사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

이 절차의 전반적인 목표는 뉴런 배아 중추 신경계에서 유전자 발현을 변경하는 것입니다. 이것은 먼저 시간이 정해진 임산부를 구하여 수술을 준비함으로써 달성됩니다. 그런 다음 복부 절개를 생성하여 자궁 뿔을 노출시킵니다.

배아가 노출되면 DNA가 외측심실, 제3심실 또는 망막하 공간으로 주입됩니다. 절차의 마지막 단계는 자궁벽을 통해 배아에 전류를 가하고, 양극이 바람직한 형질주입 부위 위에 배치되도록 패들 전극의 방향을 조정하는 것입니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사를 통해 tline kelon dying kelon 및 retina에서 신경 전구 세포의 증식, 이동 및 분화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

형질전환 마우스의 변성과 같은 이 기술 또는 기존 방법의 주요 장점은 빠르고, 더 높은 처리량의 연구가 가능하며, 비용이 저렴하다는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자가 신경 전구 세포를 조절하는지, 세포 증식, 세포 운명 사양, 신경 세포 분화 및 세포 이동과 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 중추신경계 발달을 이해하는 데 유용성을 넘어 인지 장애를 초래하고 인간의 행동 장애인 CNS 발달의 결함을 강조하는 유전 경로에 대한 더 나은 이해로 확장될 수 있습니다.

이 기술은 발달 중인 말초 신경계, 심장 및 태반과 같은 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 또한 병아리 및 xip과 같은 다른 모델 유기체뿐만 아니라 마우스의 질병 모델을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인의 성공을 가로막는 주요 장애물은 배아입니다.배아를 조작하고, 주입하고, 구멍을 뚫는 동안 생존 관리를 해야 합니다.

우리는 배아, 텔렌스팔론(telencephalon) 및 망막(retina)에서 유전자 발현을 조작하기 위한 빠른 수단이 필요했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 우리는 2001년 발달 생물학(Developmental Biology) 저널에 발표된 Sal이 처음 설명한 기술을 수정하여 실험실에서 이 기술을 개발했습니다. 우리는 또한 개발 중인 딜런에서도 이 프로토콜을 확립하기 위해 크래시 랩과 협력했습니다.

주입 및 전기천공법 단계는 배아에 대한 매우 신중한 조작이 필요하고 때때로 주입 부위가 매우 작을 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 예를 들어, 오늘 절차를 시연하는 망막하 공간은 Sherman's Laboratory의 박사후 연구원인 Rajiv가 모든 수술 도구를 세척하고 살균하기 시작할 것입니다. 다음으로, 주사기에 식염수와 젖수 링거 용액을 채우고 가열 패드에 올려 수술 부위를 따뜻하게 합니다.

70% 에탄올로 가열 패드를 살균한 다음 살균된 림프가 적은 거즈 패드로 덮습니다. 가열 패드를 섭씨 37도로 설정하십시오. 동물을 작은 마취실에 넣고 기화기를 통해 분당 1리터의 산소와 함께 불소 5%is를 전달하여 마취합니다.

소기 시스템을 사용하여 불소 배기 가스를 수집해야 합니다. 동물의 호흡이 깊고 규칙적이면 챔버에서 제거하십시오. 발가락을 꼬집고 눈 깜빡임 반사 신경을 사용하십시오.

완전한 마취를 보장합니다. 마취된 동물을 배에 눕히고 인공 호흡기 튜브를 사용하여 수술 중 불소 얼음 2.25%를 전달합니다. 체중 1kg당 0.1mg의 농도로 부프레노르핀을 목덜미에 피하

동물의 호흡을 계속 모니터링하고 필요한 경우 불소의 흐름을 조정합니다. 그런 다음 마취된 동물의 가슴을 테이프로 감고 뭉툭한 집게로 뒷발을 꼬집어 수축 반응을 다시 확인합니다. 멸균 면봉을 사용하여 복부에 드 크림을 두껍게 펴 발라 아래 털이 완전히 코팅되도록 합니다.

크림을 약 3분 동안 그대로 두고 간헐적으로 제모가 있는지 확인하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 멸균 거즈 패드에 멸균 물을 적셔 복부의 털을 닦아냅니다. 다음으로, 클로르헥시딘과 더 많은 물로 절개 부위를 살균합니다.

깨끗하고 멸균된 거즈로 복부를 말리십시오. 신선한 멸균 면 거즈를 사용하여 70% 에탄올로 이 단계를 반복합니다. 자궁 뿔을 드러내기 위해 수술복을 착용하여 수술을 준비합니다.

먼저 정중선에서 피부 아래의 희미한 선으로 선형 알바를 찾습니다 집게를 사용하여 복벽에서 피부를 당겨 구부러진 집게와 가위를 사용하여 피부 가위로 복부 중앙에서 아래쪽으로 작은 직선 절개를 자릅니다. 복막으로 이 과정을 반복합니다. 겸자로 복막을 잡습니다.

자궁을 당겨서 자궁을 통과시킬 수 있을 정도의 절개 부위를 자릅니다. 절개 부위에 작은 수직 슬릿이 있는 멸균 거즈를 놓고 따뜻한 멸균 식염수로 적십니다. 다음으로, 집게를 절개 부위에 밀어 넣고 집게로 절개 부위를 열고 있는 자궁을 찾습니다.

첫 번째와 두 번째 눈에 보이는 배아 사이의 자궁을 잡고 자궁 뿔의 양쪽을 거즈 위로 당깁니다. 흡수가 있는 배아 또는 작은 신체 크기를 가진 배아의 수를 세십시오. 정확한 DNA 주입 횟수를 준비하기 위해 자궁 뿔에 식염수를 적시고 자궁 뿔 하나를 조심스럽게 복부로 되돌려 놓습니다.

