며 이것은 감염된 조직 샘플에서 여러 달 후에 할 수 있습니다 </li><li> 분석 척도를 사용하여 균질해야 샘플을 달다. 이 경우, 우리는 잘 A2에서 수집한 샘플을 사용합니다. </li><li> 조직은 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 팔콘 튜브에 플레이스와 PBS 1 ML를 추가합니다. 조직 균 질기를 사용하여 조직을 균질. 필요한 경우, 나중에 바이러스 titers 평가를위한 -80에서 homogenate를 저장합니다. </li><li> , titer 우두 바이러스 먼저 판 6 판에 잘 1,000,000 U2OS 세포와 37 정도에 하룻밤 품어 5 % CO 2 습기그들이 confluency 다음날 약 95 %에 도달 이러한 ified 보육. </li><li> 각 희석 단계 사이의 조언을 변경해야하고, 바이러스의 시리얼 dilutions 할 혈청 무료로 미디어를 사용합니다. 일반적으로 우리는 10 dilutions 1을 900 μl로 전송 100 μl를 사용합니다. 얼마나 많은 dilutions 만들어진 것이 예상 바이러스 수율에 따라 달라집니다. </li><li> dilutions 만들기에 따라, 도금 U20S 세포는 다음 U2OS 세포를 감염하는 바이러스 희석 주식 500 μl (각 희석)을 추가 덮고있는 미디어를 제거합니다. 5 % CO 2 배양기에서 humidified 섭씨 37도 1 시간 분 동안 세포를 품어. </li><li> 이 기간 동안, DMEM 20 % FBS 및 37도 물에 목욕의 3퍼센트 CMC 솔루션을 포함하는 집중 2 X를 따뜻하게. </li><li> 1 시간 부화 후, 감염된 U2OS 세포를 덮고있는 미디어를 제거합니다. 함께 2X DMEM, 20 % FBS와 감염된 U2OS 세포의 각 우물을 충당하기 위해이 혼합물 2 ML를 사용 3% CMC의 1시 1분 볼륨을 섞는다. </li><li> 또 다른 48 시간 37 정도 5% CO 2 humidified 인큐베이터에 다시 세포를 넣어. </li><li> 48 시간 후, 각 우물에 CMC 오버레이 위에 메탄올 - 아세트산 정착액 2 ML을 추가하고 세포 배양 후드에서 10 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 고정 오버레이를 취소하고 수돗물을 사용하는 우물의 나머지 부분을 씻어. </li><li> 마다 잘 쿠매시 푸른 솔루션 2ml와 고정 U2OS 세포를 얼룩 및 플레이트 쉐이크에서 낮은 속도로 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 쿠매시이 우물에서 얼룩 및 수돗물을 사용하여 번호판을 씻어 제거합니다. 약 한시간 덮개 해제로 건조 수 있습니다. </li><li> 그 결과 바이러스 plaques 그림 2C에서 쉽게 시각하실 수 있습니다. 번호판이 단계에서 무한정 저장할 수 있습니다. </li><li> 10 ~ 100 plaques 볼 수있는 희석 단계에서 plaques를 계산합니다. </li><li> 사용 희석하여 계산 plaques의 수를 곱하면 PFU / ML의 titer를 제공하기 위해 2 결과 수를 모두 곱하면됩니다. 25 plaques가 잘 만 배 희석 사용 어디에서 계산하는 경우 예를 들어, 초기 undiluted 샘플의 titer는 2 50000000 PFU / ML 곱한 1,000,000 곱한 25. 또한 PFU / g에 titers를보고 샘플에 대한 측정 처음 무게로이 번호를 나누어 </li></ol> 6. 대표 결과 : 정확하게 수술 얻은 정상 / 종양 조직 샘플은 또는 바이러스에 infectable하지 여부를 확인하기 위해, 하나는 먼저 조직 샘플 가능한 최소한 있는지 확인해야합니다. 그림 1A는 생존이 신진 대사 염료 (알라마 파란색)과 정상과 종양 조직 모두 적어도 72h 기간 동안 metabolically 활성 상태로 유지 수를 사용하여 평가 수 있습니다 보여줍니다. 이것은 조직 교양 전직의 생체내 바이러스는 복제를 지원할 수있다하는 것이 좋습니다. oncolytic 바이러스의 중요한 이점은 그들이 치료 또는 영상 transgenes을 표현하는 설계 될 수있다는 것입니다. 그림 2D - E는 GFP 또는 루시페라제가 추가로 이러한 조직이 가능한 또한 infectable 것을 지원하는, 전직 생체내 감염 조직에서 감지 수있다는 것을 보여줍니다. 증가 transgene 표현은 일반적으로 바이러스 복제와 관련이 있지만, 그것은 반드시 치료 활동에 중요한 것으로 생각됩니다 자기 증폭과 확산에 연결 생산적인 바이러스 라이프 사이클으로 간주되지 않습니다. 