Name: Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 배우세요 Candida albicans 바코드 돌연변이체 라이브러리를 이용한 고효율 약물-유전자 상호작용 스크리닝 방법. 이 기술은 대규모 유전체 기능 연구에 필수적인 자동화 분석 프로토콜을 제공합니다.

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우리는 론 데이비스, 아담 Deutschbauer, 그리고 토론과 조언 토론토 대학에서 전체 힙합 실험실 감사합니다. CN은 국가 인간 게놈 연구소 (부여 번호 HG000205), RO1 HG003317, CIHR 청소 - 84,305, 그리고 캐나다 암 협회 (# 020380)에서 기금에 의해 지원됩니다. JO는 스탠포드 게놈 연수 프로그램 (부여 번호 T32 HG00044 국가 인간 게놈 연구소에서)와 국립 보건원 (부여 번호 P01 GH000205)에 의해 지원되었다. GG는 DRS으로 혁신에 대한 캐나다 재단의 보조금에 의해 일부 지원 NHGRI RO1 HG003317와 캐나다 암 협회, 그랜트 # 020380, TD 및 도널리 시퀀싱 센터에 의해 지원됩니다. 브렌다 앤드류스와 잭 그린 블. AMS는 토론토 오픈 원정대의 대학에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기, 우리가 쉽게 태그 돌연변이 컬렉션을 만드는 다른 미생물의 barcoded 돌연변이 컬렉션의 기존 컬렉션의 다양한 적용할 수 있습니다, 겸손한 수정과 프로토콜을 설명했다. 우리가 병원성 효모 C.에 대한 태그 transposon의 돌연변이 유발에 대한 프로토콜을보고있을 때 우리가 그것을 강조 albicans는 매우 유사한 프로토콜은 단세포 진균류의 다양한 적응 수 있습니다. 수정이 프로토콜은 박테리아 13 잘 작동하고, 현재 추가로 곰팡이와 세균 genomes의 번호 컬렉션 공사중입니다. 현재,이 분석은 유전자 작은 분자 상호 작용에 대한 유일한 종합 게놈 차원의 편견 화면을 제공합니다. 분석 중 하나는 특히 강력한 기능은 유전자 또는 작은 분자에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다 것입니다. 이러한 assays의 범위와 능력에도 불구하고, 다른 실험실 자신의 양도는 결과의 분석을위한 초기 자본 투자 및 정보학 도구에 의해 다소 방해했습니다. 분석을위한 강력한 도구와 함께 차세대 시퀀스 판독의 채택과 함께, 우리는 그들의 채택이 증가 기대합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 항생제 </td><td> 공급 업체 및 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> 시그마, 부분 # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> 시그마, 부분 # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycin </td><td> 시그마, 부분 # S0692 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> 시그마, 부분 # C0378 </td></tr><tr><td> DNA 클린 - 업 및 농도 키트 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep 스핀 Miniprep 키트 </td><td> Qiagen, 부분 # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed​​ 플라스미드 맥시 키트 </td><td> Qiagen, 부분 # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR의 정제 키트 </td><td> Qiagen, 부분 # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick 겔 추출 키트 </td><td> Qiagen, 부분 # 28704 </td></tr><tr><td> PCR과 전기 영동의 시약 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (MG - 무료) 버퍼 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs, 부분 # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynucleotide 솔루션 믹스 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs, 부분 # N0447L </td></tr><tr><td> 25 MM MgCl 2 </td><td> 시그마, 부분 # 63036 </td></tr><tr><td> 아가로 오스, 로딩 염색하고, 핵산은 겔 전기 영동에 적합 얼룩 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 10X 태 버퍼 </td><td> 시그마, 부분 # T8280 </td></tr><tr><td> 1 KB 플러스 DNA 레더 </td><td> Invitrogen, 부분 # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD 수프 </td><td></td></tr><tr><td> 효모 추출물의 10g </td><td> 시그마, 부분 # Y1625 </td></tr><tr><td> 20g Bacto 펩톤 </td><td> BD Biosciences, 부분 # 211677 </td></tr><tr><td> 덱스 트로 오스의 20g </td><td> 시그마, 부분 # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> 멀티채널 pipettes (1000, 200, 20 μL) </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 일회용 pipetting 저수지 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 15 50 ML 원심 분리기 튜브 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 96 - 