siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

다음 실험들의 전반적인 목표는 니트로셀룰로스 막을 사용하여 HIV-1 gp120 단백질에 대한 RNA Aptima를 in vitro에서 생성하는 것입니다. 이는 PCR과 그에 이은 in vitro T7 전사를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로 초기 DNA 및 무작위 RNA 라이브러리를 준비하기 위해, 표적 단백질과 RNA 라이브러리의 혼합물을 미리 적신 니트로셀룰로스 필터에 도포하여 결합되지 않은 RNA 종으로부터 결합된 RNA 분자를 분리합니다.

12회의 선택 사이클 후, 라이브러리에서 개별 RNA aptima 후보를 식별하기 위해 RNA 라이브러리를 클로닝하고 시퀀싱합니다. 겔 이동 분석(gel shift assay)과 공초점 현미경 분석을 바탕으로 나노몰(nanomolar) 수준의 친화력을 가진 여러 새로운 aptima를 식별한 결과를 얻습니다. 비드(beads)나 컬럼 기반 분리법과 같은 기존 측정법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 단순하며, 단백질을 비드에 고정시키는 것과 같이 단백질이나 라이브러리에 대한 전처리가 필요하지 않다는 점입니다. anti HIV GP120 RNA aptus 분리를 위한 RNA 라이브러리는 50개의 무작위 서열 뉴클레오타이드가 포함된 상업적으로 합성된 DNA 라이브러리로 준비합니다.

단일 가닥 DNA 올리고 라이브러리 서열의 길이는 81 nucleotides입니다. 이 도식에서 보시는 바와 같이, 랜덤 영역은 5' 말단의 30 tumor와 3' 말단의 16 MA라는 불변 영역으로 둘러싸여 있습니다. 불변 영역에는 인비트로(in vitro) 전사를 위한 T7 프로모터와 RT-PCR을 위한 3' 태그가 포함됩니다.

단일 가닥 DNA oligo random 라이브러리를 PCR로 증폭하며, 원래 DNA 라이브러리의 풍부도를 보존하기 위해 PCR 횟수를 10 사이클로 제한합니다. PCR 반응 후, 증폭된 이중 가닥 DNA 풀을 겔 정제 키트를 사용하여 회수합니다. 그 다음, 제조사의 지침에 따라 cript 키트를 사용하여 이중 가닥 DNA를 RNA 라이브러리로 전환합니다. 이때 리보핵산분해효소(ribonuclease)에 내성을 가진 RNA를 생성하기 위해, 전사 반응 혼합물 내의 CTP와 UTP를 두 플루오로 피리미딘(two fluoro pyrimidine) CTP 및 두 플루오로 피리미딘 UTP로 교체합니다.

전사 반응이 완료되면, DS one으로 반응액을 처리하여 템플릿 DNA를 제거하고 8% poly acrylamide, 7 M urea 젤을 사용하여 정제하십시오. 마지막으로, UV spectra phyto를 통해 정제된 RNA 라이브러리를 정량하십시오. optimas를 선택하기 전에 필요한 버퍼를 준비하여 적절한 온도에서 보관하십시오.

실온의 Heaps buffer와 -20 °C의 RNA refolding 및 RNA binding용 buffer를 준비합니다. 선택의 첫 번째 사이클을 시작하기 전에, 필터와의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 무작위 RNA pool을 미리 적신 니트로셀룰로오스 필터에 실온에서 30분 동안 처리합니다. 30분 후, 니트로셀룰로오스 필터를 제거합니다.

사전 제거(pre-cleared)된 무작위 RNA 풀과 HIV one bowel GP one 20 단백질을 저염 RNA 결합 버퍼(low salt RNA binding buffer)에 혼합하고, 회전 플랫폼에서 실온으로 30분 동안 배양합니다. 그다음, 반응물을 미리 적신 니트로셀룰로오스 필터에 통과시키고 1 mL의 저염 RNA 결합 버퍼로 세척하여 필터에서 결합된 RNA를 용출시킵니다. 필터 홀더에서 니트로셀룰로오스 막을 제거합니다.