이러한 이유로, 그것은 더 많은 바이러스가 처음 조직을 감염하는 데 사용했던 것보다 생산 여부를 확인하는 것이 필요합니다. 그림 2B는 플라크의 분석에 의해 바이러스 부량에 따라 더 많은 바이러스가 조직 바로 다음 감염 후 수집된 72시간 감염 후 얻은 것을 보여줍니다. 전반적으로, 이러한 데이터는 수술 excised 종양 조직은 시간이 바이러스 복제가 지원하는 수있는 동안, 적어도 72 시간 동안 세포 배양에서 가능한 남아있을 수 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 조직의 개요 샘플링 / 프로토콜을 sectioning. 조직 샘플은 이후 무작위 웰스 A1 - A4로 배포됩니다 사분의 사 나누어 여러 가지 2mm 코어를 제거하여 처리됩니다. 색상 코드는 각 우물에 사용되는 시약을 나타냅니다. 우물 안에 회색 음영 광장이 그려져 6 개별 코어에서 각 분기를 나타냅니다. 잘 A1의 조직은 초기 알라마 푸른 읽고 나면 미디어와 뉴 웰 (C1)로 전송됩니다. 두 번째 읽기는 바이러스와 함께 72 시간 보육의 끝에 이루어집니다. 웰스 A4와 B4는 72 시간 배양 후 감염 후 Luciferin과 보충 아르 <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 생존과 환자의 조직 샘플 infectability. 이시간에서 알라마 푸른 신호를 72 시간 우편 수집에 의해 측정 등) 조직 생존. Y - 축은 빈이 알라마 푸른 신호를 수정 나타냅니다. B) 우두 바이러스의 Titer조직 샘플 2 72시간 후 감염. C 쿠매시의 얼룩. D 다음 U2OS 세포에 우두 바이러스 plaques의) 예) 환자 VV - 루시페라제에 감염된 조직에서 얻은 발광 신호의 g 당 수집 IVIS를 사용하여 몇 군데. E)은 형광 현미경 사진이 VV - GFP에 감염된 환자의 조직 샘플의.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 신선한 조직 샘플을 얻는 것입니다. 샘플이 부적 절한 미디어 (예 : PBS)에 수술실에서 오래 기다려야 다음 세포 배양에 투입하는 경우,이 조직 생존을 손상시키고 해당 infectability 않도록 할 수 있습니다. 음표의 정상 조직은 본질적으로 더 이상의 종양 조직이 효과를하는 경향이있다. 또 하나 중요한 포인트는 조직과 크기의 일관성을 샘플하는 데 사용되는 몇 코어입니다. 이러한 조직 hypoxia와 infectectable 표면과 같은 요인은 코어와 코어 쿼터스의 크기에 따라 변동하기 때문에 크기 불일치는 환자 샘플을 통해 변화를 가져올 것입니다. 이것은 부분적으로 조직 슬라 이서를 사용하여 해결될 수 있지만, 여기서 제시하는 방법 중 하나 장점은 쉽게 의무가 없습니다 소프트 또는 점성 조직을 포함하여, 그것이 비교적 쉽게되어 오염이 적은 경향이, 그리고 조직 유형의 다양한 널리 적용 조직도 깔끔히 수 있습니다. 특히, 코어의 숫자는 더 나은 조직 표현을하기 위해 증가 수 있습니다. 또한, 코어는 같은 DNA, RNA 또는 단백질 추출과 같은 병렬로 할 수있는 다른 잠재적인 assays을 수용하기 위해 더 많은 조각 (예 : 5-8)로 잘라 수 있습니다. 그러나, 코어가 재현할 크기로 잘라 수있는 조각의 수가 다른 크기 corers를 사용하여 수정할 수있는 코어의 실제 크기에 따라 달라집니다. 선택, reproducibly 크기의 조직 조각을 얻을 수 있도록 한 방법은 작은 조각으로 그들을 subdividing 추가하기 전에 통치자를 사용하여 코어의 길이를 더하는 것입니다. 프로토콜은 자연스럽게 다른 바이러스를 수용하도록 수정할 수 있습니다 우리는 조직이 가능한하고 최대 6 일 동안 복제를 지원할 수 것으로 나타났습니다. 프로토콜은 더욱 cytrokines 등 다른 virally - 표현 transgenes 측정하도록 확장할 수 있습니다. 