Name: 단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 학습하세요 Drosophila 단일 소눈을 해부하고 이미징하여 신경퇴행 모델에서 세포내 사건을 연구하는 방법을. 이 기술은 고해상도 세포생물학 분석과 약물 처리가 가능한 1차 신경세포 배양을 제공합니다.

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우리는 토론을위한 버나드 Charroux 감사합니다. 이 작품은 KCL 의생명 학교에서 후원했다.

1. Drosophila의 망막의 해부 <ol><li> 인산염과 함께 한 잘의 3 자 유리 슬라이드를 작성하면 (PBS 1X) 호수 버퍼, 그리고 CO 2에 의해 파리를 마취. 남성과 여성 모두가이 실험을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 파리 anesthetized되면​​ 집게를 사용하여 하나의 플라이를 선택하고 PBS의 작은 접시에 놓으십시오. </li><li> 해부 현미경, 집게와 코을 공략하고 포셉의 두 번째 세트를 사용하여 목을 severing하여 시체에서 머리를 분리합니다. </li><li> 왼쪽 / 오른쪽 정중선 두뇌를 공개 microscissors와 파리 머리를 따라 반으로, 코에서 파리 머리를 개최. </li><li> 망막을 선택하고, 슈나이더 매체로 채워진 3 - 그럼 유리 슬라이드의 잘 두 번째로 전송하는 컷 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 첫째, 벗겨 다음 머리 표피의 대부분 및 집게로 머리를 제거합니다. 라미나와 각막 사이에 끼워 넣으면 망막 보관하십시오. </li><li> 다음, 유리 슬라이드의 직접 위치 신선한 샤이더 매체의 드롭 (50 μl)로 망막을 전송. </li></ol> 2. ommatidia의 해부 <ol><li> 해부의 최종 목적 (즉시 이미지 또는 문화 여부) 및 형광 현미경 (직접 또는 거꾸로)의 광학에 따라이 단계는 현미경 슬라이드 또는 24 잘 플레이트에서 두 자리를 취할 수 있습니다. 이 부검의 최종 목적은 ommatidia은 유리 슬라이드에 직접 해부하는 것입니다. </li><li> 중 포셉와 망막의 가장 지느러미 또는 복부 끝부분을 파악. microscissors를 사용하여 안구의 중간에있는 ommatidia를 노출하는 등의 / 복부 정중선을 따라 절반 망막를 잘라. </li><li> 각막가 다운 향하게하고 라미나가 직면한 것을 같은 망막을 파악하기 위해 계속합니다. 훌륭한 텅스텐 바늘을 사용 라미나 및 각막에서 ommatidia를 분리합니다. </li><li> 싱글 ommatidia 및 ommatidia 그룹은 잘 또는 슬라이드의 하단에 수집합니다. 계속하기 전에 수집 미칠 수있는 큰 파편을 제거합니다. </li></ol> 3. 치료, 얼룩 및 이미징 <ol><li> autophagy 분석, 1:1000 슈나이더 드롭 Lysotracker (처음엔 희석 슈나이더의 1시 10분하고는 슬라이드에있는 드롭 0.5 μl 추가), 혼합 희석하고 10 초간 기다립니다. </li><li> ommatidia의 뒤에두고 신중, 슬라이드에서 여분 액체를 제거합니다. 이것은 훌륭한 젤 로딩 팁과 함께 최선을 이루어집니다. </li><li> ommatidia을 충당하기 위해 Vectashield의 ​​드롭 추가 nailpolish와 coverslip과 인감을 적용합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 프로토콜의 좋은 실행 라미나 조각하여 함께 보관하지만 훌륭하게 각막 측면에 구분된 단일 ommatidia와 ommatidia 작은 그룹의 전화 번호를 남겨주해야합니다. autophagosomes, lysosomes 및 autophagolysosomes (그림 3) 표시, GFP 및 Lysotracker : 이들은 Atg8을 시각화하기 위해이 예제에서와 같이 몇 군데 있습니다. 방법은 라이브 영상에 사용될 수 있습니다, 그러나이 경우에는 그것은 슈나이더의 매체 autofluorescence이 어려운 낮은 강도 형광 신호를 구별할 수있게 할 것이라고 언급되어야하는 것입니다. 추가 문제는 photoreceptors에 연결된 상태 안료 과립 특히 적색 채널에서 강렬한 형광진다는 것입니다. 브라이트 사진은 정품 organelles에서 그들을 구분해야 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 절개 절차의 플로우 차트는 파리 망막에서 단일 ommatidia 또는 ommatidia 작은 그룹을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 여기 간단한 프로토콜의 가능한 변화가 비행 유전자를 포함, 최대 24 시간 절개의 약물 관리 하류에 대한 해부와 얼룩이나 culturing의 상류 고령화 것을 설명합니다. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 아에서 해부를 한 ommatidium에 autophagosomes과 lysosomes의 공촛점 스캔, GMR - Gal4, UAS - Atro75QN, UAS - GFP :. : Atg8 / + 비행, 29에서 polyglutamine Atrophin 돌연변이 및 이상 12일을 표현 ° C. 브라이트 패널 (오른쪽 위)은 ommatidium의 거의 그대로 구조를 표시하고 프레임 스캔 영역을 나타냅니다. 두 organelles의 융합으로 인한 붉은 자국의 Lysosomes, 녹색 autophagosomes, 자동 lysosomes는 노란색 나타납니다. 화살촉은 autophagosomes과 lysosomes 사이를 둘 다 지속적인 퓨전 이벤트를 나타냅니다.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 단일 ommatidium의 해부은 Drosophila의 눈 모델 neurodegeneration와 같은 프로세스에 대한 깊이 세포 생물 학적 정보의 수집이 가능합니다. photoreceptor의 뉴런은 다른 뉴런보다 쉽게 접근할 수 있으며, 그 세포질은 생체내에 neurodegeneration를 정할 많은 모델 proficiently 사용되는 매우 동일한 세포에서, 특히 대형 및 소포의 역학 연구를 따라서 적합합니다. 해부의 중요한 측면은 주로 공기 또는 최대 건조에 노출 절대해야 떼어낸 조직에 수행할 수있는 능력입니다. 이 기본 기술의 확장에 대한 가능성은 파리에서 가능한 놀라운 유전 수정을 결합 기본의 연결을 문화에 조작 모든 종류의 가능한 수 있도록, 그것뿐만 아니라 neurodegeneration의 눈 모델에서 얻은 정보를 혁명 수도 있습니다 (그림 2) 아르 . neurodegeneration 연구 9 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 휴대용 CO2 디스펜서 </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> 리필도 가능 </td></tr><tr><td> 더몬트 트위터 노 5 </td><td> 과학 한천 </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3 웰 유리 슬라이드 </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 가위 </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516 - 09 </td><td></td></tr><tr><td> 슈나이더의 중간 </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker 레드 DND - 99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost 슬라이드 </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Dapi과 Vectashield </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