멤브레인에 200 µL의 elu buffer를 첨가하고 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. RNA가 필터에서 용출되면 튜브를 짧게 원심 분리하여 RNA 용액을 새 튜브로 옮기고, 이를 이용하여 페놀 클로로포름 추출을 수행합니다. MicroCon YM 30 컬럼을 사용하여 RNA를 농축하고, 회수된 RNA를 20 µL의 RNase free water로 용출합니다.

회수된 RNA 풀은 역전사 및 전사 과정을 거친 후 15 사이클의 PCR로 증폭됩니다. 증폭된 이중 가닥 풀을 정제한 후, 다음 선택 라운드 이전에 이전 방식과 같이 새로운 RNA 풀로 전사합니다. 1배 HBS 버퍼에서 RNA 풀을 재폴딩하고 95 °C에서 3분 동안 가열한 다음, 37 °C까지 천천히 냉각합니다.

37 °C에서 10분 동안 배양을 계속합니다. 리폴딩된 RNA를 흡착시킨 후, 다음 선택 라운드에서 표적 HIV bowel GP one 20 단백질과 배양하기 전 30분 동안 니트로셀룰로오스 필터로 끌어내립니다. 더 높은 결합 친화력을 가진 aptamer를 성공적으로 얻기 위해서는 선택 조건을 조정하여 선택 엄격도를 세심하게 제어해야 합니다.

선택 조건은 이 표에 제시되어 있습니다. Cellex 1라운드부터 4라운드까지는, 사전 정제된 RNA 풀을 target protein과 함께 저염 RNA 결합 버퍼에서 30분 동안 배양하십시오. 4라운드 Cellex 이후에는, Cellex 과정이 진행됨에 따라 고염 RNA 결합 버퍼를 사용하십시오.

각 사이클에서 aptus 선택의 엄격성을 높이기 위해 GP120 단백질의 양을 줄이고 경쟁자 효모 tRNA의 양을 늘립니다. HIV-1 GP120 optima 선택의 진행 과정은 필터 결합 분석(filter binding assay)을 통해 모니터링합니다. 본 영상에서는 모든 선택 사이클 후에 수집된 12개의 RNA 풀을 분석합니다.

먼저, 각 RNA 풀을 송아지 장 인산가수분해효소(calf intestinal phosphatase)로 37 °C에서 1시간 동안 처리하여 시작 부분의 5' 삼인산을 제거합니다. T4 polynucleotide kinase와 P³² 80 p를 이용한 표지를 위해 CIP 처리된 RNA를 준비하려면, 95 °C에서 5분 동안 가열한 후 얼음 위에서 냉각합니다. RNA 표지는 방사성 물질을 사용하는 실험을 위해 설계된 핫룸(hot room)에서 PNK buffer, T4 Polynucleotide kinase, 1 µL의 gamma P³² ATP 및 물을 사용하여 최종 부피 20 µL가 되도록 수행합니다. 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 각 반응액에 20 µL의 물을 첨가하고 G 50 컬럼으로 정제합니다. 최종적으로 250 nM 농도로 리폴딩된 라벨링 RNA 40 µL를 얻으며, 각 라벨링 RNA 풀을 1배 HBS 버퍼에 넣고 95 °C에서 3분 동안 가열합니다. 그 후, 37 °C까지 냉각시키며, 이 과정은 30분에서 40분 정도 소요됩니다.

37 °C에서 10분 동안 배양을 계속합니다. RNA 풀의 리폴딩이 완료되면 100 µL 결합 반응을 수행합니다. 말단이 표지된 RNA 풀을 GP one 20 단백질 및 10배 몰 과량의 비특이적 경쟁자 TRNA와 함께 고염 RNA 결합 버퍼에 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분이 경과하면, 결합 반응액 50 µL를 미리 적신 니트로셀룰로오스 필터로 분리합니다. 그런 다음 필터를 결합 버퍼 2 mL로 세척하고, 다목적 신틸레이션 카운터를 사용하여 필터에 남아 있는 방사능을 측정하여 입력 대조군 수치로 기록합니다. 동시에 나머지 결합 반응액 50 µL를 처리하며, 각 선택 사이클 후 RNA 풀의 결합 분석은 경쟁 TRNA를 이용한 필터 결합 분석법으로 분석하여 HIV-1 GP120의 진행 상황을 모니터링하였습니다.

