Name: siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 학습하세요 HIV-1 gp120을 표적으로 하는 고친합성 RNA aptamer를 니트로셀룰로스 필터 SELEX로 분리하는 방법을. gp120 발현 세포에 특이적 결합 및 내재화를 확인하고 aptamer-siRNA 키메라를 개발하여 표적 항HIV 치료제를 만듭니다.

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우리는 브리타 휸, Guihua 일, 해리스 Soifer 및 도움이 토론에 대한 리사 쉐러 감사합니다. CHO - EE 및 CHO - gp160 셀 :이 작품은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램, AIDS 학부, NIAID, NIH를 통해 얻은되었습니다 보건 AI29329 다음과 같은 시약을 JJR에게 수여 HL07470 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 라인, pNL4 - 3 륙 벡터, DAIDS, NIAID에서 HIV - 1 gp120 발.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
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<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R과 점프 온 제로는 &quot;HIV - 1 치료를위한 세포 유형 특정 aptamer - siRNA 전달 시스템&quot;에 출원 특허 있습니다. USPTO, 번호<strong&gt; 328,994분의 12</strong&gt; 발행일 : 2009년 6월 11일.

관내는 따라서 타겟 분자 8 매우 구체적이고 꽉 바인딩을 제공하고, 구체적이고 안정 입체 형태를 가정 핵산을 진화에 Aptamers 있습니다. 낮은 nanomolar 구속력 친화력과 목표를 aptamers의 절묘한 특이성은 생체내 이미징 및 치료제 9, 진단을 위해 다양한 도구를합니다. 타겟 siRNA 전달을위한 aptamer 기술의 도래와 함께 이제 siRNAs 10-12의 수용체 매개 endocytosis의에 대한 aptamer 바인딩 기능을 사용 가능합니다. 막 수용체에 대해 제기된 Aptamers는뿐만 아니라 약물의 불필요한 독성 부작용을 감소로 치료 효능을 향상시킬 수있는 세포 형태의 특정 방식으로 13에 뚜렷한 질병이나 조직을 대상으로 유망 배달 차량으로 등장했습니다. 지금까지 악성 세포의 특정 세포 유형이나 subpopul...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> MF - Millipore 막 필터 </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> 기공 크기는 0.45 μm의 </td></tr><tr><td> Swinnex 필터 홀더 </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13mm 직경 </td></tr><tr><td> QIAquick 겔 추출 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,706 </td><td> DNA 정화 </td></tr><tr><td> Microcon YM - 30 칼럼 </td><td> Millipore </td><td> 42,410 </td><td> RNA 농도 </td></tr><tr><td> 바이오 스핀 30 열 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 732-6250 </td><td> RNA 정화 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 DNA PCR 효소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> RT - PCR ThermoScript 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> T7의 전사 키트 DuraScribe </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> PCR을위한 dNTP </td><td> 로체 </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleic 산, E.coli에서 전송 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R1753 </td><td> tRNA의 경쟁 </td></tr><tr><td> HIV - 1 바 - L gp120 단백질 </td><td> 에이즈 연구 및 참조 시약 프로그램 </td><td> 4961 </td><td> 타겟 단백질 </td></tr><tr><td> 소음기의 siRNA 라벨 키트 - Cy3 </td><td> 앰비온 </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> 산성 페놀 / 클로로포름 1분의 5 솔루션 (산도 4.5) </td><td> 앰비온 </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> 클로로포름 / 이소프로판올 1분의 24 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> 카프 장 인산 가수 분해 효소 (CIP) </td><td> 뉴 잉글랜드 BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 폴리 뉴클레오 타이드 키나제 </td><td> 뉴 잉글랜드 BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> 로체 </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA 침전 </td></tr><tr><td> 감마 - P 32 - ATP </td><td> MP 바이오 메디컬 </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19시 1분 </td><td> 국립 진단 </td><td> EC - 850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> 국립 진단 </td><td> EC - 860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39; - Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> 암모늄 persulfate (APS) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L - methioine sulfoximine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M5379 - 250 MG </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 미디어 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 비카보네이트 솔루션, 7.5 % W / V </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> 최소 필수 중간 (멤) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> 멤이 아닌 필수 아미노산 (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 2.1 TA 클로닝 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040 - 01 </td><td></td></tr></tbody></table>

sirna 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 hiv gp120 aptamers의 개발