단일 drosophila ommatidium의 해부 및 이미징

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

과일 파리 Drosophila melanogaster는 신경 과학 연구에 귀중한 기여를했다 때문에 강력한 유전자 1 neurodegenerative 질병에 대한 모델로 널리 사용되고 있습니다. 특히 플라이 눈이 Drosophila 신경계의 가장 접근 및 생명 소모품 부분이되고, neurodegeneration 연구에 대한 선택의 기관이되었습니다. 그러나 그대로 눈의 주요 주의해야 할 점은 neurodegeneration의 이해 파라마운트 아르 등 autophagy 역학이 같은 세포 이미징 이벤트에 때문에 안료의 강렬한 autofluorescence의 어려움이다. 우리는 최근 Dentatorubro - Pallidoluysian 위축의 비행 모델 (DRPLA) 3, 4 autophagic 장애에 대한 우리의 이해에 필수적인되었습니다 단일 ommatidia 3의 해부와 문화를 사용했습니다. 우리는 지금 크게 neurodegeneration에 대한 비행 모델의 가능성을 확장시킬 수 있습니다 electrophysiological 연구 5에서 조정이 기술의 종합적인 설명 (그림 1),보고합니다. 이 방법은 이미지 subcellular 이벤트를 살하고 (그림 2) photoreceptor 세포에 효과적인 약물 관리를 모니터에 적용할 수 있습니다. 모자이크 기법 6-8와 함께 사용한 경우, 유전적으로 다른 세포의 반응은 (그림 2) 병렬로 assayed 수 있습니다.

성인의 사용에 제한 요인<em&gt; Drosophila</emneurodegeneration 및 세포 생물학을 공부&gt; 눈이 세포 프로세스의 어려운 이미지입니다. 우리는 약물 치료 및 고급 이미지의 대상이 될 수있는 진실된 - 진정한 기본의 연결을 세포 배양을 생성하는 단일 ommatidia의 절개를 설명합니다.