수술용 바늘을 싫어하려면 마우스피스가 부착된 위로 당겨진 피펫을 사용하여 밀리리터당 3밀리그램의 10마이크로리터를 끌어냅니다. 메틸 그린 염료를 함유한 내독소 무함유 DNA 용액으로 DNA를 수술용 바늘로 배출합니다. 첫 번째로 채워진 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다.

난소에 가장 가까운 배아부터 시작하여 인젝터에 부착된 상태로 서 있습니다. 원형 집게를 사용하여 배아가 앞쪽을 향하도록 decidua 내의 배아를 부드럽게 회전시켜 ROS 롤에서 코달 방향으로 주입할 수 있습니다. 광섬유 광원을 사용하여 배아 뇌의 정중선을 식별합니다.

주부 영역에서 측면의 큰 측면 심실에 주목하십시오. 구부러진 집게를 사용하여 배아를 제자리에 고정하고 뇌로 들어가는 각도가 약 45도가 되도록 채워진 수술 바늘을 자궁 위에 놓습니다. 빠르고 꾸준한 동작으로 마이크로 매니퓰레이터의 다이얼을 돌려 바늘 끝을 자궁벽을 통해 배아 뇌의 외측 심실에 삽입합니다.

그런 다음 마이크로 인젝터의 발판을 누릅니다. DNA 용액을 주입하기 위해 배아 뇌실 전체에 메틸 그린 염료를 펴 넣어 성공적인 주입을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이제 DNA가 주입되었으니, 바늘이 끊어지지 않도록 천천히 다시 당겨 제거한다.

주입된 배아를 멸균 거즈에 놓고 따뜻한 식염수로 충분히 적십니다. 원하는 형질 주입 부위 위에 놓인 패들 전극의 양극으로 자궁을 잡습니다. 그런 다음 초당 1펄스의 속도로 40-50V 및 50밀리초의 5개의 사각형 전기 펄스를 전달합니다.

주입된 전기 정격 배아를 보호용 습식 거즈로 덮고 다음 배아를 계속 주입합니다. 자궁 뿔에 원하는 모든 배아를 주입하고 전기 주입을 완료하면, 조심스럽게 배아를 체강 안으로 밀어 넣는다. 두 번째 자궁 뿔을 제거하여 나머지 배아의 주입 및 전기천공을 시작합니다.

모든 배아가 자궁 안으로 돌아오면 2-3ml의 따뜻한 식염수를 복강에 넣은 다음 복부에서 거즈를 제거하여 복막의 측면을 드러냅니다. 검은색 꼰 실크 라인을 사용하여 흉골에 가장 가까운 복막에 라인을 고정하고 앵커에서 스티치를 진행하여 복막을 봉합합니다. 모든 봉합사가 단단히 조여져 있고 아래 장기나 피부가 복막에 꿰매어지지 않았는지 확인하십시오.

나머지 봉합선을 자르고 버립니다. 피부 봉합 스테이플을 사용하여 집게로 봉합선 위로 피부를 당깁니다. 아래의 봉합사 라인을 스테이플러로 고정하거나 피부를 너무 세게 당기지 않도록 주의하면서 피부를 클립합니다.

일단 완성되면, 여기에서 봉합사 공구와 함께 부드럽게 눌러서 스테이플이 단단하다는 것을 확인하십시오, GFP의 표정을 몬 A-P-C-I-G 2 표정 벡터는 E 12에 발달 중인 neocortex로 전기공공되었습니다. 신피질 발달이 진행됨에 따라 정점 전구세포는 2차 기저 전구 또는 유사분열 후 뉴런으로 분화하고 GFP를 계속 발현합니다. 그런 다음 이러한 신경 세포를 분석하여 빨간색으로 표시된 신경 하위 유형의 전형적인 마커 발현을 분석할 수 있습니다.

E 12에서 전기천공되고 E 14에서 해부된 배아의 전뇌에 대한 이 venal view에서, 전기천공된 부위는 E 14에 의한 녹색 에피 형광으로 표시됩니다. GFP 표정은 시상, pre 시상 및 시상하부에서 죽어가는 lic 영토가 성공적으로 transfection되었다는 것을 나타내는 시상하부에서 보입니다. 대시 상자는 하나의 심실 영역을 통과하는 섹션의 위치를 표시합니다.

심실 영역을 자세히 살펴보면 GFP 세포가 심실 영역에서 맨틀 영역으로 이동하는 것을 볼 수 있습니다. 시상하부핵이 형성되는 곳에서, 배아 망막은 E 15.5에서 PCIC로 전기천공된 E 16.5 I를 통해 이 관상 단면에서 볼 수 있듯이 쉽게 전기천공됩니다. 여기서, m cherry 양성 세포의 축적은 외부 신경아세포층에 특이적이며 신경절 세포층에 있는 B rrn 3개의 B 양성 망막 신경절 세포에서는 볼 수 없습니다. 이 기술은 한 번 숙달되면 예상치 못한 합병증이 발생하지 않으면 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 적절한 멸균 기술을 사용하고, 배아를 조작할 때 꾸준한 손을 사용하고, 임산부를 마취하기 전에 필요한 모든 재료를 준비하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 전기 꼰 배아는 성인이 될 때까지 살 수 있으며, 이 시점에서 배아의 특정 유전자 조작이 성인의 신경 기능에 어떤 영향을 미치는지와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 행동 및 기능 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후 이 기술은 CNS 개발 분야의 연구자들이 생쥐의 생체 내 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 배아 신경관에 외부 DNA를 도입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 구체적으로, 임산부의 수술을 준비하는 방법을 보여준다. 자궁을 노출시키고 DNA를 주입하고 배아를 전해질로 합니다.

불소로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 소기 시스템과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.