다음 감염은 조직도 더욱 조직의 조직학 더욱 세련 가능하며 방법은 바이러스 감염에 관한 10-12 immunohistochemical 방법에 의해 sectioning 및 얼룩을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 높은 포도당 DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> NorthBio 주식 회사 </td><td> NBSF - 701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin B 솔루션 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A2942 </td><td> 0.1 %에서 사용 </td></tr><tr><td> Pennicilin - 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P4333 </td><td> 1 % 사용 </td></tr><tr><td> 알라마 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D - Luciferin의 칼륨 염 </td><td> 분자 이미징 제품 </td><td> D - Luciferin 칼륨 소금 1g </td><td> 0.22 μm의 필터 10 MG / ML 및 필터에서 PBS에 Resuspend </td></tr><tr><td> 멤 분말 </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> 사용하기 전에 필터를 0.22 μm의에 2X 멤 및 필터를 만들 절반 제안 볼륨에서 확인 </td></tr><tr><td> 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> C9481 </td><td> 탈이온수과 압력솥의 3 % 솔루션을 확인하십시오. 가루가 resuspend에 다소 시간이 걸릴 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 쿠매시 블리언트 블루 R </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2mm 생검 펀치 </td><td> Miltex </td><td> MX - 33-31 </td><td></td></tr><tr><td> 더블 에지 준비 블레이드 </td><td> 퍼슨나 의료 </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 disection </td><td> Leica </td><td> 모델 M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> 생체내 이미징 시스템 (IVIS)에서 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td> IVIS ® 200 시리즈 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 Tearor </td><td> Biospec 제품 </td><td> 모델 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 vivo 감염

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic 바이러스 (OVs)는 선택의 복제 및 종양 세포 1을 죽일 소설 치료제입니다. HSV, Reovirus, 그리고 암 치료로 우두의 OVs 포함한 oncolytic 다양한 플랫폼의 효과를 평가하는 몇 가지 임상 실험이 현재 진행 2~5아르. oncolytic 바이러스 중 하나는 주요 특성들은 유전이 가능한 현미경이나 생체 발광 이미징 6,7하여 조직의 감염을 시각화 수 있습니다 기자 transgenes을 표현하는 수정할 수있다는 것입니다. 그것이 성공 oncolytic virotherapy 8 가능성을 확인하기 위해서는 이전 치료 환자의 생체내 전에서 조직을 감염시킬 수 있기 때문에 이것은 독특한 장점을 제공합니다. 이를 위해서는 적절하게 조직 이질에 대한 보상 및 감염 9 특히 전에 조직 생존을 평가하기 위해 조직을 샘플하는 것이 중요합니다. oncolytic 플랫폼에서뿐만 아니라 불임 생산 감염 구별하기 위해서는 균질에 따라 조직의 직접 적정하여 표현하는 경우 기자 transgenes를 사용하여 바이러스 복제를 수행하는 것도 중요하다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 문제를 해결할 수 있으며, 본 1 설명합니다. 세포 배양 2 종양 조직의 샘플링 및 준비. 신진 대사 염료 알라마 블루 3. GFP 또는 반딧불 루시페라제 4 중 하나를 표현하는 우두 바이러스와 교양 조직의 전 생체내 감염을 사용하여 조직 생존의 평가. 형광 현미경 또는 생체내 이미징 시스템 (IVIS) 5에서를 사용하여 transgene 표현의 검색. 플라크의 분석에 의해 바이러스의 부량. 이 포괄적인 방법은 조직 처리의 용이성, 조직 이질에 대한 보상, 조직 생존의 제어 및 불임 감염 및 뼈 진지하게 바이러스성 복제 사이의 차별 등 여러 가지 장점을 제공합니다.