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

초파리 *Drosophila melanogaster*는 신경과학 연구에 매우 가치 있는 기여를 해왔으며, 신경퇴행성 질환의 모델로 널리 사용되어 왔습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 초파리(drosophila) 또는 매티아(matia)를 해부하고 이미징하여 신경퇴행 모델에서의 세포 내 사건을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 초파리의 머리를 몸통에서 분리하고 절개함으로써 수행됩니다.다음으로 머리 내부에서 뇌와 기타 조직을 제거합니다. 그런 다음 큐티클을 제거하고 각 망막을 절반으로 자릅니다. 절차의 마지막 단계는 텅스텐 바늘로 O를 깎아내어 슬라이드 위에 올리는 것입니다.최종적으로, 형광 공초점 현미경을 통해 세포질의 자가포식 소기관을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지금까지 유전적 통찰만을 제공할 수 있었던 신경퇴행성 질환의 초파리 모델에서 고해상도 세포 생물학적 분석을 가능하게 하여, 해당 절차가 가변적임을 입증한다는 점입니다. 본 실험실의 대학원생이 센터의 조직학 및 현미경 기술자인 Daniel Mackay의 도움을 받아 수행하였습니다.먼저 3구 유리 슬라이드의 웰 하나에 인산완충생리식염수를 채운 다음, 이산화탄소로 초파리를 마취시킵니다. 초파리가 마취되면 핀셋을 사용하여 초파리 한 마리를 집어 PBS가 담긴 작은 접시에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 핀셋으로 주둥이를 잡고, 목 부분을 절단하여 몸체에서 머리를 분리합니다.두 번째 핀셋으로 파리 머리의 probos 부분을 잡고, 마이크로 가위를 사용하여 외측 정중면을 따라 머리를 절반으로 자릅니다. 뇌를 노출시키기 위해, 절단된 피펫 팁을 사용하여 머리를 들어 올려 retina에 부착시킨 후 Schneider medium이 채워진 다른 웰로 옮깁니다. 핀셋으로 머리 큐티클의 대부분을 벗겨낸 다음, 뇌를 분리합니다.망막이 층판과 각막 사이에 샌드위치처럼 유지되도록 합니다. 다음으로, 망막을 50 µL의 신선한 Schneider 배지가 담긴 방울로 옮깁니다. 유리 슬라이드 위에 직접 놓인 망막의 가장 등쪽(dorsal) 또는 배쪽(ventral) 끝부분을 마이크로 가위와 핀셋을 사용하여 잡습니다.망막의 배측-복측 중앙선을 따라 절반으로 절단하여 눈 중앙의 AMIA를 노출시킵니다. 각막이 아래를 향하고 엽(lamina)이 위를 향하도록 망막을 계속 잡습니다. 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 먼저 oia를 엽에서 분리한 다음, 각막에서 분리합니다.개별 OIA 및 OIA 그룹은 웰 또는 슬라이드 바닥에 모이게 됩니다. 계속 진행하기 전에 모여 있을 수 있는 더 큰 파편들을 제거하십시오. 오토파지를 분석하려면 LysoTracker를 Schneider 배지 한 방울에 1:1000 비율로 희석하고 10초 동안 기다리십시오.슬라이드에서 과잉 액체를 제거합니다. 이때 AMIA는 그대로 남도록 주의하십시오. AMIA를 덮을 수 있도록 vector shield를 한 방울 떨어뜨립니다.커버 글라스를 덮고 매니큐어로 밀봉한 후 공초점 현미경을 사용하여 관찰하면, atropin 돌연변이 형태를 발현하는 파리의 개별 테디움(tedium)에서 GFP-ATG8로 표지된 자가포식소체와 LysoTracker로 표지된 리소좀을 동시에 시각화할 수 있습니다. 우측 상단의 명시야 패널은 거의 온전한 테디움의 구조를 보여주며, 프레임은 스캔 영역을 나타냅니다. 여기서 빨간색은 리소좀을, 녹색은 자가포식소체를 나타냅니다.두 소기관의 융합으로 인해 생성된 오토리소좀(autolysosomes)은 노란색으로 나타납니다. 이 절차 이후에, 서로 다른 유전적 배경을 가진 신경세포의 오토파지 표지에 영향을 미치는 효과적인 화합물과 같이 다양한 질문에 답하기 위해 시료 배양 및 약물 투여와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.초파리 유전학의 장점과 세포 배양에서 가능한 고급 세포 생물학적 분석법을 결합합니다.

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곤충에서 oenocytes는 cuticular 탄화 수소 화합물을 생산합니다. 이러한 화합물은 건조로부터 보호하고 화학 커뮤니케이 션을 촉진한다. 여기 우리는 성인에서 oenocytes을 분리하는 데 사용되는 절개 기법을...

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster</em

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

여기에서는 패터닝 및 성장 결함을 정량화하기 위해 성인 초파리 눈의 고해상도 이미징을 위한 빠르고 저렴한 워크플로우를 제시합니다. 포인트 마운팅(point-mounting), 고해상도 이미지 획득(high-resolution image acquisition) 및 이미지 분석을 통한 시료 전처리를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

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단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

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