Optima의 선택 결합 활성은 여기에 표시된 것과 같이 단백질-RNA 복합체 형태로 필터에 잔류한 입력 RNA의 백분율로 계산되었습니다. 초기 RNA 풀은 입력 RNA의 0.1%만이 막에 잔류함을 보여줍니다. 그러나 9회의 선택 라운드 후, 9번째 RNA 라이브러리는 입력 RNA의 9.72%가 결합된 것으로 나타났습니다.

추가적인 선택 라운드를 수행하였으나, 더 이상의 농축이 관찰되지 않았으며 이는 RNA 풀의 최대 결합 상태에 도달했음을 시사합니다. RNA 풀의 결합 활성은 겔 이동 분석(gel shift assay)을 통해 추가로 확인되었습니다. 이러한 결과는 표적 단백질에 대해 높은 결합 특이성을 가진 일부 리간드들이 이 RNA 풀에서 연속적으로 농축되었음을 입증합니다.

본 예시에서는 12번째 라운드의 선택 이후 RNA 풀의 최대 결합능에 도달했으므로, 12번째 RNA 풀이 가장 높은 결합 활성을 보였습니다. 이 RNA 풀을 cDNA로 역전사한 후 PCR로 증폭하였습니다. 이후 PCR 산물을 정제하여 TA 클로닝 벡터에 클로닝하였으며, 140개의 클론을 정렬하여 서열을 분석하였습니다. 그 결과, 6개 그룹의 anti GP one 20 optimas가 확인되었습니다.

이 표에는 Aptima 코어 영역의 무작위 서열만 표시되어 있습니다. 클론의 약 40%가 보존된 서열을 포함하고 있습니다. 네이티브 겔 이동성 변화 분석(native gel mobility shift assay)을 통해 각 그룹 내에서의 상대적 풍부도를 바탕으로 각 그룹에서 하나의 대표 서열을 선정하여 추가 특성 분석을 수행했으며, 이러한 대표적인 앱타머들의 해리 상수 KD를 계산하였습니다(예: A1).

최적의 항체(aber)는 52 nanomolar의 겉보기 KD 값을 가집니다. 여기에 나타난 바와 같이, 선택된 항체들은 표적인 HIV-1 gp120에는 선택적으로 결합하지만, HIV-gp120 CM 단백질에는 결합하지 않습니다. 선택된 anti-gp120 optimas의 결합 및 내입화를 테스트하기 위해 HIV 외피 당단백질 gp160을 안정적으로 발현하는 CHO-gp160 세포가 사용되었습니다.

이 세포들은 엔벨로프 프로세싱에 필요한 gag 인코딩 프로테아제가 결핍되어 있어 GP160을 GP120과 GP41로 처리하지 못합니다. 유세포 분석 결과, S3로 표지된 압타머는 GP160을 발현하지 않는 대조군 CHO EE 세포가 아닌 CHO GP160 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났습니다. 또한, 실시간 살아있는 세포 Z-축 공초점 현미경 관찰 결과, 2시간의 배양 후 S3로 표지된 압타머가 CHO EE 대조군 세포가 아닌 CHO GP160 세포에 선택적으로 내입됨을 확인하였습니다. 압타머가 세포질 내에서 응집되는 것이 관찰되었으며, 이는 GP120 압타머가 수용체 매개 내포 작용을 통해 세포 내로 진입할 수 있음을 시사합니다.

마지막으로, 이 영상을 시청하신 후에는 현장 기반 측정법을 사용하여 RNA Abers를 분리하는 방법과 그 활용법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.