Oncolytic 바이러스는 암 치료제에 대한 약속입니다. 치료하기 전에 환자에서 얻은 살아있는 조직의 표본의 infectability을 확인하는 기능이 치료 접근의 독특한 장점이라고 생각합니다. 이 프로토콜은을 위해 조직을 처리하는 방법에 대해 설명합니다<em&gt; 예 생체내</emoncolytic 바이러스 및 후속 바이러스 부량과 함께&gt; 감염.

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

종양용해바이러스(Oncolytic Viruses, OVs)는 종양 세포 내에서 선택적으로 복제되어 이를 사멸시키는 새로운 치료제입니다1. 그 효능을 평가하는 여러 임상 시험...

다음 실험의 전체적인 목표는 수술 후 얻은 신선한 조직 내에서 항암 백시니아 바이러스의 복제를 관찰하는 것입니다. 이는 조직의 불균질성으로 인한 편향을 최소화하기 위해 세포 배양용 조직 샘플링을 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로 조직의 생존능을 평가하며, 이를 통해 바이러스 감염 전 시작 물질의 품질을 확인합니다.다음으로 바이러스 트렌드의 유전자 발현을 모니터링하고 바이러스 역가를 측정합니다. 살아있는 수술 표본이 생산적인 백시니아 감염을 지원할 수 있는지 평가하기 위해, 형광 단백질 또는 생물 발광 리포터 발현의 관찰 및 시간에 따른 바이러스 역가의 증가를 바탕으로 조직 내 백시니아 복제 결과를 얻습니다.안녕하세요, 저는 Jean Simone Diallo입니다. 이 기술의 영향은 암 치료로 확장될 수 있는데, 이는 항암 바이러스를 이용한 치료에 적합한 환자를 식별하는 것으로 이어질 수 있기 때문입니다. 그리고 저는 Naomi입니다.이 방법은 종양 용해성 백시니아 바이러스를 이용한 종양 조직의 감염 능력을 파악하는 데 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 소수 수정 과정을 거치면 수포성 구내염 바이러스와 같은 다른 종양 용해성 바이러스뿐만 아니라 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 리오 바이러스와 같은 다른 바이러스에도 적용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Dominic입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 조직을 재현성 있게 코어링하기 어렵고, 코어된 조직을 작고 균일한 조각으로 자르는 것이 까다로울 수 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 John Bell입니다. 오늘 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 유능한 대학원생 두 명인 Naomi DeSilva와 Dominic Wa입니다. 그리고 Ottawa Hospital의 외과 레지던트인 Derek Butterwick가 이들을 도울 것입니다. 층류 세포 배양 후드(lamina flow cell culturehood)에서 작업하십시오. 2 mm 생검 펀치를 사용하여 조직 샘플의 다양한 부위에서 조직 코어를 얻으십시오.포셉을 사용하여 필요시 샘플의 위치를 조정하며, 피펫의 도움을 받아 PBS가 담긴 뒤집힌 페트리 접시 뚜껑에 각 코어를 배치합니다. 각 코어 사이의 간격을 충분히 두어 수평축을 따라 쉽게 절단할 수 있도록 합니다. 멸균된 면도날을 사용하여 각 조직 코어를 균등하게 4등분합니다.그런 다음 피펫 팁을 사용하여 각 4분할된 조각을 2 mL의 배지가 담긴 24웰 플레이트의 서로 다른 4개 웰에 각각 넣습니다. 두 번째 코어의 각 4분할 조각에 대해서도 동일하게 반복하여 24웰 플레이트의 동일한 4개 웰에 넣습니다. 모든 조직 코어가 플레이팅될 때까지 이 과정을 계속합니다.모든 조직 샘플 코어를 웰에 넣은 후, 조직이 포함된 웰 중 하나와 대조군 웰에 alamar blue 25 µL를 첨가하고 5% CO2가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 최소 1시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면, alamar blue 처리된 각 웰에서 100 µL씩 3개의 분주액을 취해 96-웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다. 동일한 웰에서 100 µL씩 2개의 분주액을 더 취해 이 과정을 반복합니다.