및 384 자 딥 웰 플레이트 </td><td> Axygen 과학, 부분 # P - 2ML - SQ - CS &amp; P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96 - 잘하고 384 잘 PCR 플레이트 및 밀봉 필름 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 실링 멀티 잘 번호판을위한 플레이트 롤러 </td><td> 시그마, 부분 # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C와 37 ° C 접시에 박테리아와 효모 성장과 튜브에 incubators를 흔들어 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 체외 transposon 돌연변이 유발에 </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5의 Transposase </td><td> Epicentre의 Biotechnologies, 부분 # TNP92110 </td></tr><tr><td> 높은 처리량 변환 </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT 플라스미드 준비 키트 </td><td> 에지 Biosystems, 부분 # 84359 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜, 분자량 3,350 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 리튬 아세테이트 </td><td> 시그마, 부분 # 517992 </td></tr><tr><td> 무균, 접시 6 - 웰 </td><td> 코닝, 부분 # 3335 </td></tr><tr><td> 50 MG / ML 유리딘 </td><td> 시그마, 부분 # U3750 </td></tr><tr><td> 100X 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 솔루션 </td><td> 시그마, 부분 # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 연어 testis DNA </td><td> 시그마, 부분 # 1626 </td></tr><tr><td> barcoded 컬렉션의 성장 </td><td></td></tr><tr><td> 48 잘 접시, 접시의 문화를 성장하는 경우 </td><td> 그레 이너 부분 # M9437 </td></tr><tr><td> 접착제 플레이트 씰 </td><td> ABgene, 부분 # AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200 ML 문화 flasks </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 흡광도 수있는 분광 광도계 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 250 ML flasks이나 흔들림 분광 광도계를위한 온도 제어 흔드는 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 안전 잠금 Microcentrifuge 튜브, 2 ML </td><td> Eppendorf, 부분 # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> 하이브리드화 장비 </td><td></td></tr><tr><td> 하이브 리다이 제이션 오븐 640 </td><td> Affymetrix, 부분 # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip 유체 역 450 </td><td> Affymetrix, 부분 # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray 스캐너 3000 </td><td> Affymetrix, 부분 # 00-0212 </td></tr><tr><td> 플로팅 랙과 함께 끓는 물 목욕 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 하이브 리다이 제이션 소모품 </td><td></td></tr><tr><td> Genflex 태그 16K 배열 V2 </td><td> Affymetrix, 부분 # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt의 솔루션, 50X 집중 </td><td> 시그마, 부분 # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, R - phycoerythrin 공액 (SAPE) </td><td> Invitrogen, 부분 # S866 </td></tr><tr><td> 안전 잠금 Microcentrifuge 튜브, 0.5 ML </td><td> Eppendorf, 부분 # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> 작은 터프 - 명소 </td><td> 다양 생명 공학, 부분 # LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> BioRad, 부​​분 # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% 트윈 </td><td> 시그마, 부분 # T2700 </td></tr><tr><td> MES 무료 산성 일수화물 </td><td> 시그마, 부분 # M5287 </td></tr><tr><td> MES 나트륨 소금 </td><td> 시그마, 부분 # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 시그마, 부분 # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> 시그마, 부분 # S2015 </td></tr><tr><td> 분자 생물학 등급 물 </td><td> 시그마, 부분 # W4502 </td></tr><tr><td> 하이브 리다이 제이션 Primers </td><td> 다양한 공급 업체 (표준 탈염) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;비오틴 - GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;비오틴 - GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;비오틴 - CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;3 GTCGACCTGCAGCGTACG&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 3 5&#39;CTACGAGACCGACACCG &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> 시퀀싱 Primers : Illumina 플랫폼 </td><td> 다양한 공급 업체 </td></tr><tr><td> UpTag 전달 (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG GAT GTC ATC T CAC GTC TCT 개그 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag 역방향 (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT GCG ACG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC CTT GCT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CGT 전투 편대 ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag 전달 (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT GAA CCG ATC T AAC 개그 CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag 역방향 (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT GCG ACG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC CTT GCT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> 1 읽기 UP - 태그 seq 프라이머 (100uM) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG C​​GT 전투 편대 ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 DOWN 태그 seq 프라이머 (100uM)을 읽기 </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> 이 인덱스 시퀀싱 프라이머 (표준 Illumina R1 프라이머) (100uM)을 읽기 </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC CTT GCT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> 추가 시퀀싱의 시약 / 장비 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR 정화 키트 </td><td> Qiagen, 부분 # 29051 </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> 모든 공급 업체 </td></tr><tr><td> Macherey - 나겔 진공 매니폴드 </td><td> Macherey - 나겔, 부분 # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen 퀀트 - IT dsDNA BR 어세이 키트 </td><td> Invitrogen, 부분 # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit 분석 튜브 </td><td> Invitrogen, 부분 # Q32856 </td></tr><tr><td> 40 % 아크릴 아미드 플러스 1 % N, N&#39; - 메틸렌 - 비스 - 아크릴 아미드, 37.5:1 </td><td> 바이오 래드, 부분 # 161-0148 </td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시그마, 부분 # T1503 - 1KG </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> 시그마, 부분 # B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 </td><td> Teknova, 부분 # E0306 </td></tr><tr><td> 암모늄 Persulfate </td><td> 시그마, 부분 # A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, 부분 # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidium의 브로마이드 솔루션 </td><td> Bioshop, 부분 # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0.5M 질산 에틸 </td><td> Teknova, 부분 # A2000 </td></tr><tr><td> 10mM 마그네슘 아세테이트 tetrahydrate </td><td> 시그마, 부분 # M0631 - 100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 </td><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0를 참조 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 아세트산 나트륨, 산도 5.2 </td><td> Teknova, 부분 # S0297 </td></tr><tr><td> 스피드 진공 </td><td> 여러 </td></tr><tr><td> 단일 읽기 클러스터 생성 키트 </td><td> Illumina, 부분 # GD - 300-1001 </td></tr><tr><td> V4 36c 시퀀싱 키트 </td><td>Illumina, 부분 # FC - 104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE 요리법 <table border="1"><tbody><tr><td> 금액 </td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 108g </td><td> 트리스베이스 </td></tr><tr><td> 55g </td><td> 붕산 </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1L 표시 DH 2 O 추가 </td></tr></tbody></table> 12 % Polyacrylamide 젤 제조법 <table border="1"><tbody><tr><td> 볼륨 </td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 5.8 ML </td><td> 40 % 아크릴 아미드 플러스 1 % N, N&#39; - 메틸렌 - 비스 - 아크릴 아미드, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ML </td><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ML </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 μl </td><td> 10 % 질산 Persulfate </td></tr><tr><td> 총 부피 : 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> 프라이머 믹스를 Uptag : Resuspend Uptag 100 μm의에서 ddH 2 O의 Buptagkanmx4 각각 다음 50 μm의 각 최종 농도에 대해 1:1 비율로 섞는다. -20 ° C.에 저장 프라이머 믹스를 Downtag : Resuspend Dntag 및 Bdntagkanmx4 100 μm의에서 ddH 2 O에서 각 후, 50 μm의 각 최종 농도에 대해 1:1 비율로 섞는다. -20 ° C.에 저장 혼합 oligonucleotides : 100 μm의에서 ddH 2 O에 다음과 같은 여덟 oligos (표준 desalted)의 각 Resuspend : Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. 12.5 μm의 각 최종 농도에 대한 8 oligonucleotides의 동일한 음량을 섞는다. 12 배 MES 재고 : 10 ML 들어, 8 ML 분자 생물학 등급 물 0.7 g MES 무료 산성 일수화물과 1.93 g MES 나트륨 소금을 풀다. 잘 혼합 후, 산도를 확인하고 산도 6.5-6.7 필요하면 조정합니다. 10 ML의 총 볼륨에 물을 추가합니다. 소독 필터와 4 저장 ° C 빛 (예 : 포일에있는 튜브를 랩)에서 보호. 솔루션은 눈에 보이게 노란색 또는 6 개월 후이된다면 바꿉니다. 2X 하이브 리다이 제이션 버퍼 : 50 ML 들어, 12 배 MES 재고 8.3 ML (2.9.14에서), 5 M NaCl, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 % 트윈 20 0.1 ML (권 / 권)의 4.0 ML, 그리고 19.9 ML ddH 필터링의 17.7 ML를 섞어 2 O. 소독 필터. 와시 : 혼합 300 ML 20X SSPE, 1 ML 10% 트윈 (권 / 권), 699 ML ddH 2 O.을 소독 필터. 와시 B : 믹스 150 ML 20X SSPE, 1 ML 10% 트윈 (권 / 권), 849 ML ddH 2 O. 소독 필터. 바코드 시퀀싱의 primers UP - 태그 프라이머 시퀀스에서 5 &#39;꼬리 (굵게) F와 R 프라이머에 통합 Illumina 특정 어댑터 시퀀스입니다. 변수 순서 (이탤릭체)는 색인 / 멀티플렉싱 읽기 밖에서 사용하는 5 메르 색인 태그를 나타냅니다. 3 &#39;꼬리 (밑줄) uptag 바코드 측면을 노릴 일반적인 뇌관을 상징하고 효모 바코드를 증폭하기 위해 필요합니다. DOWN - 태그에 뇌관은 5 단, 3 &#39;꼬리가 (밑줄) 증폭하는 데 사용되는 일반 primers로 대체될 것이며, UP - 태그 primers (Illumina 특정 순서)의 꼬리&#39;꼬리가 5 동일 &#39;시퀀스 DOWN을 태그는 바코드.

barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

차세대 시퀀싱 기술의 진보 미덕으로, 우리는 거의 매일 새로운 게놈 시퀀스에 액세스할 수 있습니다. 이러한 발전의 템포는보다 깊이와 폭이 약속, 가속됩니다. 이러한 놀라운 발전에 비추어, 유전자 기능을 정의하기 위해 고속, 병렬 방법에 대한 필요성이 점점 중요 해지고 있습니다. 효모와 E.의 게놈 전체 삭제 돌연변이의 컬렉션 대장균은 유전자 기능의 기능 특성에 대한 workhorses 역임 있지만,이 접근법은 확장성 아니라, 현재의 유전자 삭제 방법은 삭제하고 확인하는 게놈을 구성하는 유전자의 수천의 각 필요합니다. 이 작업이 완료 후에 우리는 높은 처리량 phenotyping을 추구하실 수 있습니다. 지난 10 년간 우리 연구실 경쟁, 소형, 높은 처리량 게놈 - 와이드 병렬로 수행할 수 있습니다 assays의 포트폴리오를 정제하고 있습니다. 이 parallelization은 바코드가 돌연변이에 대한 프록시 역할을 함께하기 때문에 DNA &#39;태그&#39;또는 각각의 돌연변이에 &#39;바코드&#39;의 포함 가능한이며 하나는 돌연변이 적합성을 평가하기위한 바코드 풍부한을 측정할 수 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 DNA 시퀀스 및 barcoded 돌연변이 컬렉션 사이의 간격을 채우기 위해 추구합니다. 이를 위해 우리는 새로 합성 최대 병렬 바코드 assays를 열고 있지만, 제대로 미생물 특징 결합 transposon 중단 - barcoding 방식을 소개합니다. 이 접근법을 설명하기 위해 우리는 새로운 캔디다 albicans barcoded 중단 수집을 제시하고 모두 microarray 기반 및 차세대 시퀀싱 기반 플랫폼이 10,000 수집하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명 - 단일 실험에서 1,000,000 유전자 - 유전자 및 약물 - 유전자 상호 작용합니다.