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

HIV 감염의 글로벌 전염병은 antiretroviral 대리인의 새로운 클래스를위한 긴급한 필요를 만들었습니다. 보완 RNA의 성적 표현을 억제하는 작은 간섭 (SI) RNAS의 강력한 기능은 HIV를 포함하여 질병의 다양한 치료제의 새로운 클래스로 악용되고있다. 많은 이전의 보고서 소설 RNAi 기반 anti-HIV/AIDS 치료 전략이 상당한 약속을하는 것으로 나타났습니다, 그러나, 성공적인 치료 응용 프로그램과 siRNAs의 임상 번역에 대한 주요 장애물은 효율적으로 전달됩니다. 특히, RNAi 기반 치료제의 안전성과 효능을 고려하여, 그것은 특정 세포 집단 또는 조직에 타겟 세포 siRNA 전달 방법을 개발하기 위해 매우 바람직합니다. HIV - 1 gp120 단백질, HIV - 1의 표면에 당단백질 봉투는 CD4 세포에 바이러스 항목에 중요한 역할을합니다. HIV - 1 항목을 촉발 요인과 세포 융합을 시작 것을 gp120과 CD4의 상호 작용은 약물 발견을위한 임상 관련 안티 바이러스 전략으로 검증되었습니다. 여기에, 우리는 첫째로 2&#39; - F 수정된 안티 HIV gp120 RNA의 aptamers의 선택과 신분증을 토론합니다. 종래의 nitrocellulose 필터 SELEX 방법을 사용 nanomolar 친화력과 함께 여러 가지 새로운 aptamers는 50 무작위 NT RNA 라이브러리에서 고립되었다. 성공적으로 높은 친화력과 바운드 종 얻기 위해서는, 선택의 엄중는 신중하게 조건을 조정하여 제어됩니다. 선택한 aptamers은 특별히 바인딩할 수 있고 빠르게 HIV - 1 봉투 단백질을 표현하는 세포로 internalized 수 있습니다. 또한, 혼자 aptamers는 HIV - 1 감염을 중화시킬 수 있습니다. 최고의 aptamer A - 1을 기반으로, 우리는 aptamer와 siRNA의 부분이 모두 강력한 항정 HIV 활동을 갖고있는 키메라 소설 이중 억제 기능을 방지 gp120 aptamer - siRNA를 만듭니다. 또한, 우리는 HIV - 1 감염 세포에 siRNA의 세포 유형 특정 배달 gp120 aptamer - siRNA의 chimeras를 활용. 키메라이 듀얼 기능은, 억제 HIV - 1 감염의 다양한 핵산 치료 요원 (aptamer와 siRNA) 결합 매우 적극적인 antiretroviral 치료 (HAART)을 실패한 환자에 대한 aptamer - siRNA의 chimeras에게 매력적인 치료 후보를 만들기위한 상당한 잠재력을 보여줍니다.

nanomole 친화력과 HIV - 1Ba - L gp120에 대한 몇 가지 2&#39; - 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립 아르<em&gt; 체외에서</em&gt; SELEX 절차. 키메라 새로운 듀얼 억제 기능을 방지 gp120 aptamer - siRNA가 생성되고 체계적 안티 HIV 치료를위한 상당한 약속을 보여줍니다.

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

HIV 감염의 전 세계적인 유행으로 인해 새로운 계열의 항레트로바이러스제에 대한 긴급한 필요성이 제기되었습니다. 소형 간섭...