형광 플레이트 리더를 사용하여 alamar blue 신호를 읽고 데이터를 기록하십시오. 피펫 팁을 사용하여 alamar blue 처리된 웰에서 각 조직 조각을 깨끗한 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 웰로 옮기십시오. 샘플과 함께 많은 양의 배지가 옮겨지지 않도록 주의하십시오.다음으로, 조직이 포함된 웰 중 하나에 25 µL의 배지로 희석한 6 PFU의 GFP 발현 백시니아 바이러스를 감염시킵니다. 이어서 다른 웰에 6 PFU의 루시페레이스 발현 백시니아 바이러스를 감염시킵니다. 감염 72시간 후까지 5% CO2가 공급되는 37 °C 습윤 배양기에서 플레이트를 배양합니다.이전에 분석한 샘플에 alamar blue 25 µL를 첨가하십시오. 5% carbon dioxide가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 1시간 동안 배양하십시오. 그 후 100 µL 샘플 3개를 취해 이전과 동일하게 형광 플레이트 리더로 분석하십시오.먼저 GFP를 발현하는 백시니아 바이러스를 처리한 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 웰 내에서 PBS로 두 번 세척합니다. 그 다음, 형광 관찰이 가능한 해부 현미경을 사용하여 40배의 적절한 배율로 조직 조각의 위상차 영상을 촬영합니다.다음으로, 형광 모드로 전환하고 GFP 검출이 가능한 필터를 사용하십시오. GFP가 형질전환된 조직에서 GFP 발현을 시각화합니다. 마지막으로, 관심 있는 트랜스유전자의 파장과 가능한 한 멀리 떨어진 다른 파장의 형광 필터를 사용하십시오.그리고 배경 형광 사진을 촬영합니다. 다음으로, 피펫 팁을 사용하여 조직 조각들을 수집하십시오. 조직의 무게를 측정합니다.이 측정값은 실험 종료 시 g당 형성 단위(forming units per gram)로 바이러스 역가를 계산하는 데 사용됩니다. 향후 역가 측정을 위해 조직을 -80 °C에서 보관하십시오. 루시퍼레이즈를 발현하는 백시니아 바이러스로 형질도입한 웰과 조직 배양액만 포함된 웰에 10 mg/mL 루시퍼린 기질 5 µL를 피펫으로 분주하십시오. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.플레이트를 in vivo 이미징 시스템에 넣고 노출 시간을 5초로 설정합니다. 루시퍼레이즈(luciferase)를 발현하는 백시니아 바이러스가 도입된 웰의 사진을 찍습니다. 이미지가 포화된 것으로 보이면 노출 시간을 더 짧게 하여 절차를 반복하고, 신호가 관찰되지 않으면 노출 시간을 더 길게 설정합니다.웰당 1백만 개의 살아있는 U2 OS 세포가 포함된 6-웰 플레이트를 완전 배지로 준비하고, 37 °C, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 다음 날 웰의 합류도가 95%에 도달하게 합니다. 이전에 무게를 측정한 감염된 조직 샘플을 가져옵니다. 샘플을 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 원심분리 튜브로 옮기고 1 mL의 PBS를 추가합니다.조직 균질기를 사용하여 조직을 균질화하고 바이러스 입자를 방출시킵니다. 그다음, 조직 균질화 바이러스 현탁액 100 µL를 무혈청 배지 900 µL에 옮기고 필요한 만큼 이 과정을 반복하여, 무혈청 배지 내에서 조직 균질화 바이러스 현탁액의 10배 연속 희석액을 제조합니다. 그런 다음 U2 OS 세포가 포함된 6-웰 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다.각 계열 희석액 500 microliters를 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 1시간 동안 되돌려 놓으며, 세포가 배양되는 동안 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 15분마다 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다. 20% FBS가 포함된 2배 농도의 DMEM 병과 3% CMC 용액의 분취액을 37 degree 항온수조에서 가온합니다. 가온이 완료되면 3% CMC와 2배 농도의 DMEM 및 20% FBS를 1:1 비율로 혼합하여 최종 농도가 1.5% CMC 및 10% FBS가 되도록 합니다.