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

차세대 염기서열 분석 기술의 발전 덕분에, 우리는 거의 매일 새로운 게놈 서열을 확보하고 있습니다. 이러한 발전 속도는...

다음 실험의 전반적인 목표는 전유전체 바코드 미생물 라이브러리를 사용하여 유전자-약물 및 유전자-환경 상호작용을 고도로 병렬적인 방식으로 이해하는 것입니다. 이는 로봇 시스템을 이용하여 세포를 대수 성장기에 유지하면서, 약물이 존재하는 환경에서 미생물 라이브러리를 5세대에서 20세대까지 배양하여 스크리닝함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 세포를 수집하며, 이를 통해 4,000개에서 6,000개 개체의 게놈 DNA를 동시에 추출할 수 있습니다.증폭된 바코드를 포함하는 다음 PCR 산물은 마이크로어레이 하이브리드화 또는 바코드 시퀀싱을 사용하여 정량화하며, 이를 통해 각 바코드를 정량화함으로써 복합 풀 내 각 균주의 풍부도를 결정합니다. 최종적으로, 어떤 바코드 변이주가 처리에 민감하여 실험 과정 동안 풀에서 고갈되는지를 보여주는 결과가 얻어집니다. 오늘 살펴볼 기술의 주요 장점은, 균주를 플레이트 위의 콜로니나 개별 액체 배양물 형태로 개별적으로 다루는 대신, 수만에서 수십만 개의 서로 다른 균주를 한 번에 추출하여 하나의 단일 풀로 분석할 수 있다는 점입니다.이 분석법의 효용성을 확인한 후 저희는 이를 자동화할 필요가 있었으며, 다행히 제가 Stanford Genome Technology center에서 근무하며 주변의 엔지니어들로부터 도움을 받아 이를 달성할 수 있었습니다. 오늘 프로토콜 시연은 저희 실험실의 박사 과정 수료생인 Andrew Smith가 모든 프로토콜과 관련 절차를 안내할 예정이며, Tanya Durick가 프로토콜의 시퀀싱 단계를 어떻게 수행하는지 보여줄 것입니다. 이 프로토콜은 전이인자 돌연변이 유발(transposon mutagenesis)을 통해 생성된 Candida albicans 돌연변이 라이브러리를 활용하며, 각 돌연변이는 개별 돌연변이들을 하나의 풀로 결합하기 위한 바코드 태그를 가지고 있습니다. 라이브러리의 복사본은 3개의 84-well 플레이트에 복제됩니다.배지가 포함된 웰 플레이트에서 콜로니를 30 °C로 2~3일 동안 최대 크기에 도달할 때까지 배양합니다. 그 다음, 화염 멸균 및 멸균된 실험 기구를 갖춘 미생물 실험 환경에서 각 트레이에 5~10 mL의 배지를 충분히 붓고 5분 동안 담가둡니다. 셀 스프레더를 사용하여 콜로니를 재현탁하고, 세포가 포함된 액체를 50 mL 원추형 원심분리 튜브에 붓습니다.7% DMSO를 추가합니다. 7% DMSO가 포함된 배지를 사용하여 세포의 최종 OD 600 농도를 mL당 50으로 조정합니다. 그 후 PCR 스트립 튜브에 40 µL씩 분주하며, 분주된 세포 시료는 -80 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 얼음 위에서 분주된 세포 시료를 해동한 후, 선택한 약물이나 조건이 포함된 배지에 시료를 즉시 부드럽게 희석하여 48웰 플레이트의 웰당 총 부피 700 µL 내에서 OD 600이 0.0625가 되도록 접종합니다. 본 영상에서는 두 가지 조건에 대해 세 번 반복 실험(triplicate)을 준비합니다.플레이트에 적절한 용매 대조군을 최소 하나 이상 포함하십시오. 