다음 실험들의 전반적인 목표는 니트로셀룰로스 막을 사용하여 HIV-1 gp120 단백질에 대한 RNA Aptima를 in vitro에서 생성하는 것입니다. 이는 PCR과 그에 이은 in vitro T7 전사를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로 초기 DNA 및 무작위 RNA 라이브러리를 준비하기 위해, 표적 단백질과 RNA 라이브러리의 혼합물을 미리 적신 니트로셀룰로스 필터에 도포하여 결합되지 않은 RNA 종으로부터 결합된 RNA 분자를 분리합니다.12회의 선택 사이클 후, 라이브러리에서 개별 RNA aptima 후보를 식별하기 위해 RNA 라이브러리를 클로닝하고 시퀀싱합니다. 겔 이동 분석(gel shift assay)과 공초점 현미경 분석을 바탕으로 나노몰(nanomolar) 수준의 친화력을 가진 여러 새로운 aptima를 식별한 결과를 얻습니다. 비드(beads)나 컬럼 기반 분리법과 같은 기존 측정법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 단순하며, 단백질을 비드에 고정시키는 것과 같이 단백질이나 라이브러리에 대한 전처리가 필요하지 않다는 점입니다. anti HIV GP120 RNA aptus 분리를 위한 RNA 라이브러리는 50개의 무작위 서열 뉴클레오타이드가 포함된 상업적으로 합성된 DNA 라이브러리로 준비합니다.단일 가닥 DNA 올리고 라이브러리 서열의 길이는 81 nucleotides입니다. 이 도식에서 보시는 바와 같이, 랜덤 영역은 5' 말단의 30 tumor와 3' 말단의 16 MA라는 불변 영역으로 둘러싸여 있습니다. 불변 영역에는 인비트로(in vitro) 전사를 위한 T7 프로모터와 RT-PCR을 위한 3' 태그가 포함됩니다.단일 가닥 DNA oligo random 라이브러리를 PCR로 증폭하며, 원래 DNA 라이브러리의 풍부도를 보존하기 위해 PCR 횟수를 10 사이클로 제한합니다. PCR 반응 후, 증폭된 이중 가닥 DNA 풀을 겔 정제 키트를 사용하여 회수합니다. 그 다음, 제조사의 지침에 따라 cript 키트를 사용하여 이중 가닥 DNA를 RNA 라이브러리로 전환합니다. 이때 리보핵산분해효소(ribonuclease)에 내성을 가진 RNA를 생성하기 위해, 전사 반응 혼합물 내의 CTP와 UTP를 두 플루오로 피리미딘(two fluoro pyrimidine) CTP 및 두 플루오로 피리미딘 UTP로 교체합니다.전사 반응이 완료되면, DS one으로 반응액을 처리하여 템플릿 DNA를

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Glycan microarray를 개발 하 고 광범위 하 게 항 체를 중화 하는 HIV의 프로 파일링에 대 한 사용 설명 되는 산화 알루미늄 코팅 유리에 첨부 파일에 대 한 N-glycans의 합성에 모듈 접근 (ACG 슬라이드) 슬라이드.

N-glycans 배열 개발 및 HIV 항 체의 항 암 치료 효소 합성 프로 파일링

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

항체의 글리코실화 패턴은 그의 임상 성능을 결정하고, 따라서 글리코실화를 조절하기 위한 산업적 및 학문적 노력이 지속된다. 전형적인 글리코엔지니어링 캠페인은 시간과 노동 집약적이기 때문에, 일시적 침묵을 사용하여 글리코실화 유전자의 영향을 특성화하는 신속한 프로토콜의 생성은 유용할 것이다.

중국 햄스터 난소 세포의 신속한 항체 당공학

우리는 일반적으로 감염성 바이러스에만 결합하는 앱타머를 선택하고 소독 방법에 의해 비감염성이 된 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이것은 휴대용 및 신속한 테스트에서 감염성 상태를 결정할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

학습하세요 HIV-1 gp120을 표적으로 하는 고친합성 RNA aptamer를 니트로셀룰로스 필터 SELEX로 분리하는 방법을. gp120 발현 세포에 특이적 결합 및 내재화를 확인하고 aptamer-siRNA 키메라를 개발하여 표적 항HIV 치료제를 만듭니다.

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

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