배양 후, U2 OS 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고 웰당 2 mL의 1.5% CMC 10% F-B-S-D-M-E-M 혼합액으로 교체한 뒤, 조직 배양 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 추가 배양합니다. 48시간 후, 각 웰의 CMC 배지 혼합액에 2 mL의 메탄올 아세트산 고정액을 첨가하고, 조직 배양 후드 내의 상온에서 10분 동안 플레이트를 고정합니다.배양 시간이 경과하면, 각 웰에서 용액을 흡입하여 제거하십시오. 각 웰을 수돗물로 충분히 헹구어 남아 있는 고정액을 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 kumasi blue 용액 2 mL를 피펫으로 분주하십시오.그 다음 플레이트를 진탕 플랫폼 위에 올리고 저속으로 흔들며 상온에서 30분 동안 배양한 후, 웰에서 쿠마시 블루(kumasi blue) 용액을 흡입하여 제거하고 수돗물로 헹굽니다. 덮개를 열어둔 플레이트를 후드 내에서 약 1시간 동안 건조시킵니다. 플라크 수가 10개에서 100개 사이로 관찰되는 희석 단계에서 바이러스 플라크 수를 측정합니다.계수된 플라크 수에 희석 배수를 곱한 다음, 그 결과값에 2를 곱하여 밀리리터당 플라크 형성 단위(plaque forming units per milliliter)로 역가를 산출합니다. 또한, 이 수치를 샘플의 초기 측정 무게로 나누어 그램당 플라크 형성 단위(plaque forming units per gram)로 보고합니다. 이 그래프는 수집 후 2시간과 72시간 시점에서 Alamar Blue의 신호 강도로 측정한 조직 생존력을 보여주며, 정상 조직과 종양 조직 모두 최소 72시간 동안 대사적으로 활성 상태를 유지할 수 있음을 나타냅니다.이 대표 데이터는 감염 후 2시간과 72시간에 조직 샘플 g당 수집된 백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 역가가 더 높음을 보여줍니다. 이는 바이러스가 자체 증식 및 확산으로 이어지는 생산적인 바이러스 생명 주기를 거치고 있음을 나타냅니다. 이 이미지는 환자 유래 백시니아 바이러스에서 얻은 전형적인 발광 신호를 보여줍니다.생체 내 이미징 시스템(in vivo imaging system)을 사용하여 촬영한 루시페라아제(Luciferase) 감염 조직 샘플입니다. 오른쪽의 발광 척도 막대에 따라 강한 발광 부위는 빨간색으로 나타납니다. 위상차 현미경 이미지와 GFP 채널 형광 현미경 이미지를 비교하면 백시니아 바이러스(vaccinia virus) GFP에 의해 형질전환된 조직의 비율을 확인할 수 있습니다. 빨간색 채널에서 신호가 나타나지 않는 것은 형광 신호의 특이성을 나타냅니다.이 절차를 수행할 때는 반드시 신선한 조직을 사용하고, 절차에 따라 가능한 한 조직의 대표 영역을 샘플링하는 것이 중요합니다. 바이러스가 구체적으로 어떤 조직 구조를 감염시키는지, 그리고 바이러스가 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 타이터링(tittering) 대신 조직 고정 면역 조직 화학 염색, DNA 또는 RNA 추출과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, vaccinia virus를 이용한 ex vivo 감염을 위해 샘플을 처리하는 방법과 GFP 또는 Luciferase 트랜스진(transgene)의 발현을 통해 바이러스의 확산을 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.마지막으로, 처리된 샘플로부터 바이러스를 고농축하는 방법을 알아보겠습니다. 생바이러스를 다루는 작업은 바이러스 균주에 따라 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 적절한 층류 정화대(laminar flow) 내 작업과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서는 유전자 전달 연구와 IVIS의 bioluminescence 이미징을 사용하여 유전자 발현의 후속 분석을 위해 환자의 조직 조각의 문화에 대해 설명합니다.

환자 조직 및 유전자 전달의 시험 전의 VIVO 문화

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

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