플레이트를 플라스틱 플레이트 씰로 밀봉하고, 분광광도계 또는 온도 조절 쉐이커를 사용하여 30 °C에서 실험적으로 결정된 교반 일정에 따라 세포를 배양하십시오. 예를 들어, 14분 동안 교반하고 1분 동안 웰을 판독한 후 다시 교반을 재개하십시오.세포 현탁액의 일부를 로봇이 수확하여 로봇 데크의 냉각 플레이트에 보관할 수 있습니다. 사용자가 정의한 세대 시간점, 일반적으로 5, 10, 15 및 20세대 성장 시점에서 수행합니다. 각 샘플과 시간점당 최소 od 600 2 이상의 세포를 수확하십시오.수확한 세포 샘플을 세이프락 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 세포들은 이후 genomic DNA 추출에 사용할 수 있으며, 이 절차를 시작하기 위한 방법이 다음에 안내됩니다. yeast star kit를 사용하여 다양한 시점에서 수확한 세포로부터 정제된 genomic DNA입니다.제조사의 지침에 따라 한 가지 수정 사항을 적용하여, DNA를 300 µL의 0.1 XTE로 용출합니다. 다음으로, 각 샘플에 대해 UPT 태그용과 down 태그용으로 각각 하나씩, 총 두 건의 PCR 반응을 준비합니다.결과 PCR 산물을 젤에서 확인합니다. 레인 1과 3에 표시된 것처럼 하이브리드화에 사용되는 앰플리콘의 경우, 두 PCR 모두에서 60 base pair 산물이 생성될 것으로 예상됩니다. 본 예시에서는 레인 5와 7에 표시된 바코드 시퀀싱용 앰플리콘의 경우 130 base pair 산물이 생성될 것으로 예상됩니다.이 단계에서, 생성된 PCR 산물의 종류에 따라 마이크로어레이 분석이나 직접 바코드 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 마이크로어레이 분석을 준비하려면, 하이브리다이제이션 오븐의 온도를 42 °C로 예열하고, 끓는 물 중탕기와 얼음물 슬러리가 담긴 아이스 버킷을 준비합니다. 1x 하이브리다이제이션 버퍼(hybridization Buffer) 120 µL를 천천히 채워 어레이를 미리 적셔 둡니다.어레이를 하이브리다이제이션 버퍼 내에서 42 °C, 20 RPM으로 10분간 배양합니다. 어레이가 배양되는 동안, 락 탑(lock top) 0.5 mL 튜브에 하이브리다이제이션 버퍼 120 µL를 분주하여 준비합니다. 샘플당 하나씩, 그리고 버퍼용으로 하나를 추가로 준비하여 각 튜브에 혼합합니다. 하이브리다이제이션 혼합물에 uptake PCR 30 µL와 down tag PCR 30 µL를 첨가하여 총 부피를 150 µL로 맞춥니다.2분 동안 끓인 후 최소 2분 동안 얼음물에 담가 둡니다. 사용 전 튜브를 짧게 원심 분리합니다. 어레이에서 pre hybridization buffer를 제거하고 증발을 막기 위해 120 µL의 hybridization PCR mix를 첨가합니다.어레이 가스켓을 터프 스팟으로 덮고, 42 °C에서 20 RPM으로 16시간 동안 하이브리드화합니다. 하이브리드화 오븐에서 어레이를 꺼내고 칩에서 터프 스팟을 제거합니다. 피펫을 사용하여 어레이에서 하이브리드화 혼합물을 천천히 제거하고 어레이를 채웁니다.Wash A 120 µL를 사용하여 프라이밍된 유체 스테이션의 세척기에 어레이를 로드하십시오. 어레이는 gene Flex SV 3 4 50 프로토콜을 사용하여 세척하되, 다음과 같이 수정하여 진행합니다. 염색 전 Wash A를 사용하는 단계를 한 번 더 추가하십시오.Wash B의 온도를 40 °C 대신 42 °C로 설정하고, 유체 스테이션에서의 염색 온도를 25 °C 대신 42 °C로 설정합니다. 