단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

이 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 초파리(drosophila) 또는 매티아(matia)를 해부하고 이미징하여 신경퇴행 모델에서의 세포 내 사건을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 초파리의 머리를 몸통에서 분리하고 절개함으로써 수행됩니다.

다음으로 머리 내부에서 뇌와 기타 조직을 제거합니다. 그런 다음 큐티클을 제거하고 각 망막을 절반으로 자릅니다. 절차의 마지막 단계는 텅스텐 바늘로 O를 깎아내어 슬라이드 위에 올리는 것입니다.

최종적으로, 형광 공초점 현미경을 통해 세포질의 자가포식 소기관을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지금까지 유전적 통찰만을 제공할 수 있었던 신경퇴행성 질환의 초파리 모델에서 고해상도 세포 생물학적 분석을 가능하게 하여, 해당 절차가 가변적임을 입증한다는 점입니다. 본 실험실의 대학원생이 센터의 조직학 및 현미경 기술자인 Daniel Mackay의 도움을 받아 수행하였습니다.

먼저 3구 유리 슬라이드의 웰 하나에 인산완충생리식염수를 채운 다음, 이산화탄소로 초파리를 마취시킵니다. 초파리가 마취되면 핀셋을 사용하여 초파리 한 마리를 집어 PBS가 담긴 작은 접시에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 핀셋으로 주둥이를 잡고, 목 부분을 절단하여 몸체에서 머리를 분리합니다.

두 번째 핀셋으로 파리 머리의 probos 부분을 잡고, 마이크로 가위를 사용하여 외측 정중면을 따라 머리를 절반으로 자릅니다. 뇌를 노출시키기 위해, 절단된 피펫 팁을 사용하여 머리를 들어 올려 retina에 부착시킨 후 Schneider medium이 채워진 다른 웰로 옮깁니다. 핀셋으로 머리 큐티클의 대부분을 벗겨낸 다음, 뇌를 분리합니다.

망막이 층판과 각막 사이에 샌드위치처럼 유지되도록 합니다. 다음으로, 망막을 50 µL의 신선한 Schneider 배지가 담긴 방울로 옮깁니다. 유리 슬라이드 위에 직접 놓인 망막의 가장 등쪽(dorsal) 또는 배쪽(ventral) 끝부분을 마이크로 가위와 핀셋을 사용하여 잡습니다.

망막의 배측-복측 중앙선을 따라 절반으로 절단하여 눈 중앙의 AMIA를 노출시킵니다. 각막이 아래를 향하고 엽(lamina)이 위를 향하도록 망막을 계속 잡습니다. 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 먼저 oia를 엽에서 분리한 다음, 각막에서 분리합니다.

개별 OIA 및 OIA 그룹은 웰 또는 슬라이드 바닥에 모이게 됩니다. 계속 진행하기 전에 모여 있을 수 있는 더 큰 파편들을 제거하십시오. 오토파지를 분석하려면 LysoTracker를 Schneider 배지 한 방울에 1:1000 비율로 희석하고 10초 동안 기다리십시오.

슬라이드에서 과잉 액체를 제거합니다. 이때 AMIA는 그대로 남도록 주의하십시오. AMIA를 덮을 수 있도록 vector shield를 한 방울 떨어뜨립니다.

커버 글라스를 덮고 매니큐어로 밀봉한 후 공초점 현미경을 사용하여 관찰하면, atropin 돌연변이 형태를 발현하는 파리의 개별 테디움(tedium)에서 GFP-ATG8로 표지된 자가포식소체와 LysoTracker로 표지된 리소좀을 동시에 시각화할 수 있습니다. 우측 상단의 명시야 패널은 거의 온전한 테디움의 구조를 보여주며, 프레임은 스캔 영역을 나타냅니다. 여기서 빨간색은 리소좀을, 녹색은 자가포식소체를 나타냅니다.

두 소기관의 융합으로 인해 생성된 오토리소좀(autolysosomes)은 노란색으로 나타납니다. 이 절차 이후에, 서로 다른 유전적 배경을 가진 신경세포의 오토파지 표지에 영향을 미치는 효과적인 화합물과 같이 다양한 질문에 답하기 위해 시료 배양 및 약물 투여와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

초파리 유전학의 장점과 세포 배양에서 가능한 고급 세포 생물학적 분석법을 결합합니다.