유체 작동 후, 유체 스테이션을 실행하고 four 50 프로토콜을 종료합니다. 기포가 없는 것을 확인한 후 세척기를 언로드합니다.어레이를 스캐너에 넣고 560 nanometers의 방출 파장에서 스캔합니다. 130 base pair PCR 산물은 차세대 바코드 시퀀싱에 사용되는데, 이를 수행하기 위해 먼저 12% page gel에서 12개의 pool DNA 샘플을 분리합니다. 다음으로, gel을 cyber green으로 염색하고 관심 있는 gel 밴드를 절단하여 회수합니다.겔에서 추출한 DNA는 realtime PCR로 정량화한 다음, CBOT 및 single read cluster generation kit를 사용하여 단일 리드 플로우 셀(flow cell) 상에 클러스터를 생성합니다. 플로우 셀을 시퀀서에 로드하고 첫 번째 염기가 검출되는 것을 확인합니다. 여기에 표시된 시퀀서는 프로토콜의 특정 시점에서 수집된 데이터를 나타내는 대표적인 장비입니다.태그가 지정된 돌연변이 풀을 항진균제인 clotrimazole이 포함된 배지와 대조군인 DMSO에서 20세대 동안 배양하였으며, 각 유전자에 대해 log two ratio를 계산하여 도식화하였습니다. log two ratio가 2 이상으로 clotrimazole 처리에 유의미하게 민감한 모든 균주들은 빨간색으로 표시되었습니다. 이 예시에서는 NCP 1, ERG 2, 그리고 ERG 11의 독립적인 두 대립유전자를 포함한 총 4개의 균주가 제시되었습니다.풀드 스크리닝(pooled screen)에서 항진균제 clotrimazole의 알려진 단백질 표적에 대해 감수성이 있는 것으로 검출된 균주들은, 동일한 농도의 약물이 존재하는 개별 성장 분석을 통해 그 감수성을 검증해야 합니다. 다음 그래프는 이에 대한 확인 실험 결과를 보여줍니다. 스크리닝에서 검출된 4가지 균주는 야생형 모균주에 비해 성장이 감소했습니다.BWP 17은 검은색으로 표시되었습니다. 이러한 개별 성장 곡선은 풀링된 유전자 약물 스크리닝의 중요한 특징을 강조하는데, 이는 특정 균주의 절대적인 순위가 반드시 그 균주의 정확한 민감도 수준을 반영하는 것은 아니라는 점입니다. 또한, 결과는 각 유전자에 대해 여러 대립유전자를 보유하는 것의 가치를 보여줍니다.본 사례에서, 두 ERG 11 결손 돌연변이체는 약물에 대해 약간 다른 민감도를 보입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 스크리닝 접종부터 데이터 분석까지 5일 만에 완료할 수 있습니다. 따라서 개별 실험 하나하나가 생물학적으로 유의미한 결과를 제공하지만, 진정한 가치는 수많은 실험을 수행하여 유전자 기능과 약물 작용을 예측할 수 있는 수준의 데이터베이스를 구축했을 때 나타납니다.이 영상을 시청하신 후에는 풀 스크리닝을 위한 게놈 전반의 바코드 돌연변이 컬렉션을 준비하는 방법과, 개발 후 마이크로어레이 또는 시퀀싱을 사용하여 관심 유전자를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 통해 기능 유전체학 분야의 연구자들은 효모 게놈에 존재하는 6,000개의 서로 다른 유전자 각각의 기능을 탐구할 수 있게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

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